荧光生物传感器和用于检测细胞信号转导事件的方法

本公开涉及荧光生物传感器及其使用方法。特别地，本文提供了遗传编码的荧光指示剂(gefi)，其包含环状排列荧光蛋白(circular-permuted fluorescent protein)(cpfp)和与cpfp结合的抑制性分子。在基础状态下，抑制性分子阻止环状排列荧光蛋白发出荧光。在构象变化和/或抑制性分子和cpfp之间的键断裂时，使得cpfp抑制解除，从而允许从cpfp发出荧光。本文所述的生物传感器可以用于检测多种细胞信号转导事件的方法中。

背景技术：

1、细胞信号转导和蛋白质-蛋白质相互作用(ppi)在生命系统中是必不可少的。由于它们的重要性，已经开发了许多工具来检测细胞信号转导事件。然而，仍然缺乏检测g蛋白偶联受体(gpcr)信号转导和蛋白酶切割事件的遗传编码方法。

技术实现思路

1、在一些方面，本文提供了遗传编码的荧光指示剂(gefi)。在一方面，本文提供了包含环状排列荧光蛋白(cpfp)和与cpfp结合的抑制性分子的gefi。在一些实施方式中，在基础状态下，抑制性分子抑制cpfp发出荧光。在一些实施方式中，在gefi的构象变化和/或cpfp与抑制性分子之间的键断裂时cpfp荧光抑制解除。

2、在一些实施方式中，与cpfp结合的抑制性分子是纳米抗体。例如，纳米抗体可以是nb39。在一些实施方式中，抑制性分子通过接头与cpfp结合。例如，抑制性分子可以通过接头lkedi(seq id no:4)与cpfp结合。

3、在一些实施方式中，cpfp与蛋白质结合。例如，cpfp可以与g蛋白偶联受体(gpcr)结合。在一些实施方式中，cpfp与gpcr的c末端结构域结合。在一些实施方式中，gpcr是阿片受体(opioid receptor)。例如，阿片受体可以是μ-阿片受体、κ-阿片受体、δ-阿片受体或嵌合阿片受体。例如，在一些实施方式中，阿片受体是包含seq id no:7、seq id no:11或seqid no:12的氨基酸序列的κ-阿片受体。作为另一实例，在一些实施方式中，阿片受体是包含seq id no:8的氨基酸序列的嵌合阿片受体。

4、在一些实施方式中，cpfp通过接头与蛋白质结合。例如，cpfp可以通过接头fplkmrmerqgap(seq id no:5)与蛋白质结合。作为另一实例，cpfp可以通过接头gap与蛋白质结合。

5、在一些实施方式中，gefi包括与seq id no:17具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括seq id no:17的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括与seq id no:21具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括seq id no:21的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括与seq id no:18具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括seq id no:18的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括与seq id no:27具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括seq id no:27的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括与seq id no:28具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括seq id no:28的氨基酸序列。

6、本文还提供了编码本文所述gefi的构建体。

7、在一些方面，本文提供了包含本文所述gefi的细胞。

8、在一些方面，本文提供了包含本文所述gefi的试剂盒。

9、在一些方面，本文所述的gefi、构建体、细胞或试剂盒可以用于检测蛋白酶活性、检测蛋白质-蛋白质相互作用或检测gpcr激动剂的方法中。

10、另一方面，本文提供了确定药剂是否为g蛋白偶联受体(gpcr)激动剂的方法。在一些实施方式中，方法包括提供包括遗传编码的荧光指示剂(gefi)的系统，其中，该gefi包括g蛋白偶联受体(gpcr)、环状排列荧光蛋白(cpfp)和抑制性分子。在一些实施方式中，gpcr的c末端结构域与cpfp结合，而cpfp与抑制性分子结合。该方法还包括向系统中加入剂，并在加入剂后检测荧光信号的存在或不存在。在一些实施方式中，在基础状态下，抑制性分子抑制cpfp发出荧光。在一些实施方式中，如果在加入剂后检测到荧光信号，则该剂被鉴定为gpcr激动剂。系统可以包括细胞。

11、在一些实施方式中，抑制性分子是纳米抗体。例如，纳米抗体可以是nb39。在一些实施方式中，抑制性分子通过接头与cpfp结合。例如，接头可以包括序列lkedi(seq id no:4)。

12、在一些实施方式中，gpcr是阿片受体。例如，阿片受体可以是μ-阿片受体、κ-阿片受体或嵌合阿片受体。

13、在一些实施方式中，cpfp通过接头与gpcr的c末端结合。在一些实施方式中，接头包括fplkmrmerqgap(seq id no:5)。在一些实施方式中，cpfp通过接头gap与蛋白质结合。

14、在一些实施方式中，gefi包括与seq id no:17具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括seq id no:17的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括与seq id no:21具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括seq id no:21的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括与seq id no:18具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括seq id no:18的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括与seq id no:27具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括seq id no:27的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括与seq id no:28具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方式中，gefi包括seq id no:28的氨基酸序列。

15、在一些方面，本文提供了评估样品中蛋白质-蛋白质相互作用的方法。在一些实施方式中，评估样品中蛋白质-蛋白质相互作用的方法包括将包括第一蛋白质的样品与遗传编码的荧光指示剂(gefi)接触。在一些实施方式中，gefi包括第二蛋白质、环状排列荧光蛋白(cpfp)和抑制性分子。cpfp可以是任何cpfp，其包括本文所述的cpgfp或cprfp。在一些实施方式中，第一蛋白质的c末端结构域与cpfp结合，而cpfp与抑制性分子结合。cpfp可以通过合适的接头(包括本文所述的接头)与第一蛋白质结合。例如，cpfp可以通过本文所述的蛋白质接头与第一蛋白质结合。在一些实施方式中，方法还包括检测样品中的荧光信号。在一些实施方式中，样品中可检测到的荧光信号表明第一蛋白质和第二蛋白质之间已经发生了蛋白质-蛋白质相互作用。在一些实施方式中，样品包括细胞。在一些实施方式中，第一蛋白质与由细胞表达的阿片受体结合。在一些实施方式中，方法还包括在检测样品中的荧光信号之前，将样品与阿片受体激动剂(opioid receptor agonist)接触。在一些实施方式中，当第一蛋白质和第二蛋白质之间已经发生了蛋白质-蛋白质相互作用时，阿片受体激动剂诱导gefi中的构象变化，从而观察到荧光信号。

16、在一些实施方式中，抑制性分子是纳米抗体。在一些实施方式中，纳米抗体包括nb39。在一些实施方式中，抑制性分子通过接头与cpfp结合。例如，接头可以包括序列lkedi(seq id no:4)。