一种基于液质联用的益母草颗粒对原发性痛经的治疗机制代谢组学分析方法

本发明属于生物，涉及一种基于液质联用的益母草颗粒对原发性痛经的治疗机制代谢组学分析方法。

背景技术：

1、痛经是临床最常见的疾病，多发生于生育年龄的女性，在临床上主要分为原发性痛经(pd)和继发性痛经(sd)。pd是目前妇科最常见的疾病，其中10％患者症状严重，是影响妇女正常工作和生活质量的常见原因。目前西医对pd的治疗尚未取得满意的治疗效果，中医药在pd治疗方面有其独特的优势。

2、益母草颗粒为2020年版《中国药典》(一部)收载品，由益母草单味中药组成，具有活血调经的功效，临床上常用于治疗血瘀所导致的月经不调、产后恶露不绝等症。基于天然药物化学的研究表明，益母草中主要含有生物碱类、黄酮类、苯丙素类和二萜类等化学成分，然而并非所有的化学成分都能被吸收入血，且进入血液循环的物质也可能转变成其他代谢产物后发挥药效，因此益母草的化学成分并不能等同于活性成分。有少量文献报道了益母草中益母草碱的体内过程，对其它大多数成分的体内过程缺乏研究。代谢组学是一种通过分析生物样本中大量代谢物质并进行比较的方法，具有高效、客观、可定性和可定量分析的特点，利用代谢组学方法研究中药体内代谢物，能克服中药成分复杂，代谢过程不明的“黑匣子”，更直观地探究中药有效成分及作用机制。

3、因此，有必要开发一种基于代谢组学对益母草颗粒活性成分及对原发性痛经小鼠治疗机制研究的方法。

技术实现思路

1、为了解决所述技术问题，本发明提供了一种基于液质联用的益母草颗粒对原发性痛经的治疗机制代谢组学分析方法，该方法研究益母草颗粒小鼠血浆入血活性成分，及其对原发性痛经模型小鼠血清代谢物的影响，寻找可能的生物标志物，探讨益母草颗粒治疗原发性痛经的作用机制。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、在本发明的第一方面，提供了基于液质联用的益母草颗粒对原发性痛经的治疗机制代谢组学分析方法，所述方法包括：

4、骤s1、通过液相色谱-飞行时间质谱仪，检测获得益母草颗粒水溶液的化学成分；

5、步骤s2、给雌性小鼠灌胃益母草颗粒，采集小鼠血浆，通过液相色谱-飞行时间质谱仪，采集获得图谱信息并进行分析，获得入血成分；

6、步骤s3、对步骤s2中的图谱信息进行数据预处理，进行多变量统计分析，筛选获得有显著性的差异化学成分；

7、步骤s4、结合步骤s1的化学成分和步骤s2的入血成分，探讨益母草颗粒的活性成分及代谢变化，并根据所述差异化学成分进行药效活性评价；

8、步骤s5、将健康小鼠分成对照组、原发性痛经模型组和益母草颗粒治疗组三个实验组，原发性痛经模型组和益母草颗粒治疗组小鼠每日皮下注射苯甲酸雌二醇复制小鼠原发性痛经模型，对照组给与pbs溶媒同法平行处理，益母草颗粒治疗组小鼠每日灌喂益母草颗粒水煎液进行治疗，对照组和原发性痛经模型组小鼠均给予等量生理盐水，造模20-30天，并以生理改变和病理改变判定造模是否成功；

9、步骤s6、造模成功后，分别取得三个实验组小鼠的血浆样本，采用液相色谱-飞行时间质谱仪检测，获得三个实验组小鼠血浆样本的代谢图谱信息；

10、步骤s7、对所述三个实验组的代谢图谱信息进行多变量统计分析筛选有显著性差异的生物标志物群；

11、步骤s8、所述步骤s3获得的差异化学成分与所述步骤s7获得的差异生物标志物物群之间的关系以及参与的代谢通路，探讨益母草颗粒治疗原发性痛经的作用机制。

12、所述步骤s8的原理为：探讨益母草颗粒治疗原发性痛经的作用机制的原理为：药物的成分通过影响机体代谢物，调控代谢通路，发挥治疗疾病的作用。

13、进一步地，所述步骤s1中，所述液相色谱飞行时间质谱仪检测条件为：挥发气温度：120℃；离子源温度：120℃；毛细管电压：3kv，锥孔电压：30v，离子补偿：80v，电离方式为电喷雾电离，锥孔气流：50l/h,去溶剂气流：800l/h，mse扫描模式，质谱扫描范围为50-1500m/z，以每秒2张谱的速度，分辨率模式，正负离子分别采集，碰撞能量为20-80v；色谱条件：流动相a为0.1％甲酸水溶液，b为乙腈，梯度如下：0-1min：2-5％b，1-3min：5-10％b，3-17min：10-98％b，17-27min：98-99％b，27-27.1min：99-2％b，27.1-30min：2％b；流速：0.4ml/min，柱温40℃，进样量5ul。

14、进一步地，所述步骤s2中，所述代谢图谱信息的采集过程设定液相色谱飞行时间质谱仪检测条件为：挥发气温度：120℃；离子源温度：120℃；毛细管电压：3kv，锥孔电压：30v，离子补偿：80v，电离方式为电喷雾电离，锥孔气流：50l/h,去溶剂气流：800l/h，mse扫描模式，质谱扫描范围为50-1500m/z，以每秒2张谱的速度，分辨率模式，正负离子分别采集，碰撞能量为20-80v；色谱条件：流动相a为0.1％甲酸水溶液，b为乙腈。梯度如下：0-1min：2-5％b，1-3min：5-10％b，3-17min：10-98％b，17-27min：98-99％b，27-27.1min：99-2％b，27.1-30min：2％b。流速：0.4ml/min,柱温40℃，进样量5ul。

15、进一步地，所述步骤s3中，所述数据预处理的过程为：对采集的代谢图谱信息进行峰提取、峰对齐、峰匹配和峰强度的校正，获得包含化合物保留时间和峰面积信息的csv格式文件。

16、进一步地，所述步骤s4中，所述多变量统计分析的过程：将分组后的数据进行无监督的主成分分析和有监督的偏最小二乘回归分析，对组别进行分类并判别组间差异，选择显著性差异p值小于0.05、vip值大于1，fold change大于100的化合物作为益母草颗粒的入血成分。

17、进一步地，所述步骤s6中，所述代谢图谱信息的采集过程设定液相色谱飞行时间质谱仪检测条件为：挥发气温度：120℃；离子源温度：120℃；毛细管电压：3kv，锥孔电压：30v，离子补偿：80v，电离方式为电喷雾电离，锥孔气流：50l/h,去溶剂气流：800l/h，mse扫描模式，质谱扫描范围为50-1500m/z，以每秒2张谱的速度，分辨率模式，正负离子分别采集，碰撞能量为20-80v；色谱条件：流动相a为0.1％甲酸水溶液，b为乙腈；梯度如下：0-1min：2-5％b，1-3min：5-10％b，3-17min：10-98％b，17-27min：98-99％b，27-27.1min：99-2％b，27.1-30min：2％b。流速：0.4ml/min,柱温40℃，进样量5ul。

18、进一步地，步骤s7中，所述对所述三个实验组的代谢图谱信息进行多变量统计分析筛选有显著性差异的生物标志物群包括：将分组后的数据进行无监督的主成分分析和有监督的偏最小二乘回归分析，选择显著性差异p值小于0.05、vip值大于1，fold change大于2的代谢物作为益母草颗粒的差异代谢物。

19、本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

20、本发明提供的一种基于液质联用的益母草颗粒对原发性痛经的治疗机制代谢组学分析方法中，(1)现有技术大多对益母草的化学成分进行研究，并不能反映其进入血浆发挥作用的药效成分。本发明从整体的角度研究中药入血的活性成分，及对生物体内源性小分子的影响及变化规律，为中医证候和中药整体作用机制研究提供了新的研究思路和方法。

21、(2)现有技术大多对益母草某一化学成分的药理学作用进行研究，并不能从整体上反映其对机体病理状态下代谢的影响。本发明通过检测不同分组间内源性小分子代谢物的变化，分析益母草颗粒对血浆代谢物的影响，并进一步探索其可能的治疗机制。