建立UPLC-Orbitrap-MS方法检测人血浆中卡马西平浓度与流程

本发明涉及卡马西平的定量检测，具体为建立uplc-orbitrap-ms方法检测人血浆中卡马西平浓度。

背景技术：

1、卡马西平是癫痫治疗的首选药物，也是治疗三叉神经痛的一线用药。orbitrap是高性能的质量分析器，能够在静电场中捕获离子，实现高分辨率、高质量精度和高灵敏度的分析，超高效液相色谱-静电场轨道阱质谱(uplc-orbitrapms)具有高灵敏度、高选择性、高分辨率、高准确度的特点，样本需求量少且通量高，不仅适用于高端蛋白质组学、脂质组学的应用，也适用于各种生物样本的定量检测分析。

2、卡马西平的定量检测已经开发出高效液相色谱法(hplc)、气相色谱-质谱联用(gc-ms)、高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms/ms)、超高效液相色谱-质谱联用(uplc-ms/ms)、荧光免疫偏振(fpia)等多种方法，但其选择性及分辨率不及uplc-orbitrap-ms方法，uplc-orbitrapms方法具有更高的选择性和分辨率，样本量需求量少且通量高，适用于大通量的生物样本检测。

3、质谱作为检测手段通常使用同位素内标进行定量，对环境不友好，本法采用氯雷他定作为内标，环保且准确，为此，我们提出了建立uplc-orbitrap-ms方法检测人血浆中卡马西平浓度来解决上述问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了建立uplc-orbitrap-ms方法检测人血浆中卡马西平浓度，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：建立uplc-orbitrap-ms方法检测人血浆中卡马西平浓度，所述方法为采用超高液相色谱-orbitrap-质谱联用检测法，包括以下步骤：

3、s1、色谱条件：色谱柱：c18色谱柱；流动相：a相：0.1％甲酸-水溶液，b相：0.1％甲酸-乙腈溶液；流速:0.35ml·min-1；柱温：50℃；

4、s2、质谱条件：采用加热电喷雾离子源(hesi)，平行反应监测(prm)正离子模式；

5、s3、std-stock-20211012储备液配制：使用梅特勒-托利多xpr6ud5型百万分之一天平进行减量法称量，准确称量10.6440mg卡马西平对照品到标准品存储小瓶中，加入1330μl二甲基亚砜，涡旋混匀，得到8.00mg/ml的卡马西平储备液std-stock-20211012；

6、s4、标准曲线工作液溶液配制：移取50μl卡马西平储备液std-stock-20211012，加入950μl乙腈-水(50：50，v/v)将其稀释20倍，得到400.00μg/ml的卡马西平次级储备液std-substock；

7、s5、qc1-stock-20211012质控储备液配制：使用梅特勒-托利多xpr6ud5型百万分之一天平进行减量法称量，准确称量9.8295mg卡马西平对照品到标准品存储小瓶中，加入1228μl二甲基亚砜，涡旋混匀，得到8.00mg/ml的卡马西平储备液qc1-stock-20211012；

8、s6、质控工作液配制：移取50μl卡马西平储备液qc1-stock-20211012,加入950μl乙腈-水(50：50，v/v)将其稀释20倍，得到400.00μg/ml的次级卡马西平储备液qc-substock；

9、s7、氯雷他定储备液is-stock-20211012配制：使用梅特勒-托利多xpr6ud5型百万分之一天平进行减量法称量，准确称量13.1045mg氯雷他定对照品到标准品存储小瓶中，加入1636μl二甲基亚砜，制备氯雷他定储备液is-stock-20211012；

10、s8、次级氯雷他定储备液is-substock配制：移取50μl氯雷他定储备液is-stock-20211012，加入950μl乙腈将其稀释20倍，得到400.00μg/ml的次级氯雷他定储备液is-substock；

11、s9、沉淀剂is-1配制：移取100μl400.00μg/ml次级氯雷他定储备液is-substock，加入9.9ml乙腈稀释，得到10ml4000.00ng/ml的沉淀剂is-1；

12、s10、沉淀剂is-2配制：移取50μl400.00μg/ml次级卡马西平储备液is-substock,加入750μl乙腈稀释，得到25.00μg/ml溶液，移取100μl该25.00μg/ml溶液，得到50ml50.00ng/ml的沉淀剂is-2；

13、s11、标准曲线血浆样品配制：取上述“标准曲线工作溶液”5μl，加入95μl空白血浆，涡旋混匀；

14、s12、质控标准血浆样品配制：取上述“质控工作溶液”5μl，加入95μl空白血浆，涡旋混匀；

15、s13、空白血浆样品处理：取空白血浆20μl，加入400μl乙腈，涡旋30s混匀，12000g,4℃离心15min，取上清40μl，加入200μl0.1％甲酸水溶液稀释，涡旋混匀，2μl进样分析；

16、s14、零浓度血浆样品处理：取空白血浆20μl，加入400μl50.00ng/ml沉淀剂is-2，涡旋30s混匀，12000g,4℃离心15min，取上清40μl，加入200μl0.1％甲酸水溶液稀释，涡旋混匀，2μl进样分析；

17、s15、标准曲线标准血浆样品和质控标准血浆样品处理：按所述“标准曲线标准血浆样品配制”和“质控标准血浆样品配制”所述方法配制好的标准血浆样品20μl,加入400μl50.00ng/ml沉淀剂is-2，涡旋混匀，离心处理，取上清40μl，加入200μl0.1％甲酸水溶液稀释，涡旋混匀，2μl进样分析。

18、进一步优化本技术方案，所述步骤s1中洗脱条件：梯度洗脱(0→1.0min，b：0→25％；1.0→1.6min，b：25％→45％；1.6→2.8min，b：45％→95％；2.8→4.0min，b：95％→25％。

19、进一步优化本技术方案，所述步骤s2中喷雾电压为3800v，离子传输管温度为350℃，鞘气流速为45arb，辅助气流速为10arb。

20、进一步优化本技术方案，所述步骤s2中用于定量分析的离子对分别为237.10194→194.09622(卡马西平)，338.15137→337.10953(氯雷他定)。

21、进一步优化本技术方案，所述步骤s4中用乙腈-水(50：50，v/v)稀释该次级储备液，配制20000，10000，4000，2000，1000，400，200，100ng/ml卡马西平的标准曲线工作液溶液。

22、进一步优化本技术方案，所述步骤s6中再用乙腈-水(50：50，v/v)稀释该次级储备液，配制16000，8000，800，300，100ng/ml卡马西平的质控工作液溶液。

23、进一步优化本技术方案，所述步骤s7中向加入二甲基亚砜的标准品存储小瓶涡旋混匀，得到8.00mg/ml的氯雷他定储备液is-stock-20211012。

24、进一步优化本技术方案，所述步骤s10中向100μl该25.00μg/ml溶液，加入49.9ml乙腈稀释。

25、进一步优化本技术方案，所述步骤s15中涡旋30s混匀，在12000g,4℃下离心15min。

26、与现有技术相比，本发明提供了建立uplc-orbitrap-ms方法检测人血浆中卡马西平浓度，具备以下有益效果：

27、1、该建立uplc-orbitrap-ms方法检测人血浆中卡马西平浓度，本发明采用uplc-orbitrap-ms方法进行人血浆中卡马西平的浓度检测，用于实验室能力认证并取得满意结果，采用超高效液相色谱串联orbitrap质谱法，以orbitrap作为质量分析器，质谱仪为检测手段，集高效液相色谱的高分离能力、orbitrap的高灵敏度和高分辨率为一体，对卡马西平进行准确定量。

28、2、该建立uplc-orbitrap-ms方法检测人血浆中卡马西平浓度，本发明首次运用uplc-orbitrap-ms方法检测人血浆中卡马西平，本发明采用蛋白沉淀法对样本进行前处理，减少复杂的前处理步骤及试剂的使用及损耗，节省时间且环保高效，本发明选择0.1％甲酸-水溶液进行复溶，进一步提高了检测的准确度，本发明仅需2μl的进样量，可大程度节约样本及试剂。