一种流感病毒疫苗血凝素含量测定方法及试剂盒与流程

本发明涉及生物，特别涉及一种流感病毒疫苗血凝素含量测定方法及试剂盒。

背景技术：

1、流感病毒的血凝素是刺激机体引起免疫保护作用的主要抗原，是评价流感疫苗效力高低的唯一标志。目前流感病毒疫苗血凝素测定通常采用的是单向免疫扩散（srid）法，该方法至今已沿用30余年。该方法将抗原参考品和供试品分别加至含有抗体参考品的琼脂糖凝胶板上，于20～25℃放置至少18个小时后进行浸泡、干燥、染色、脱色、干燥、测量。以抗原参考品形成的沉淀环的直径对其相应抗原浓度作直线回归，求得直线回归方程，代入供试品的沉淀环直径，即可得到供试品的血凝素含量。从理论上和实践上分析，srid法存在以下缺点：（1）检测灵敏度低：定量限为微克级，根据文献《四价流感病毒裂解疫苗血凝素含量检测方法的验证》提示，a1、a3、bv、by四个亚型中定量限最低值为2.89μg/ml；（2）检测通量低：供试品做复孔的前提下，小板（6×6cm）检测通量为4样次、大板（9×10cm）检测通量为17样次；（3）检测步骤繁琐：整个检测过程包括以下必备步骤：清洗玻璃板，制胶装置调平衡、配胶、倒板、打孔、挑孔、上样、浸泡、滤纸干燥、染色、脱色、烘箱干燥、测量；（4）耗时长：整个过程耗时约24h；（5）标准抗血清消耗量大：抗血清消耗量约200-350μl/小板（6×6cm），500-875μl/大板（9×10cm），一支标准抗血清（规格：2ml/瓶）仅能支持2-10次试验。除了常用的srid法，血凝素含量测定方法还有总蛋白测定结合sds-page扫描法、酶联免疫法。

2、现有技术中公开的总蛋白测定结合sds-page扫描法以还原性sds-page分离样品，以灰度扫描法确定ha蛋白百分比，结合样品总蛋白数值，计算样品中ha含量。从理论上分析，该方法干扰因素多，灰度扫描法的准确度低，检测误差较大，检测灵敏度低；此外还有双抗夹心法试剂盒：系由包被单克隆抗体的固相载体，辣根过氧化物酶标记的兔多克隆抗体、h7n9血凝素蛋白标准品、样品稀释液等试剂组成。但该试剂盒需要自行制备这两种抗体和血凝素蛋白标准品，仅仅适用于检测h7n9流感病毒血凝素蛋白，不利推广使用。另外，还有公开采用夹层免疫测定法，用与血凝素结合而不与抗体结合的凝集素和与该血凝素进行抗原抗体反应的抗血凝素抗体夹持该血凝素。具体是将经过预实验筛选得到的凝集素包被在固相上，加入经裂解后的含血凝素的样品进行反应，再与经过标记的抗血凝素抗体反应。该方法耗时在8.3小时以上，检测范围为1.95-125ngha/ml，对于新突变株的流感病毒，需要重新摸索适合的凝集素。因此目前亟需一种高灵敏度、高检测通量、耗时短、检测步骤简单、抗原血清消耗少的流感病毒疫苗血凝素含量测定方法。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种流感病毒疫苗血凝素含量测定方法及试剂盒，着力解决srid法的低灵敏度，低检测通量，耗时过长，检测步骤繁琐，抗原抗血清消耗大的缺点；解决总蛋白测定结合sds-page扫描法的干扰因素多，检测误差大的缺点；解决现有酶联免疫法检测时间长、需要进行预实验筛选凝集素的缺点。

2、本发明提供一种流感病毒疫苗血凝素含量测定方法，包括如下步骤：

3、s1：包被流感病毒的标准抗原/供试品，用包被液稀释标准抗原/供试品至适合血凝素浓度；使供试品血凝素浓度落在标准曲线血凝素浓度范围内，分别加入空白酶标板中；设置阴性对照和空白对照，所述阴性对照加入包被液；一起放置于37℃水浴；空白对照不加任何试液，仅在显色和终止步骤加入显色液和终止液。优选0.85%w/v氯化钠作为包被液，其次为磷酸盐缓冲液（ph7.4），相比碳酸盐缓冲液（ph9.6）的缓冲体系，更能给流感病毒血凝素（对ph值敏感）提供更理想的环境，保持其生理结构，可以避免碳酸盐缓冲液的高ph环境影响血凝素蛋白的理化性质，利于后续抗原抗体结合。

4、s2：洗板，用pbst（含0.1%v/v吐温20的磷酸盐缓冲液，ph=7.4）洗涤，弃液，拍干残留的pbst；

5、s3：封闭，用pbs（ph7.4）配制5%w/v脱脂奶粉；加入酶标板中，37℃水浴；

6、s4：洗板，用pbst洗涤，弃液，拍干残留的pbst；

7、s5：孵育标准抗血清，用抗体稀释液稀释标准抗血清，加入酶标板中，空白对照除外；酶标板固定在37℃恒温摇床中，孵育；

8、s6：洗板，用pbst洗涤，弃液，拍干残留的pbst；

9、s7：孵育酶标抗体，用抗体稀释液稀释酶标抗体，加入酶标板中，空白对照除外；酶标板固定在37℃恒温摇床中，孵育；

10、s8：洗板，用pbst洗涤，弃液，拍干残留的pbst；

11、s9：显色反应，酶标板每孔加入显色液，37℃避光水浴；

12、s10：终止反应，酶标板每孔加入终止液，轻轻震荡均匀。在30min内测定结果（设定酶标板双波长450 nm/630 nm测定）；

13、s11：计算，以标准抗原血凝素浓度的对数值和对应吸光度450/630nm的对数值作直线回归，得双对数回归方程：y=ax+b；则供试品的血凝素含量=n×10(y-b)/a，其中n为稀释倍数；供试品的血凝素含量单位为ng/ml；其中，y为对应吸光度450/630nm的对数值，x为标准抗原血凝素浓度的对数值，a为回归系数，b为截距；

14、其中，所述pbst为含0.1%v/v吐温20的磷酸盐缓冲液（ph7.4）。

15、采用恒温摇床对酶标板在抗血清和酶标抗体孵育过程中进行慢摇，可以使抗原抗体充分接触，并加速抗原抗体结合，提高抗原抗体结合率，缩短反应时间。

16、抗体稀释液加入吐温20和海藻糖，在吐温20的参与下减少非特异性结合，降低了实验误差，协同海藻糖提高抗原和抗体的特异性结合效率，从而降低检测结果的变异率。除了吐温20，其他具备温和去污作用、亲水性强的非离子型表面活性剂均可使用。

17、市面上的抗体稀释液主要内容物是脱脂奶粉、牛血清白蛋白（bsa）、酪蛋白、血清类等，很少使用人血白蛋白（alb）制备抗体稀释液。在本方法建立过程中发现alb作为抗体稀释液成分更有利于某些亚型血凝素含量测定，比bsa的效果好，结果显示bsa可能干扰抗原和抗体的特异性结合。

18、进一步的，所述s1中所述标准抗原血凝素浓度分别为：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 ng/ml。

19、进一步的，所述s5中标准抗血清的稀释倍数为500-5000倍，优选3000倍，s7中酶标抗体的稀释倍数为30000倍。本发明用棋盘滴定法摸索出抗血清和酶标抗体的最佳稀释度配比：不同亚型的抗血清均为3000倍稀释，酶标抗体30000倍稀释，避免使用浓度过高导致的非特异性吸附，避免浓度过低导致未完全结合供试品的血凝素。

20、进一步的，所述海藻糖可以替换为甘露醇、尿素、盐酸胍。

21、进一步的，所述流感病毒的亚型为ivr-215（h1n1）、ivr-224（h3n2）、ivr-228（h3n2）、bvr-26 (b victoria lineage)、bvr-11 (b victoria lineage)、b yamagatalineage中的任意一种，其他亚型流感病毒若有配套的标准抗原和标准抗血清也适用。

22、本发明还提供一种流感病毒疫苗血凝素含量测定试剂盒，包括如下组分：包被液、pbst、封闭液、通用酶标抗体、抗体稀释液、显色液、终止液；其中，所述包被液为0.85w/v%氯化钠溶液；所述pbst为含0.1%v/v吐温20的pbs（ph7.4）；所述抗体稀释液选自以下任意一种：①含0.5w/v% alb和0.5%w/v海藻糖的pbst，②含5%w/v脱脂奶粉和0.5%w/v海藻糖的pbst。

23、进一步的，所述封闭液为含5%脱脂奶粉的pbs（ph7.4）。

24、进一步的，所述通用酶标抗体为hrp偶联的兔抗绵羊igg h&l抗体或hrp偶联的驴抗绵羊igg h&l的酶标抗体，以及均能特异性结合各亚型血凝素的标准抗血清。

25、进一步的，所述试剂盒还包括流感病毒不同亚型的标准抗原和标准抗血清。

26、进一步的，所述流感病毒亚型为ivr-215（h1n1）、ivr-224（h3n2）、ivr-228（h3n2）、bvr-26 (b victoria lineage)、bvr-11 (b victoria lineage)、b yamagata lineage中的任意一种，其他亚型流感病毒若有配套的标准抗原和标准抗血清均适用。

27、综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

28、（1）本发明采用0.85% w/v氯化钠对标准抗原和供试品进行包被，相比碳酸盐缓冲液（ph9.6），更能给血凝素（对ph值敏感）提供更理想的环境，保持其生理结构，可以避免碳酸盐缓冲液的高ph环境影响血凝素蛋白的理化性质，利于后续实验中抗原和抗体的结合。

29、（2）本发明采用恒温摇床对酶标板在抗血清和酶标抗体孵育过程中进行慢摇，可以使抗原抗体充分接触，加速抗原抗体结合，提高抗原抗体结合效率，从而实现缩短反应时间的效果；

30、（3）本发明的抗体稀释液使用吐温20和海藻糖，在吐温20的参与下减少非特异性结合，降低了实验误差，协同海藻糖提高抗原和抗体的特异性结合效率，从而降低检测结果的变异率，可控制在5%以内。

31、（4）本发明使用alb制备抗体稀释液。alb作为抗体稀释液成分更有利于某些亚型血凝素含量测定，比bsa的效果好，bsa可能干扰抗原抗体的特异性结合。

32、（5）本发明选择了标准抗血清和酶标抗体的最佳稀释倍数。避免使用浓度过高导致非特异性吸附，避免浓度过低导致未完全结合供试品的血凝素。

33、（6）本发明的测定方法检测灵敏度高，可达1.562 ng/ml。

34、（7）本发明的测定方法检测通量大，样品重复两孔的前提下，一块酶标板的检测通量为42样次，与srid法（4-17样次）相比，大大提高了检测通量。

35、（8）本发明的测定方法步骤少，操作简单。

36、（9）本发明的测定方法耗时短，约5小时就能得出结果。

37、（10）本发明的测定方法标准抗血清消耗量少，每块酶标板仅需2μl原倍抗血清。

38、（11）当样品量较少时，本发明方法可以实现多个亚型的单价样品在同一块酶标板上检测。

39、（12）本发明的测定方法也可对未裂解的流感病毒颗粒进行检测。

40、（13）本发明的测定方法中用到的试剂均可从市面上购买获得，并且只要有相应的标准抗原和标准抗血清，该方法可以检测任何亚型的血凝素，易推广，适用范围大。