专利名称：H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及水禽的一种病毒抗体的快速诊断方法和器具，具体是H5亚型水禽流感病毒(AIV)血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒。
背景技术：
禽流感(avian influenza)，全称禽类流行性感冒病毒感染，是由正粘病毒科、流感病毒属的A型流感病毒引起禽类的一种从呼吸系统感染到败血症等多种症状的传染病，禽类感染后病死率很高。1878年，Perroncito在意大利首次发现禽流感。1900年其病原体首次被人发现，1955年才经血清学证实属A(甲)型流感病毒。此后禽流感病毒一直在世界各地家禽中普遍存在，并造成了程度不同的影响。特别是1997年香港爆发的禽流感已经对人类健康构成威胁。至此，禽流感问题引起了世界各地的广泛关注。目前已证明，只有H5和H7亚型可引起HPAl。禽流感在全球广泛分布，其主要的储存宿主是水禽和迁徙的鸟类。
由于A型流感病毒引起的禽流感，其病理变化因感染病毒毒株毒力的强弱、病程长短和禽种的不同而不同。其临床症状因感染禽的种类、年龄、性别、并发感染情况及所感染毒株的毒力和其他环境等不同而表现出的症状很不一致。鸡的流感病毒的抗体检测相继建立了鸡流感琼脂扩散(AGP)、血球凝集抑制试验(HI)、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)等血清学检测技术。然而，由于水禽的品种特殊性，其流感抗体的检测方法一直是困惑水禽疫苗免疫效果评估和水禽流感诊断的难题。因此，研制开发适用于水禽流感抗体检测的特异的、敏感的、生物安全度高的、适合于基层使用的诊断检测的器具，对水禽免疫水平进行实时监控和建立科学、灵活的水禽流感的免疫程序，以及对疫病的预防和控制有重要意义发明内容本发明的目的是提供一种H5亚型水禽流感病毒(AIV)血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒。
本发明的目的是这样实现的采用原核表达的水禽流感病毒血凝素蛋白(HA)作为抗原包被可拆96孔酶标板，以辣根过氧化物酶标记兔抗水禽IgG制备酶结合物工作液，以间接ELISA法直接检测标本中的AIV血凝素抗体。具体如下本发明的H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒内设有抗体检测板，酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，抗体检测板为包被水禽流感H5亚型血凝素蛋白(HA)的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记兔抗水禽IgG多克隆抗体，阳性对照为H5亚型水禽流感标准阳性血清，阴性对照为水禽标准阴性血清。
水禽流感H5亚型血凝素蛋白(HA)为利用原核高效表达系统表达和纯化的基因工程重组蛋白，可与水禽流感H5亚型血凝素抗体特异结合。它的制备为利用RT-PCR技术扩增水禽流感血凝素蛋白基因序列，将其亚克隆于pET28a原核表达载体构建pET/HA(H5)重组表达载体，pET/HA(H5)用氯化钙法转化大肠杆菌BL21(DE3)，大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后，表达的水禽流感病毒血凝素蛋白经商用Ni-NTA亲和层析柱获得纯化，纯化的蛋白用于H5亚型水禽流感病毒阳性血清检测。
抗体检测板的最佳制备条件为用pH8.5的0.05M Tris-HCl缓冲液作包被液，将水禽流感病毒血凝素蛋白稀释为8μg/ml，按100μl/孔加入聚苯乙烯微孔板中，37℃2小时，再4℃包被过夜，甩干，按100μl/孔加入含1％牛血清白蛋白(BSA)，PH7.4的磷酸盐缓冲液37℃封闭2小时，洗涤甩干，再加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时，置干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存。
酶结合物工作液的制备过程为(1)用超纯水配制辣根过氧化物酶(HRP，RZ≥3.0)溶液，加入0.06M过碘酸钠溶液4℃避光1小时，加入160mM乙二醇，室温反应30分钟，加入PH4.4的醋酸缓冲液2-8℃透析过夜，换液两次；(2)将纯化的兔抗水禽IgG加入上述活化的酶中，转移至透析袋，于0.05mM PH9.6的碳酸缓冲液中透析，4℃搅拌过夜，换液两次；(3)透析液吸至离心管中，加现配的0.05M硼氢化钠溶液，4℃反应2小时，加入等量的饱和硫酸铵溶液4℃放置30分钟，4℃4000rpm离心20分钟，弃上清，沥干，将沥干的沉淀溶于少量PBS，装入透析袋中，对0.02M PBS(PH7.4)透析，4℃过夜；(4)收集透析袋中液体，4000rpm离心20分钟，上清液即为辣根过氧化物酶标记的兔抗水禽IgG多克隆抗体，将其与等量甘油混和，-20℃冻存，以含0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.01％硫柳汞钠，pH7.4的磷酸缓冲液按1∶200-5000稀释冻存的辣根过氧化物酶标记的兔抗水禽IgG多克隆抗体作为酶结合物工作液。
本发明H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒中，样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液(pH7.4)；10×浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)；显色液A为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液，显色液B为含0.5‰过氧化氢尿素的柠檬酸—磷酸盐缓冲液；终止液为2M硫酸溶液；阳性对照为经H5亚型HA蛋白免疫获得的H5亚型水禽流感病毒标准阳性血清(OD450nm≥1.00)加入少量红色颜料并按1000U/ml加入青霉素和链霉素，无菌过滤；阴性对照为经筛选获得的水禽标准阴性血清(OD450nm≤0.150)，按1000U/ml加入青霉素和链霉素，无菌过滤。
本发明H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒，其检测程序为(1)将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；(2)将待检血清用样品稀释液作1∶100稀释，按100μl/孔加入抗体检测板中，同时设只加100μl样品稀释液的空白、水禽标准阴性血清作为阴性对照、H5亚型水禽标准阳性血清作为阳性对照，37℃孵育20-45分钟，甩干；(3)每孔加洗涤液200μl，洗涤6次，每次间隔1分钟，拍干；(4)每孔加100μl的酶结合物工作液，空白不加，37℃孵育20-45分钟，甩干；(5)每孔加洗涤液200μl，洗涤6次，每次间隔1分钟，拍干；(6)依次加50μl显色液A和50μl显色液B，37℃避光孵育5-15分钟；(7)加50μl终止液，用酶标仪在450nm波长下读取每孔光吸收值(OD450nm值)。
本发明H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒，其检测样本的判定标准为以待检样本OD450nm值与标准阴性OD450nm值的比值(P/N)，大于或等于2.2判为阳性，小于或等于1.7为阴性，介于1.7-2.2之间为可疑，须重检；重测时P/N值大于或等于2.0判为阳性，小于2.0为阴性。
本发明有益的积极效果是操作简单，人人都可操作，能较好满足不同层次人员的需要，如疫病监测、海关检疫、卫生防疫、集约化养殖到个体养殖等，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
本发明具有下列优点(1)特异性强，敏感性高，安全性好。H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒以基因工程表达的重组HA蛋白为基础制备而成；重组HA蛋白为非全病毒抗原、安全性好，不含无关杂蛋白，只与相应亚型水禽流感病毒阳性血清特异结合，不与水禽其它疫病阳性血清发生交叉反应。具有良好抗原性，因此具有很高的特异性和敏感性。
(2)操作简便快速。使用H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体检测试剂盒检测AIV血凝素抗体时，无需另配其它试剂，样品无需无菌处理，按试剂盒说明在1-2小时内即可判定检测结果。
(3)结果判定形象、准确、可靠。H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒以显色的深浅显示检测结果，即检测孔出现蓝色显色为阳性，中止后呈黄色，无色为阴性，结果判定形象。采用酶标仪机读数，减少主观性，准确可靠。
(4)成本低，投资少。H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒可批量检测，一步到位，成本低廉，投资少，见效快。
图1是H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒检测原理示意图，图中；1为酶标板，2为AIV/H5HA抗原，3为水禽AIV/H5抗体或待检血清，4为HRP标记兔抗水禽IgG多克隆抗体。
图2是重组AIV/H5HA蛋白的抗原活性鉴定结果，图中A为重组蛋白的SDS-PAGE分析，B为重组蛋白的Western Blot鉴定，M.为蛋白质Marker，1为大肠杆菌BL21(DE3)菌体蛋白，2为重组质粒未诱导菌体蛋白，3为重组质粒诱导4h表达产物，4为纯化的重组H5/HA融合蛋白，5为表达产物H5/HA蛋白的Westernblot具体实施方式
根据本发明的技术方案，具体制备如下(1)AIV/H5重组HA蛋白的制备利用RT-PCR技术从H5亚型水禽流感基因组中扩增部分血凝素蛋白基因序列(HA基因5’端1020bp的片段)(见图3)，将其插入到原核表达载体PET28a的下游构建PET-H5/HA表达载体，并用氯化钙法转化大肠杆菌BL21(DE3)，经1mM IPTG诱导表达，用超声波裂解细菌，利用商用的Ni-NTA亲和层析柱纯化表达的蛋白(HA)，获得水禽流感病毒部分血凝素蛋白(图2)，该蛋白保留了绝大部分血凝素蛋白的抗原性，可与水禽流感病毒相应亚型血凝素抗体特异结合(图2)。测定HA蛋白的蛋白浓度，用于间接ELISA检测试剂盒抗体检测板的制备。
(2)AIV/H5抗体检测板的制备用pH8.5的0.05M Tris-HCl缓冲液作包被液，将水禽流感病毒H5/HA蛋白稀释为8μg/ml，按100μl/孔加入可拆96孔酶标板，37℃2小时，再4℃包被过夜，用1％BSA 37℃封闭2小时，以含0.05％吐温-20的PBS(pH7.4)洗涤液充分洗涤，甩干。再加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时，置干燥室干燥后，用于H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒装配。
(3)兔抗水禽IgG多克隆抗体的制备采取水禽全血，分离血清，以辛酸-硫酸铵沉淀法粗提水禽IgG。再经Sephadex G200凝胶层析和DEAE纤维素离子交换层析进一步纯化，获得IgG纯品。将纯化的水禽IgG蛋白按600～1000μg/kg体重皮下和肌肉注射免疫健康兔4～5次，末次免疫一周后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1∶2000以上时，心脏采血或颈动脉放血，收集高免血清；以辛酸-硫酸铵沉淀法纯化兔抗水禽IgG抗体，不重述，再经DEAE纤维素离子交换层析纯化，收集浓缩兔抗水禽IgG多克隆抗体，用于制备H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体检测试剂盒酶结合物工作液。
(4)酶结合物工作液的制备用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物(HRP)酶偶联于兔抗水禽IgG多克隆抗体。用超纯水1ml溶解辣根过氧化物酶(HRP，RZ≥3.0)5mg溶液，加入1ml 0.0GM过碘酸钠溶液4℃避光1小时，加入1ml 160mM乙二醇，室温反应30分钟，加入PH4.4的醋酸缓冲液2-8℃透析过夜，换液两次。将10mg纯化的兔抗水禽IgG加入上述活化的酶中，转移至透析袋，于0.05mMPH9.6的碳酸缓冲液中透析，4℃搅拌过夜(换液两次)。透析液吸至离心管中，加入5mg/ml的0.05M硼氢化钠溶液0.4ml，4℃反应2小时。加入等量的饱和硫酸铵溶液，4℃30分钟，4℃4000转离心20分钟，弃上清，沥干。将沉淀溶于少量PBS，装入透析袋中，对0.02M PBS(PH7.4)透析，4℃过夜。将透析液中液体吸至离心管中，离心，将上清液吸出，加等量甘油，混匀，-20℃保存。再以含0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.01％硫柳汞钠的磷酸缓冲液(pH7.4)按1∶200-5000稀释冻存的标记酶作为酶结合物工作液。
(5)样品稀释液、洗涤液、终止液的配制样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液(KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，NaCl 8g，定容至1000ml，pH7.4，再加0.5ml吐温-20)；10×浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的0.1M磷酸盐缓冲液(KH2PO42g，Na2HPO4·12H2O 29g，NaCl 80g，定容至1000ml，pH7.4，再加5ml吐温-20)；终止液为2M硫酸溶液，即量取111.2ml浓硫酸(18M)稀释定容至1000ml。
(6)阳性对照和阴性对照的制备将用H5/HA蛋白免疫获得的H5亚型水禽流感病毒标准阳性血清用样品稀释液1∶100稀释(OD450nm≥1.00)加入少量红色颜料并按1000U/ml加入青霉素和链霉素，无菌过滤，作为H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒阳性对照；将筛选获得的水禽标准阴性血清用样品稀释液1∶100稀释(OD450nm≤0.150)，按1000U/ml加入青霉素和链霉素，无菌过滤，作为H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒阴性对照。
(7)显色液的配制称取200mg四甲基联苯胺(TMB)，用100ml无水乙醇或DMSO溶解后，以双蒸水定容至1000ml，配制显色液A；称取21g一水柠檬酸，28.2g无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)，6.4ml 0.75％过氧化氢尿素，双蒸水定容至1000ml，调pH值到4.5-5.0，配制显色液B。
(8)试剂盒检测操作程序其检测程序为1)将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；2)将待检血清用样品稀释液作1∶100稀释，按100μl/孔加入抗体检测板中，同时设空白(只加100μl样品稀释液)、阴性对照(水禽标准阴性血清)、阳性对照(H5亚型水禽标准阳性血清)，37℃孵育20-45分钟，甩干；3)每孔加洗涤液200μl，洗涤6次，每次间隔1分钟，拍干；4)每孔加100μl酶结合物工作液(空白不加)，37℃孵育20-45分钟，甩干；5)每孔加洗涤液200μl，洗涤6次，每次间隔1分钟，拍干；6)依次加50μl显色液A和50μl显色液B，混匀，37℃避光孵育5-15分钟；7)加50μl终止液，用酶标仪在450nm波长下读取每孔光吸收值(OD450nm值)。
(9)结果判定标准判定标准以待检样本OD450nm值与标准阴性OD450nm值比值(P/N)，大于或等于2.2判为阳性，小于或等于1.7为阴性。介于1.7-2.2之间为可疑，须重检，重测时P/N值大于或等于2.0判为阳性，小于2.0为阴性。如果阳性对照无明显显色反应，或阴性对照出现显色，表明试剂盒失效或检测操作有误，需重新检测。
AIV/H5重组HA蛋白制备的实施实例以下通过AIV/H5重组HA蛋白制备的实施实例进一步描述本发明的H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒。
1.寡核苷酸引物的设计与合成根据Genebank中AIV/H5亚型的HA基因序列，针对HA基因的ORF两端设计了5’端和3’端一对引物。5’端引物和3’端引物分别引入BamHI、Hind III酶切位点。合成以下两条引物5’端引物5’-GCGGATCCGGTTACCATGCAAACAACTC-3’3’端引物5’-GCAAGCTTTTACTGCCATCCTCCCTCTA-3’2.病毒的繁殖、纯化病毒经尿囊腔接种于9-11日龄SPF鸡胚，35℃温箱孵育，收集24h后鸡胚尿囊液，采用差速离心法纯化病毒，用TEN缓冲液重悬病毒，-40℃保存备用。
3.RT-PCR扩增目的基因片断采用Trizol reagent(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)提取病毒RNA，以此RNA为模板，5’端和3’端合成引物，用Reverse Transcription System kit反转录合成AIV/HA(H5)cDNA第一链；反转录产物在95℃1min、50℃45s、72℃1.5min环境下30个循环进行PCR，最后延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析。
4.测序载体的构建和序列测定用PCR产物纯化试剂盒回收目的片段，利用T-A克隆策略直接连接于PMD18-T vector，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选。挑取阳性克隆，分别进行PCR鉴定和酶切鉴定。DNA自动测序仪测定AIV/HA(H5)基因核苷酸序列。AIV/HA(H5)核苷酸及推导氨基酸序列见表1。
表1AIV/HA(H5)核苷酸及氨基酸序列(SEQ No.1)(1.核苷酸序列2.氨基酸序列)1 GGT TAC CAT GCA AAC AAC TCA ACA GAG CAG GTT GAC ACA ATA ATG GAA AAG AAC 542 G Y H A N N S T E Q V D T I M E K N 541 GTT ACT GTT ACA CAT GCC CAA GAC ATA CTG GAA AAG ACA CAC AAC GGG AAG CTC 1082 V T V T H A Q D I L E K T H N G K L 1081 TGC GAT CTA GAT GGA GTG AAG CCT CTA ATT TTG AGA GAT TGT AGT GTA GCT GGA 1622 C D L D G V K P L I L R D C S V A G 1621 TCA CTC CTC GGA AAT CCT ATG TGT GAC GAA TTC ATC AAT GTG CCG GAA TGG TCT 2162 S L L G N P M C D E F I N V P E W S 2161 TAC ATA GTG GAG AAG GCC AAT CCA GCC AAT GAC CTC TGT TAC CCA GGG GAT TTC 2702 Y I V E K A N P A N D L C Y P G D F 2701 AAC GAC TAT GAA GAA CTG AAA CAC CTA CTG AGC AGA ATA AAC CAT TTT GAG AAA 3242 N D Y E E L K H L L S R I N H F E K 3241 ATT CAG ATC ATC CCC AAA AGT TCT TGG TCC AAT CAT GAA GCC TCA TCA GGG GTG 3782 I Q I I P K S S W S N H E A S S G V 3781 AGC TCA GCA TGT CCA TAC AAT GGG AAG TCC TCC TTT TTC AGA AAT GTG GTA TGG 4322 S S A C P Y N G K S S F F R N V V W 4321 CTT ATC AAA AAG AAC AGT GCA TAC CCA ACA ATA AAG AGG AGC TAC AAT AAT ACC 4862 L I K K N S A Y P T I K R S Y N N T 4861 AAC CAA GAA GAT CTT TTG ATA CTG TGG GGG ATT CAC CAT CCT AAT GAT GCG GCA 5402 N Q E D L L I L W G I H H P N D A A 5401 GAA CAA ACA AAG CTC TAT CAA AAC CCA ACC ACC TAT ATT TCC GTT GGA ACA TCA 5942 E Q T K L Y Q N P T T Y I S V G T S 5941 ACA CTG AAC CAG AGA TTG GTC CCA AAA ATA GCT ACT AGA TCC AAA GTA AAC GGG 6482 T L N Q R L V P K I A T R S K V N G 6481 CAA AGT GGA AGA ATG GAG TTC TTC TGG ACA ATT TTA AAG CCG AAT GAT ACC ATC 7022 Q S G R M E F F W T I L K P N D T I 7021 AAT TTC GAG AGT AAT GGA AAT TTC ATT GCT CCA GAA TAT GCA TAC AAA ATT GTC 7562 N F E S N G N F I A P E Y A Y K I V 7561 AAG AAA GGG GAC TCA GCA ATT ATG AAA AGT GAA TTG GAA TAT GGT AAC TGC AAC 8102 K K G D S A I M K S E L E Y G N C N 8101 ACC AAG TGT CAA ACT CCA ATG GGG GCG ATA AAC TCT AGC ATG CCA TTC CAC AAC 8642 T K C Q T P M G A I N S S M P F H N 8641 ATA CAC CCT CTC ACC ATC GGG GAG TGC CCC AAA TAT GTG AAA TCA AAC AGA TTA 9182 I H P L T I G E C P K Y V K S N R L 9181 GTC CTT GCG ACT GGA CTC AGA AAC ACC CCT CAA AGA GAG AGA AGA AGA AAA AAG 9722 V L A T G L R N T P Q R E R R R K K 9721 AGA GGA CTA TTT GGA GCT ATA GCA GGT TTT ATA GAG GGA GGA TGG CAG 10202 R G L F G A I A G F I E G G W Q 10205.PET/HA(H5)表达载体构建、筛选及鉴定以PMD18/HA(H5)为模板在95℃1min、50℃45s、72℃1.5min环境下30个循环进行PCR，最后延伸10min。PCR产物电泳回收后，经BamH I、Hind III双酶切后，回收目的片段并克隆于表达质粒PET28a的BamH I+Hind III酶切窗口中，构建重组表达质粒PET/HA(H5)，转化宿主菌TOP10，提取重组质粒进行PCR、双酶切鉴定和序列测定。
6.重组PET/HA(H5)的表达经鉴定的重组质粒转入BL21(DE3)宿主菌，挑取单克隆接种到含有卡钠霉素LB培养基中，37℃培养过夜，按1∶100的比例将培养物接种于LB培养基中，250rpm震荡培养2小时左右，使OD600≈0.5，按1∶100的比例加入100mMIPTG诱导培养4小时，离心收集菌体。将菌体加入适量的1×SDS上样缓冲液，采用12％的SDS-PAGE鉴定，产物表达量可达10～15％。
7.重组血凝素蛋白的制备、分离纯化及鉴定经大肠杆菌菌株BL21(DE3)表达的血凝素主要以融合蛋白的形式存在，菌体经超声波破碎后，可以得到血凝素蛋白粗制品，进一步用QIAGEN公司的Ni-NTA蛋白纯化系统可以较快的得到血凝素蛋白纯品。并以AIV/H5亚型阳性血清为一抗做Western blot，结果可检测到表达的融合蛋白(如图2)。
按实施例中(2)方法步骤制备H5亚型AIV血凝素抗体检测板，按实施例中(3)(4)方法步骤制备抗体检测试剂盒酶结合物工作液，按实施例中(5)方法步骤制备样品稀释液、洗涤液、终止液，按实施例中(6)方法步骤制备抗体检测试剂盒阳性对照和阴性对照，按实施例中(7)方法步骤制备显色液A、显色液B，最后，将各种组成成份装配成H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体检测试剂盒。
使用H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒检测水禽AIV血凝素抗体或抗体水平时，将采集分离的水禽血清，用样品稀释液作1∶100或梯度稀释，制备待检样品溶液或梯度稀释样品溶液，将待检样品、阳性和阴性对照分别加入抗原检测板，按实施例中(8)中操作程序，室温作用30分钟，洗涤液洗涤，加酶结合物工作液，室温作用30分钟，同上洗涤，加入显色液A，显色液B各50μl，室温避光显色5min，滴加终止液50μl终止显色反应，酶标仪检测OD450nm值。按实施例中(9)中的判定标准判定结果。检测孔OD450nm值与标准阴性对照OD450nm值比值(P/N)大于或等于2.2判为阳性。对于梯度稀释样品则检测孔为阳性的样品最高稀释度为该待检血清的血凝素抗体滴度。如果AIV阳性对照无明显显色反应，或阴性对照出现显色，表明试剂盒失效或检测操作有误，需重新检测。
权利要求
1.一种H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒，试剂盒内设有抗体检测板，酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，其特征在于抗体检测板为包被水禽流感H5亚型血凝素蛋白(HA)的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记兔抗水禽IgG多克隆抗体，阳性对照为H5亚型水禽流感标准阳性血清，阴性对照为水禽标准阴性血清。
2.根据权利要求1所述的一种H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所说水禽流感H5亚型血凝素蛋白(HA)为利用原核高效表达系统表达和纯化的基因工程重组蛋白，可与水禽流感H5亚型血凝素抗体特异结合。
3.根据权利要求1所述的一种H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所说的水禽流感H5亚型血凝素蛋白的制备为利用RT-PCR技术扩增水禽流感血凝素蛋白基因序列，将其亚克隆于pET28a原核表达载体构建pET/HA(H5)重组表达载体，pET/HA(H5)用氯化钙法转化大肠杆菌BL21(DE3)，大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后，表达的水禽流感病毒血凝素蛋白经商用Ni-NTA亲和层析柱获得纯化，纯化的蛋白用于H5亚型水禽流感病毒阳性血清检测。
4.根据权利要求1所述的一种H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所说的抗体检测板的最佳制备条件为，用pH8.5的0.05M Tris-HCl缓冲液作包被液，将水禽流感病毒血凝素蛋白稀释为8μg/ml，按100μl/孔加入聚苯乙烯微孔板中，37℃2小时，再4℃包被过夜，甩干，按100μl/孔加入含1％牛血清白蛋白(BSA)，PH7.4的磷酸盐缓冲液37℃封闭2小时，洗涤甩干，再加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时，置干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存。
5.根据权利要求1所述的一种H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所说的酶结合物工作液的制备过程为(1)用超纯水配制辣根过氧化物酶(HRP，RZ≥3.0)溶液，加入0.06M过碘酸钠溶液4℃避光1小时，加入160mM乙二醇，室温反应30分钟，加入PH4.4的醋酸缓冲液2-8℃透析过夜，换液两次；(2)将纯化的兔抗水禽IgG加入上述活化的酶中，转移至透析袋，于0.05mM PH9.6的碳酸缓冲液中透析，4℃搅拌过夜，换液两次；(3)透析液吸至离心管中，加现配的0.05M硼氢化钠溶液，4℃反应2小时，加入等量的饱和硫酸铵溶液4℃放置30分钟，4℃4000rpm离心20分钟，弃上清，沥干，将沥干的沉淀溶于少量PBS，装入透析袋中，对0.02M PBS(PH7.4)透析，4℃过夜；(4)收集透析袋中液体，4000rpm离心20分钟，上清液即为辣根过氧化物酶标记的兔抗水禽IgG多克隆抗体，将其与等量甘油混和，-20℃冻存，以含0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.01％硫柳汞钠，pH7.4的磷酸缓冲液按1∶200-5000稀释冻存的辣根过氧化物酶标记的兔抗
6.根据权利要求1所述的一种H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所说的样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液(pH7.4)；10×浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)；显色液A为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液，显色液B为含0.5‰过氧化氢尿素的柠檬酸—磷酸盐缓冲液；终止液为2M硫酸溶液。
7.根据权利要求1所述的一种H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所说的阳性对照为经H5亚型HA蛋白免疫获得的H5亚型水禽流感病毒标准阳性血清(OD450nm≥1.00)加入少量红色颜料并按1000U/ml加入青霉素和链霉素，无菌过滤；阴性对照为经筛选获得的水禽标准阴性血清(OD450nm≤0.150)，按1000U/ml加入青霉素和链霉素，无菌过滤。
8.根据权利要求1所述的一种H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒，其检测程序为(1)将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；(2)将待检血清用样品稀释液作1∶100稀释，按100μl/孔加入抗体检测板中，同时设只加100μl样品稀释液的空白、水禽标准阴性血清作为阴性对照、H5亚型水禽标准阳性血清作为阳性对照，37℃孵育20-45分钟，甩干；(3)每孔加洗涤液200μl，洗涤6次，每次间隔1分钟，拍干；(4)每孔加100μl的酶结合物工作液，空白不加，37℃孵育20-45分钟，甩干；(5)每孔加洗涤液200μl，洗涤6次，每次间隔1分钟，拍干；(6)依次加50μl显色液A和50μl显色液B，37℃避光孵育5-15分钟；(7)加50μl终止液，用酶标仪在450nm波长下读取每孔光吸收值(OD450nm值)。
9.根据权利要求1所述的一种H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒，其检测样本的判定标准为以待检样本OD450nm值与标准阴性OD450nm值的比值(P/N)，大于或等于2.2判为阳性，小于或等于1.7为阴性，介于1.7-2.2之间为可疑，须重检；重测时P/N值大于或等于2.0判为阳性，小于2.0为阴性。
全文摘要
本发明公开了一种H5亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒。试剂盒内设有抗体检测板，酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，该试剂盒的检测板为包被水禽流感H5亚型血凝素蛋白(HA)的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为HRP标记兔抗水禽IgG多克隆抗体，阳性对照为H5亚型水禽流感标准阳性血清，阴性对照为水禽标准阴性血清。本发明有益的积极效果是检测试剂盒对水禽的特异性强、敏感性高、操作简单，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景。
文档编号G01N33/531GK1743848SQ20051004976
公开日2006年3月8日 申请日期2005年5月9日 优先权日2005年5月9日
发明者周继勇, 陈洪勋, 申会刚 申请人:浙江大学