一种从石菖蒲中筛选GABA-T配体的中空纤维配体垂钓方法

本发明属于中药活性成分筛选，具体涉及一种从石菖蒲中筛选gaba-t配体的中空纤维配体垂钓方法。

背景技术：

1、伽马氨基丁酸转氨酶(gaba-t)是伽马氨基丁酸(gaba)代谢通路的关键酶。gaba由谷氢酸经过谷氨酸脱羧酶催化生成，再由gaba-t代谢分解。研究表明，许多神经系统疾病都与gaba介导的抑制性突触传递作用的降低有关。例如，临床上发现，患有癫痫、帕金森症、亨廷顿舞蹈症和阿尔茨海默症的病人脑内gaba水平较正常人均有不同程度的降低。增加脑内gaba浓度可以提高gaba能系统的神经抑制作用，从而可达到预防和治疗神经系统疾病的目的。由于gaba不能透过血脑屏障，因此，脑内gaba水平的提高无法通过口服外源性gaba来实现。当gaba-t的活性受到抑制后，脑内gaba浓度就会升高，并使gaba能系统的神经抑制作用增强。gaba-t已被确认为抗癫痫药物的关键靶点，gaba-t配体的研究开发一直受到广泛的关注。

2、石菖蒲(acotus tatarinowii schott.)为天南星科草本植物。在苗医药理论中，走关，是药力对人体各架组关口的走向，石菖蒲能走脑架第一关。现代研究表明，石菖蒲具有改善认知障碍、抗抑郁、抗焦虑、抗癫痫、抗帕金森等治疗神经系统疾病作用，其作用机制与抑制gaba-t这一神经系统疾病关键靶点有关，因此，从石菖蒲中发现gaba-t的配体化合物具有十分重要的意义。

3、传统的天然药物化学的方法可以通过对石菖蒲中的化学成分逐一分离，再分别进行活性测定，来分析其gaba-t抑制活性，显然这种方法非常耗时。近年来发展的高通量筛选技术由于大大提高了发现酶、受体或其他药物靶点配体的速度而受到广泛欢迎。目前对gaba-t抑制剂的筛选常用的方法有荧光法和紫外-可见分光光度法等，然而这些方法往往只设计来筛选纯化合物，又忽略了多个组分之间相互作用的重要性，不适用于从复杂民族药体系中筛选活性成分。适用于复杂体系的靶向筛选技术一直是快速追踪民族药中活性成分的瓶颈。

4、带有纳米级侧壁微孔的中空纤维管因其具有简单、比表面积大，渗透路径短，富集率高等优点，在样品预处理领域越来越引起关注。基于中空纤维侧壁微孔允许小分子自由通过，而大分子受阻的结构特点，将中空纤维应用于以大分子酶为配体的活性成分筛选具有极大的可能性。

5、本发明团队建立了基于gaba-t的中空纤维配体垂钓技术的新方法，将gaba-t溶液注射入中空纤维的管腔中，并作为“诱饵”垂钓出传统药物提取物中的潜在活性成分，此过程中靶点酶被中空纤维包裹在内部而得以保护。采用中空纤维配体垂钓技术已成功的从石菖蒲中筛选出配体抑制剂阿尔法细辛醚，为石菖蒲中gaba-t抑制成分的发现提供了新策略。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种从石菖蒲中筛选伽马氨基丁酸转氨酶配体的中空纤维配体垂钓方法。

2、本发明是通过如下技术方案实现：

3、本发明所述一种从石菖蒲中筛选伽马氨基丁酸转氨酶配体的中空纤维配体垂钓方法，包括如下步骤：

4、(1)gaba-t的上样：将聚偏(二)氟乙烯中空纤维剪切成15cm片段，分别用50ml乙腈、50ml甲醇、50ml重蒸水浸泡清洗15min，室温晾干；然后将gaba-t溶液注射入u型中空纤维管的空腔，孵育40～200min，备用；

5、(2)石菖蒲中gaba-t配体的垂钓：将充有gaba-t的中空纤维管加热封口后，置于石菖蒲挥发油中进行60khz超声垂钓5～40min，垂钓后的中空纤维用ph值8.5的tris-hcl缓冲液在相同的垂钓条件下超声清洗5min；

6、(3)gaba-t配体的洗脱、解离和质谱测定：用25～75μl甲醇将中空纤维管内垂钓出的gaba-t配体洗脱、解离，洗脱液合并后在12,000rpm下离心3min；最后将上清液注入液相色谱质谱联用系统进行常规分析即可。

7、本发明步骤(1)中所述gaba-t溶液的浓度为：1～5mg/ml。

8、优选的，本发明步骤(1)中所述gaba-t溶液的浓度为：2.5～5mg/ml。

9、进一步优选的，本发明步骤(1)中所述gaba-t溶液的浓度为：3mg/ml。

10、优选的，本发明步骤(1)中所述共孵育120～200min。

11、进一步优选的，本发明步骤(1)中所述共孵育160min。

12、优选的，本发明步骤(2)中所述超声垂钓15～30min。

13、进一步优选的，本发明步骤(2)中所述超声垂钓20min。

14、优选的，本发明步骤(3)所述甲醇的体积为：35～65μl。

15、进一步优选的，步骤(3)所述甲醇的体积为：45μl。

16、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

17、1.本发明利用带有纳米级侧壁微孔的中空纤维管简单、比表面积大，渗透路径短，富集率高等优点，将gaba-t溶液注射入中空纤维的管腔中，并作为“诱饵”垂钓出中药石菖蒲中的gaba-t配体，此过程中靶点酶被中空纤维包裹在内部而得以保护。解决了现有技术中对gaba-t配体抑制剂的筛选常用方法即荧光法和紫外-可见分光光度法等光谱法方法只能筛选纯化合物，又忽略了多个组分之间相互作用的重要性，不适用于从复杂中药体系中筛选活性成分等问题。

18、2.现有技术中的天然药物化学方法，为通过对石菖蒲中的化学成分逐一分离，再分别进行活性测定，来分析其gaba-t抑制活性，显然这种方法非常耗时，少则数月，多则需要数年；而本发明采用的中空纤维配体垂钓法能够实现在一天之内快速筛选出石菖蒲中的gaba-t配体化合物，解决了现有技术方法非常耗时问题。

19、3.本发明对从石菖蒲中筛选gaba-t配体的中空纤维配体垂钓方法的参数进行优化，确定最佳参数为：3mg/ml的gaba-t溶液注射入u型中空纤维管的空腔，共孵育160min，置于石菖蒲挥发油中进行60khz超声垂钓20min，用45μl甲醇将中空纤维管内垂钓出的gaba-t配体洗脱、解离。该方法稳定可行。

20、4.在优选配体垂钓条件下，从石菖蒲中成功筛选出gaba-t配体化合物阿尔法细辛醚，结果表明阿尔法细辛醚对gaba-t活性有浓度依赖性的抑制作用,阿尔法细辛醚抑制gaba-t活性的ic50为57.9μg/ml。实施案例中的筛选结果显示，本发明方法操作简单，经济有效，适合石菖蒲中伽马氨基丁酸转氨酶配体化合物的筛选。本发明中经优化的基于gaba-t的中空纤维配体垂钓各参数对于利用中空纤维配体垂钓方法筛选其他gaba-t配体化合物具有重要的参考价值。

技术特征：

1.一种从石菖蒲中筛选gaba-t配体的中空纤维配体垂钓方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的中空纤维配体垂钓方法，其特征在于，步骤(1)中所述gaba-t溶液的浓度为：1～5mg/ml。

3.根据权利要求2所述的中空纤维配体垂钓方法，其特征在于，步骤(1)中所述gaba-t溶液的浓度为：2.5～5mg/ml。

4.根据权利要求3所述的中空纤维配体垂钓方法，其特征在于，步骤(1)中所述gaba-t溶液的浓度为：3mg/ml。

5.根据权利要求1所述的中空纤维配体垂钓方法，其特征在于，步骤(1)中所述共孵育120～200min。

6.根据权利要求5所述的中空纤维配体垂钓方法，其特征在于，步骤(1)中所述共孵育160min。

7.根据权利要求1所述的中空纤维配体垂钓方法，其特征在于，步骤(2)中所述超声垂钓15～30min。

8.根据权利要求7所述的中空纤维配体垂钓方法，其特征在于，步骤(2)中所述超声垂钓20min。

9.根据权利要求1所述的中空纤维配体垂钓方法，其特征在于，步骤(3)所述甲醇的体积为：35～65μl。

10.根据权利要求9所述的中空纤维配体垂钓方法，其特征在于，步骤(3)所述甲醇的体积为：45μl。

技术总结
本发明公开了一种从石菖蒲中筛选GABA‑T配体的中空纤维配体垂钓方法，将伽马氨基丁酸转氨酶(GABA‑T)溶液注射入中空纤维的管腔中，并作为“诱饵”垂钓出石菖蒲挥发油中的潜在活性成分。所述方法包括：1)GABA‑T的上样；2)石菖蒲中GABA‑T配体的垂钓；3)GABA‑T配体的洗脱、解离和质谱测定。本发明配体垂钓方法稳定可行、操作简便，适用于石菖蒲中GABA‑T配体的快速筛选，对于利用中空纤维配体垂钓方法筛选其他GABA‑T配体化合物具有重要的参考价值。

技术研发人员：陈亮,方成维,李倩,陈滕,朱丹,李嘉欣
受保护的技术使用者：贵州中医药大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15