一种消旋山莨菪碱片中6β-羟基托品醇的检测方法与流程

本技术涉及分析化学，尤其是涉及一种消旋山莨菪碱片中6β-羟基托品醇的检测方法。

背景技术：

1、消旋山莨菪碱(raceanisodamine)，为我国特产茄科植物山莨菪碱中提取的一种生物碱，采用人工合成方法制得的产品，又名654-2。消旋山莨菪碱片具有外周抗m胆碱受体作用，能解除乙酰胆碱所致的平滑肌痉挛，对胃肠道平滑肌也有松弛作用，并抑制胃肠道平滑肌蠕动，能解除微血管痉挛，改善微循环。临床主要用于解除平滑肌痉挛、胃肠绞痛、胆道痉挛以及有机磷中毒等。

2、目前，消旋山莨菪碱片收录于《中国药典》2020年版，其有关物质主要控制消旋山莨菪碱杂质i(阿托酸6β-羟基-3α-托品酯)，对于其合成及降解过程中产生的其他杂质相关分析方法的报道很少。6β-羟基托品醇既是消旋山莨菪碱的合成原料，也是降解产物，但是目前没有相关技术报道6β-羟基托品醇的检测方法。

3、从消旋山莨菪碱的降解原理分析，在产生6β-羟基托品醇杂质的同时应有相同摩尔当量的托品酸生成，但由于6β-羟基托品醇无紫外吸收，单从控制单一成分托品酸不足以反映6β-羟基托品醇的含量，故该化合物的质量控制对消旋山莨菪碱及其制剂的制备起到重要的作用。因此，开发一种高效且精确的分析方法，对消旋山莨菪碱片中的6β-羟基托品醇进行质量分析，对后续消旋山莨菪碱片质量控制有着极其重要的意义。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本技术提供一种消旋山莨菪碱片中6β-羟基托品醇的检测方法，该方法能够对消旋山莨菪碱片中的6β-羟基托品醇进行准确检测，结果稳定可靠，且操作简单，对于实现消旋山莨菪碱片质量控制具有极其重要的意义。

2、为此，本技术第一方面提供了一种消旋山莨菪碱片中6β-羟基托品醇的检测方法，所述方法采用hplc-cad法进行检测，检测步骤包括：将供试品溶液进样至色谱柱中，然后采用流动相对所述色谱柱进行梯度洗脱，洗脱液进入电喷雾检测器中进行检测，获得检测结果；所述流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为醋酸铵缓冲溶液，所述流动相b为乙腈。

3、消旋山莨菪碱片中的6β-羟基托品醇，是消旋山莨菪碱的合成原料，同时也是降解产物，其化学式为c8h15no2，结构式如式ⅰ所示：

4、

5、本技术所述方法在检测过程中，先将消旋山莨菪碱片的供试品溶液进样至高效液相色谱柱中，然后采用特定的流动相对色谱柱中的供试品溶液进行梯度洗脱，使供试品溶液中的所有成分进行有效分离，洗脱后的洗脱液可以直接进入到电喷雾检测器中进行检测，若供试品溶液中含有6β-羟基托品醇，检测后的色谱图会在其相应的保留时间位置出峰，根据峰面积即可计算出供试品溶液中6β-羟基托品醇的含量。本技术所述方法可以有效地检测消旋山莨菪碱片中6β-羟基托品醇含量，且该方法具有良好的专属性、准确度、精密度和耐用性等，操作简单，结果稳定可靠。由于6β-羟基托品醇无紫外吸收，若是不控制，有可能引入消旋山莨菪碱片成品中，影响其整体含量，因此本技术所述方法对于实现消旋山莨菪碱片的质量控制具有极其重要的意义。

6、本技术所述方法检测过程中采用的流动相包括特定的流动相a(醋酸铵缓冲溶液)和特定的流动相b(乙腈)，采用上述组成的流动相能够对供试品溶液中的成分进行有效分离，使检测结果的出峰效果好，进而提高检测结果的准确性和稳定性。

7、在一些实施方式中，所述醋酸铵缓冲溶液中醋酸铵的浓度为(4～6)mmol/l；和/或所述醋酸铵缓冲溶液的ph值为4.8～5.2。

8、在一些优选的实施方式中，所述醋酸铵缓冲溶液中醋酸铵的浓度为5mmol/l；和/或所述醋酸铵缓冲溶液的ph值为5.0。

9、本技术通过将醋酸铵缓冲溶液中醋酸铵的浓度和ph值控制在上述范围内，能够进一步提高分离效果。

10、在一些实施方式中，所述色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶颗粒，所述十八烷基硅烷键合硅胶颗粒的粒径为2～5μm。

11、在一些优选的实施方式中，所述十八烷基硅烷键合硅胶颗粒的粒径为3μm。

12、本技术通过采用上述粒径范围内的十八烷基硅烷键合硅胶颗粒作为填充剂，能使对供试品溶液中所有成分的分离效率和分离效果更佳。

13、在一些实施方式中，所述色谱柱的柱温为25～35℃；和/或所述电喷雾检测器的蒸发器温度为35～40℃。

14、在一些优选的实施方式中，所述色谱柱的柱温为30℃；和/或所述电喷雾检测器的蒸发器温度为35℃。

15、在一些实施方式中，所述流动相进行梯度洗脱的流速为0.5～0.7ml/min；所述梯度洗脱设置如下：

16、0～2min：95～100％a，5～0％b；

17、2～15min：95～100％a，5～0％b→85～95％a，15～5％b；

18、15～15.1min：85～95％a，15～5％b→45～55％a，55～45％b；

19、15.1～25min：45～55％a，55～45％b；

20、25～25.1min：45～55％a，55～45％b→95～100％a，5～0％b；

21、25.1～35min：95～100％a，5～0％b。

22、梯度洗脱的参数设置具体如表1所示：

23、表1

24、

25、在一些优选的实施方式中，所述流动相进行梯度洗脱的流速为0.6ml/min；所述梯度洗脱设置如下：

26、0～2min：100％a，0％b；

27、2～15min：100％a，0％b→90％a，10％b；

28、15～15.1min：90％a，10％b→50％a，50％b；

29、15.1～25min：50％a，50％b；

30、25～25.1min：50％a，50％b→100％a，0％b；

31、25.1～35min：100％a，0％b。

32、梯度洗脱的原理：流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k，并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。本技术通过采用醋酸铵缓冲溶液和乙腈作为流动相，在上述梯度洗脱流速和梯度洗脱程序设置条件下，能够使供试品溶液中的所有组分的分离效率和分离效果最佳，提升柱效和检测结果的准确性。

33、在一些实施方式中，所述供试品溶液中消旋山莨菪碱片的浓度为1.4～1.6mg/ml，所述供试品溶液的进样量为45～55μl。

34、在一些优选的实施方式中，所述供试品溶液中消旋山莨菪碱片的浓度为1.5mg/ml，所述供试品溶液的进样量为50μl。

35、本技术通过将供试品溶液中消旋山莨菪碱片的浓度以及供试品溶液的进样量控制在上述范围内，既能保证检测后的色谱图出峰明显，又能节省检测原料并提升检测效率。

36、在一些实施方式中，所述供试品溶液的制备方法包括：将消旋山莨菪碱片研碎后与乙醇混合并进行提取，对提取后的混合液进行过滤，获得过滤液；将所述过滤液与0.05～0.15mol/l的盐酸溶液混合后制得所述供试品溶液。

37、由于消旋山莨菪碱片制备时所添加的辅料中的蔗糖与6β-羟基托品醇的保留时间相近，因此为了避免检测时消旋山莨菪碱片中的蔗糖对检测结果的干扰，本技术在制备供试品溶液时，先将研碎后的消旋山莨菪碱片与乙醇混合后进行提取，以尽可能去除消旋山莨菪碱片辅料中的大部分蔗糖，减少对目标成分(即6β-羟基托品醇)的检测干扰。后续将乙醇提取后的过滤液与0.05～0.15mol/l的盐酸溶液混合以制备供试品溶液的原因在于：本技术中的消旋山莨菪碱片在酸性条件下更易溶解，以保证制得的供试品溶液具有较好的稳定性，并最终提高检测结果的精密度和准确性。

38、本技术中，所述盐酸溶液中盐酸的浓度优选为0.1mol/l，以使制得的供试品溶液的稳定性更佳。

39、在一些实施方式中，所述乙醇与盐酸溶液的体积比为1:(3～5)。在一些优选的实施方式中，所述乙醇与盐酸溶液的体积比为1:4，此时制备供试品溶液的稀释剂为0.1mol/l的盐酸溶液-乙醇(80:20)的混合液。

40、在一些实施方式中，所述方法的检测步骤还包括：配制系列浓度的6β-羟基托品醇的线性对照溶液，利用所述系列浓度的6β-羟基托品醇的线性对照溶液建立6β-羟基托品醇浓度-峰面积的标准曲线，以对供试品溶液中的6β-羟基托品醇进行定量检测。

41、本技术中，所述标准曲线的具体建立过程例如为：采用与供试品溶液相同的检测步骤和条件对配制的系列已知浓度的6β-羟基托品醇的线性对照溶液分别进行检测，获得不同浓度下6β-羟基托品醇的峰面积，进而建立6β-羟基托品醇浓度-峰面积的标准曲线；然后根据供试品溶液检测后获得的色谱图中6β-羟基托品醇的峰面积，即可对供试品溶液中的6β-羟基托品醇进行定量检测。

42、在一些实施方式中，所述系列浓度的6β-羟基托品醇的线性对照溶液中6β-羟基托品醇的浓度为1.5～15μg/ml。

43、在一些具体实施方式中，所述系列浓度的6β-羟基托品醇的线性对照溶液包括：1.5μg/ml的6β-羟基托品醇的线性对照溶液、4.5μg/ml的6β-羟基托品醇的线性对照溶液、7.5μg/ml的6β-羟基托品醇的线性对照溶液、12μg/ml的6β-羟基托品醇的线性对照溶液和15μg/ml的6β-羟基托品醇的线性对照溶液。

44、本技术通过采用上述浓度范围内的6β-羟基托品醇的线性对照溶液，能使建立的6β-羟基托品醇浓度-峰面积的标准曲线的线性关系较好。

45、本技术中6β-羟基托品醇的线性对照溶液的制备时采用的稀释剂与供试品溶液相同，同样优选为0.1mol/l的盐酸溶液-乙醇(80:20)的混合液，使供试品溶液和6β-羟基托品醇的线性对照溶液在尽可能相同的条件下进行检测，以尽可能排除其他因素干扰。

46、本技术的有益技术效果为：本技术提供的消旋山莨菪碱片中6β-羟基托品醇的检测方法，能够有效地检测消旋山莨菪碱片中6β-羟基托品醇的含量，且该方法具有良好的专属性、准确度、精密度和耐用性等，操作简单，结果稳定可靠。本技术中消旋山莨菪碱片中的6β-羟基托品醇的分析研究，对消旋山莨菪碱合成反应的控制及质量的提高起着至关重要的作用，也直接影响消旋山莨菪碱片的质量，因此该方法对后续消旋山莨菪碱片质量控制具有极其重要的意义。