用于获取质谱数据的方法和质谱系统与流程

本公开涉及用于在质荷比(m/z)范围内获取样品的质谱数据的方法。本公开还涉及用于执行这样的方法的质谱系统。

背景技术：

1、在使用基于离子阱的质量分析器的质谱仪(诸如由thermo fisher scientifictm制造的orbitraptm质谱仪)中，进入分析器的离子数应当被限制在一定范围内以避免由于阱的过度填充而导致的不期望的效应，诸如空间电荷效应。在orbitraptm仪器中，通常，阱(c阱)将离子注入轨道捕获质量分析器中。这种阱通常被称为“提取阱”。轨道捕获仪器上的全质谱(ms)扫描中的离子数或总离子流(tic)的典型目标值在1×106到3×106范围内。然而，这种强加的上限自然也限制了质谱扫描的动态范围以及样品中较低丰度的分析物可实现的信噪比(s/n)。这个缺点在生物样品的分析中变得特别明显，该生物样品通常由非常高丰度的几个种类支配。例如，在人血浆中，蛋白血清白蛋白占血浆蛋白的约50％。对样品中较低丰度种类的有效分析需要去除优势种类(这在所有情况下可能是不可能的)，或者需要增大动态范围以分辨高丰度种类和低丰度种类。

2、为了记录覆盖宽m/z范围的普通全扫描，源自样品的离子在阱(例如，c阱)中累积一定量的时间，然后被注入质量分析器(例如，轨道捕获质量分析器)中。累积离子的总时段(本文中称为“注入时间”)通常由自动增益控制(agc)机制确定，该agc机制控制c阱中的累积时间。agc通常利用感兴趣的m/z范围的观测到的tic以及先前扫描(例如，全扫描或短低分辨率“预扫描”)的相关联注入时间两者，但也可利用附加静电计设备来估计在离子阱中达到指定离子数(也称为agc目标值)所必需的注入时间。与tic本身一样，所得注入时间主要由样品中丰度最高的种类确定。考虑到注入时间同等地适用于所有样品成分并且通常来自m/z范围的所有离子同时进入离子阱，较低丰度的种类将根本不被分辨或者将在低s/n比下被检测，从而限制分析的动态范围。

3、先前已经描述了增大m/z范围的s/n比以及ms扫描的总动态范围的方法。wo-2006/129083描述了一种方法，该方法包括从多个选定的m/z范围顺序地注入离子，随后对离子的组合样品进行质量分析，并且使用agc机制来实现目标离子数。

4、a.d.southam等人(anal.chem.2007,79,4595)描述了一种增大傅里叶变换离子回旋共振(ft-icr)质谱(特别是直接进样纳米电喷雾应用)的动态范围的方法，包括对多个相邻、重叠的m/z窗口进行连续注入和质量分析，随后拼接这些窗口以产生连续的全扫描光谱。该方法包括专用拼接算法，该专用拼接算法的主要目的在于保持或甚至提高ft-icr质谱仪的高质量精度。

5、f.meier等人(nat.methods 2018,15,440)描述了一种称为“boxcar”的采集方法，并且wo-2018/134346描述了类似方法。这些公布旨在通过从全扫描m/z范围的分区顺序地注入离子并且对离子的两个或更多个组合样品执行质量分析来增大较低丰度种类的s/n以及全扫描的总动态范围，离子的两个或更多个组合样品稍后可以通过后处理算法拼接在一起以产生全扫描光谱。具体地说，宽m/z范围被划分成多个相邻、重叠的m/z窗口，该m/z窗口以交替方式被指派给两个或更多个“boxcar扫描”(部分谱)。例如，在两个boxcar扫描的情况下，窗口#1、#3、#5...被指派给扫描#1，窗口#2、#4、#6...被指派给扫描#2。对于每次扫描，来自所分配窗口的离子被顺序地注入，然后在质量分析器中被共同地测量。f.meier等人聚焦于蛋白质组学应用，并且作者证明了与q exactivetmhf上的标准全扫描相比在灵敏度和每单位时间检测到的蛋白质的数量方面的改善的性能。

6、boxcar方法(wo-2018/134346)寻求提供一种用于替代标准全扫描而不干扰已建立的工作流(诸如蛋白质组学中的数据依赖性采集)并且不损害采集速度的方法。以如wo2006/129083中描述的通过选定的m/z范围的顺序注入和共同质量分析来复用该选定的m/z范围的基本方法为基础，boxcar方法证明了通过获取复用的部分扫描可以有效地增大全扫描的动态范围。由于部分扫描中的每个m/z窗口具有相同的agc目标值，因此由agc分配的各个注入时间高度依赖于窗口中包含的种类的丰度。例如，较低丰度种类将被指派比较高丰度种类高的注入时间，从而降低高丰度种类的比例，以利于较低丰度种类，并且更好地利用可用的总离子注入时间(该总离子注入时间不像在标准全扫描中那样受丰度最高种类的限制)。

7、在us-8809770、us-9269553和us-9543134中已经描述了将前体m/z扫描范围分成固定或可变宽度的多个m/z窗口的想法。us-8809770使用不同的m/z选择窗口来产生碎裂谱，在该碎裂谱中搜索来自碎裂谱库的已知化合物。us-9269553和us-9543134描述了使用覆盖感兴趣的整个m/z范围的多个宽前体m/z选择窗口来获得多个碎裂谱。然而，这些文献中没有一个文献解决了通过前体的顺序注入和共同质量分析来增大前体的动态范围(ms1)扫描的方面。具体地，这些文献中的每个文献描述了ms2质谱，而不是ms1方法。

8、虽然上述方法已经引起质谱数据的采集方面的改进，但是本公开的目的是提供用于获取质谱数据的改进方法。具体地，本公开的一个目的是在获取质谱数据时获得高动态范围。

技术实现思路

1、本公开的一些实施方案涉及使用自动增益控制(agc)机制的质谱(ms)，该agc机制确定分析物样品离子的注入时间以控制进入基于离子阱的质量分析器(例如，轨道捕获质量分析器或基于阱的飞行时间(tof)，在该tof中离子进入阱，离子从该阱被喷射到tof质量分析器中)的离子数。注入时间是也可以被描述为“累积时间”或“填充时间”的参数。进入基于离子阱的质量分析器的质量分析器中的离子数可以通过在计算出的时间段内填充提取离子阱来控制。离子从提取阱喷射到质量分析器中，使得离子仅可以在指定时间进入质量分析器。这个计算出的时间段是注入时间、累积时间或填充时间，并且本公开的一些实施方案涉及对确定这个参数的改进。

2、在本公开的一些实施方案中，扫描范围的自动划分可以用于将具有高丰度信号的m/z区域与具有低丰度信号的m/z区域分开，并且因此允许根据样品的组成来动态调整高动态范围(hdr)窗口(该hdr窗口在本文中也称为m/z子范围)。由于该方法准许动态调整，当样品的组成是高度时间依赖性的时，本文所述的方法可以是特别有利的，这可能是色谱实验中的情况。与诸如boxcar方法的先前方法相比，可以实现动态m/z窗口的改进分配。具体地，本文所述的实施方案允许在相对短的时间尺度上对低丰度区域的动态聚焦，使得原则上可以诸如在扫描到扫描的基础上以高频率执行m/z范围的自动重新划分。

3、在一般意义上，本公开提供了用于在m/z范围的至少一部分内获取样品的质谱数据的方法。该方法包括：在m/z范围内接收样品的质谱数据，以及通过以下操作将m/z范围划分成一组或多组m/z子范围，每组包括一个或多个m/z子范围：将m/z范围分成多个m/z箱(bin)；基于质谱数据来确定每个m/z箱的离子丰度指示；以及通过将具有对应于至少阈值程度的离子丰度的m/z箱指派给所形成的m/z子范围来形成一组或多组m/z子范围中的m/z子范围。该方法还包括针对每组m/z子范围对样品执行质量分析，从而获取一个或多个部分质谱数据集。通过基于质谱数据以这种方式划分m/z范围，可以动态地确定用于质量分析的m/z子范围。这允许快速地并且以在执行质量分析时防止非常高丰度的种类支配较低丰度的种类的方式确定多组m/z子范围。通过将m/z范围划分成箱且接着将那些箱分组在一起来划分m/z范围的这个过程可称为“聚类”。这个“聚类”的结果是被分组在一起的一个或多个m/z箱，该一个或多个m/z箱随后可以被处理以确定用于质量分析的m/z子范围。

4、在一些实施方案中，形成用于质量分析的m/z子范围的过程可以包括：(i)将全m/z范围分成箱(该箱可以是等距的)，并且确定每个箱的tic值(或离子丰度的其他度量，诸如信号强度的任意度量)；(ii)将类似tic量值的箱分组成不同大小的簇；以及(iii)处理簇列表以将光谱划分成m/z子范围(m/z窗口)。在每次迭代中，优选地划分全光谱范围。最终处理步骤(iii)可以涉及形成比步骤(ii)中形成的簇宽的m/z子范围。在一些场景中，在m/z子范围之间使用相对宽的重叠(与boxcar方法相比)可以避免重新缩放在质量过滤器的侧翼区域(例如，四极杆的侧翼)中获得的峰的强度的需要。因此，在hdr实验中不需要记录伴随hdr全扫描的标准全扫描。这可以节省时间并且可以减少对后处理工作流的需要。

5、因此，概括地说，本公开还提供了一种用于在m/z范围的至少一部分内获取样品的质谱数据的方法，该m/z范围包括多组m/z子范围，每组包括一个或多个m/z子范围。该方法包括确定多组m/z子范围中的第一组m/z子范围(例如，用于执行第一子扫描)以及确定多组m/z子范围中的第二组m/z子范围(例如，用于执行第二子扫描)，该第一组包括(至少)第一m/z子范围并且该第二组包括(至少)第二m/z子范围。该方法还包括使用具有对应于第一m/z子范围的第一响应曲线的第一质量过滤器对样品进行质量过滤以隔离第一组m/z子范围中的离子，该第一响应曲线具有相对高的透射区域和一个或多个相对低的透射区域；以及在第一组m/z子范围内对样品执行质量分析以获得第一部分质谱数据集。第一质量分析可以被描述为第一子扫描。然后，该方法包括使用具有对应于第二m/z子范围的第二响应曲线的第二质量过滤器对样品进行质量过滤以隔离第二组m/z子范围中的离子，该第二响应曲线具有相对高的透射区域和一个或多个相对低的透射区域；以及在第二组m/z子范围内对样品执行质量分析以获得第二部分质谱数据集。第二质量分析可以被描述为第二子扫描。

6、第一质量过滤器和第二质量过滤器可以是相同的质量过滤器或两个不同的质量过滤器。例如，第一质量过滤器和第二质量过滤器可以是两个四极杆，或者它们可以是单个四极杆。然而，可使用其他数量和类型的过滤器。在优选实施方案中，使用单个质量过滤器并执行每个子扫描。然而，在一些替代具体实现中，可使用一个仪器执行一个子扫描，可在另一仪器上执行另一子扫描，且可将所得部分光谱拼接在一起。

7、确定第一组m/z子范围和第二组m/z子范围的步骤包括设置第一组m/z子范围和第二组m/z子范围，使得第一响应曲线的相对高的透射区域至少部分地与第二响应曲线的相对高的透射区域重叠。第一响应曲线和第二响应曲线可以在m/z轴上彼此相邻，具有足够高的重叠度以确保高透射区域重合。通过使响应曲线的相对高的透射区域重叠，可以确保对于任何给定的m/z值，所获得的质谱数据都是从响应曲线的相对高的透射部分获得的。这意味着不需要补偿质量过滤器的响应曲线的不完美(例如，梯形)性质，因为将已经从响应曲线的低透射侧翼之外获得数据。因此，可能需要更少的数据后处理。

8、每组m/z子范围可以包括一个或多个m/z子范围。对于在一组m/z子范围内的每个子扫描，可以顺序地注入m/z子范围。对于注入的每个m/z子范围，优选地单独调谐质量过滤器，并且质量过滤器将具有与特定m/z子范围相关联的单独响应曲线。此外，hdr扫描可以包括多于两个子扫描。例如，可以识别两组、三组、四组或甚至更多组不同的m/z子范围。

9、本公开的一些实施方案提供用于调整质谱分析的注入时间的方法。例如，本公开的实施方案允许在m/z窗口之间重新分配累积的未使用的注入时间，这可以提高包含相对低丰度的离子的m/z区域中的灵敏度。具体地，当agc算法确定超过实际可用时间的一组注入时间时，那些注入时间中的至少一些注入时间可被减少。这可以通过优先比其他注入时间更多地减少某些注入时间以保持动态范围来实现。例如，这可以通过重新分配来自m/z窗口的“备用”注入时间来实现，该m/z窗口被指派小于它们的注入时间的合理份额(例如，均等分布)的注入时间。然而，所有注入时间可以减少相等的因子。总可用注入时间可能受仪器的重复率约束，该重复率可以是用户定义的并且/或者是基于样品、实验等。例如，重复率可取决于在每个色谱(例如，液相色谱(lc))峰上需要测量的频率。因此，根据本公开的方法来调整注入时间可改善可用注入时间的利用，同时继续遵守对可用时间的约束。

10、因此，概括地说，本公开还提供了一种用于在m/z范围的至少一部分内获取样品的质谱数据的方法，该m/z范围包括一组一个或多个m/z子范围。该方法包括确定初始注入时间分布，该初始注入时间分布包括针对该一组一个或多个m/z子范围中的每个m/z子范围的初始注入时间。基于确定初始注入时间分布的总时间超过用于获取质谱数据的总可用注入时间，该方法确定包括针对每个m/z子范围的经调整的注入时间的经调整的注入时间分布。经调整的分布中的一个或多个经调整的注入时间可以与初始分布的对应初始注入时间相同(即相等)。即，不是每个和每一个m/z子范围的累积时间都将根据该累积时间的初始值得到调整。事实上，在本公开的实施方案中，经调整的分布的至少一个注入时间不同于初始分布的对应注入时间。

11、该方法然后包括根据经调整的注入时间分布对每个m/z子范围执行质量分析，以获得部分质谱数据集。确定经调整的注入时间分布包括减少针对相应m/z子范围的初始注入时间中的至少一个初始注入时间，使得针对该一组一个或多个m/z子范围的经调整的注入时间分布的总时间不大于用于获取质谱数据的总可用注入时间。

12、部分质谱数据集(从单独的子扫描获得的数据)可以被组合以提供覆盖全扫描范围的ms数据。因此，本公开还提供扫描拼接程序，该扫描拼接程序可用于将两个或更多个部分质谱数据集实时地转换成hdr全扫描，该hdr全扫描可像标准全扫描一样由采集后软件工具处理。因此，可以减少或避免附加的、潜在耗时的后处理步骤。在拼接程序中，两个相邻m/z子范围在它们的重叠区域处拼接在一起，当使用本文所述的hdr方法获得时，这两个相邻m/z子范围源自单独的部分质谱数据集。这个重叠区域内的拼接边界可以是可变的，并且可以被优化以保持出现在两个窗口的边界区域中的同位素分布。

13、本公开还提供一种混合方法。该混合方法涉及获得m/z范围的标准全扫描以及包括选定的非重叠m/z子范围的单个(或少量)hdr“缩放”扫描。标准全扫描可用作定量的参考点。在一些情况下，标准全扫描本身可以为高丰度峰提供足够的信息。hdr“缩放”扫描可以提供对全扫描的稀疏区域或特别感兴趣的区域的更深入的洞察。标准全扫描中的这些区域可以用来自hdr子扫描(或多个子扫描)的对应m/z窗口替代，以获得混合hdr全扫描。如果这个混合hdr工作流包括两个扫描事件，则扫描速率性能可以与使用两个hdr子扫描的方法相当。

14、因此，在一般意义上，本公开还提供了一种用于在m/z范围内获取样品的质谱数据的方法，包括：在m/z范围内对样品执行第一质量分析，从而获取第一质谱数据集；以及将m/z范围划分成一组或多组m/z子范围，每组包括一个或多个m/z子范围；以及针对每组m/z子范围对样品执行质量分析，从而获取一个或多个部分质谱数据集。因此，第一质谱数据集可以在全m/z范围内提供关于样品的信息，而一个或多个部分质谱数据集可充当针对全m/z范围的特定子范围的“放大”扫描。可以基于第一质谱数据集如上所述地执行划分。还可以基于(例如，从对同一样品执行的较早扫描获得的)较早的质谱数据集执行划分。可以将第一质谱数据集和一个或多个部分质谱数据集拼接在一起，以提供有效地作为单个全扫描的增强版本的质谱数据集。

15、通过下面的详细描述，上述优点和其他优点将变得明显。