一种检测农药中氰戊菊酯的胶体金试纸条及其应用的制作方法

本发明涉及一种检测农药中氰戊菊酯的试纸条及其应用，具体涉及一种用于检测农药中氰戊菊酯的胶体金试纸条，其特别适用于蔬菜、水果中氰戊菊酯残留的检测。

背景技术：

1、氰戊菊酯，是一种有机物，化学式为c25h22clno3，为黄色油状液体，不溶于水，是一种广谱、高效的杀虫剂，以触杀和胃毒作用为主，无内吸和熏蒸作用，对鳞翅目幼虫效果良好，对同翅目、直翅目、半翅目等害虫也有较好的效果，但对螨无效，广泛应用于棉花害虫、果树害虫、蔬菜害虫的防治。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，氰戊菊酯在3类致癌物清单中。gb 2763-2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中氰戊菊酯对不同蔬菜和水果中的最大残留限量也不同，分别在0.05mg/kg-10mg/kg之间。

2、检测氰戊菊酯的方法有气相色谱法、气相色谱法-串联质谱法、超高效液相色谱-质谱/质谱法、液相色谱-质谱/质谱法等。与上述方法相比，免疫化学检测法对药物检测具有快速、特异、灵敏、准确、可以批量监测、样品处理简单、能实现自动化操作等优点。而免疫化学法检测氰戊菊酯的前提是需要具备针对氰戊菊酯的抗体，本申请发明了氰戊菊酯人工抗原制备方法，并将其应用于快速检测试纸条中，用时短，操作简单，成本较低，适用于基层单位大批量地检测样品。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的氰戊菊酯残留检测试纸条。

2、本发明所提供的检测氰戊菊酯残留的试纸条，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)；所述反应膜上具有包被有氰戊菊酯半抗原-载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有氰戊菊酯单克隆抗体-胶体金标记物。

3、所述氰戊菊酯半抗原-载体蛋白偶联物是由氰戊菊酯半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

4、所述氰戊菊酯单克隆抗体是以氰戊菊酯半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，是由氰戊菊酯单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。

5、所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次粘贴在底板(7)上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。

6、所述底板可为pvc底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

7、本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：

8、1)制备喷涂有氰戊菊酯单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

9、2)制备具有包被有氰戊菊酯半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

10、3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

11、具体地说，步骤包括：

12、1)半抗原制备：经过一系列化学反应得到氰戊菊酯半抗原；

13、2)将氰戊菊酯半抗原与载体蛋白偶联，得到氰戊菊酯半抗原-载体蛋白偶联物；

14、3)用氰戊菊酯半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到氰戊菊酯单克隆杂交瘤细胞株；

15、4)提取小鼠igg免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

16、5)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

17、6)将步骤3)制备的氰戊菊酯单克隆抗体加入步骤5)制备的胶体金中，得到氰戊菊酯单克隆抗体-胶体金标记物；

18、7)将氰戊菊酯单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；

19、8)将氰戊菊酯半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线；

20、9)将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、ph为7.2、0.1mol/l磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

21、10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4～30℃条件下可保存12个月。

22、本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测蔬菜、水果中氰戊菊酯残留的方法，它包括步骤：

23、(1)用试纸条进行检测；

24、(2)分析检测结果。

25、本发明的氰戊菊酯快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及竞争抑制免疫层析分析技术，将氰戊菊酯单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的氰戊菊酯在流动过程中，与结合物释放垫上的氰戊菊酯单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成药物-抗体-胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的氰戊菊酯半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合氰戊菊酯单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中是否含有氰戊菊酯残留。

26、检测时，样品经处理后滴入试纸条孔内，当氰戊菊酯在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的氰戊菊酯半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(t)和质控线(c)内各出现一条红色条带；如果氰戊菊酯在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与氰戊菊酯全部结合，从而在t线处因为竞争反应不会与氰戊菊酯半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。

27、本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸条检测氰戊菊酯残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

技术特征：

1.一种检测氰戊菊酯的试纸条，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，其特征在于所述反应膜上具有包被有氰戊菊酯半抗原-载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有氰戊菊酯单克隆抗体-胶体金标记物，所述氰戊菊酯半抗原的制备方法如下：

2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次粘贴在底板(7)上。

3.如权利要求1-2任一项所述的试纸条，其特征在于所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。

4.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述氰戊菊酯半抗原-载体蛋白偶联物由氰戊菊酯半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

5.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述氰戊菊酯单克隆抗体是以氰戊菊酯半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。

6.一种制备权利要求1-5任一项所述试纸条的方法，其包括步骤：

7.一种检测蔬菜、水果中氰戊菊酯残留的方法，其包括步骤：

技术总结
本发明公开了一种检测氰戊菊酯的试纸条及其应用。试纸条包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，所述反应膜上具有包被有氰戊菊酯半抗原‑载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有氰戊菊酯单克隆抗体‑胶体金标记物。本发明还提供了一种应用上述氰戊菊酯试纸条检测蔬菜、水果中氰戊菊酯残留的方法。本发明所提供的试纸条具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。

技术研发人员：刘兴举
受保护的技术使用者：北京赛必达科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13