一种比率荧光比色双模式酶级联传感器及制备方法和应用

本发明专利涉及生物传感检测，尤其是指一种比率荧光比色双模式酶级联传感器及制备方法和应用及制备方法和应用。

背景技术：

1、近年来，随着生活条件的提升，人们的饮食结构愈发向高嘌呤化发展，食物中的嘌呤摄入是体内嘌呤的重要来源之一，从而引起人体嘌呤代谢异常。嘌呤是构成体内核酸的重要碱基化合物,其在体内的代谢终产物为尿酸。当体内尿酸沉积时,易引发高尿酸血症和痛风。其中黄嘌呤在人体中代谢异常会引起包括高尿酸血症，痛风，脑缺血和肿瘤高热等在内的多种疾病。黄嘌呤作为腺嘌呤和鸟嘌呤的关键代谢物，分布在人体大多数组织和血液中，可通过黄嘌呤氧化酶转化为尿酸，并伴随过氧化氢的产生。

2、前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，是全世界诊断出的最常见的癌症之一，尿液前列腺癌抗原3(pca3)、早期前列腺抗原(epca)等生物标志物逐步走进了大众的视野，但是由于其检测手段有限，检测灵敏度和特异性存在较大问题，许多患者因此进行了不必要的活检，限制了在临床上的使用。因此急需一种新的标志物检测方法和有效的筛查手段。近年来通过代谢组学发现肌氨酸可被用作前列腺癌患者生物标志物，2009年，一项试点研究创建了一种非侵入性方法来识别前列腺癌的存在和发展过程，并表明甘氨酸的代谢物肌氨酸可以在患者尿液和血液中检测，可以作为前列腺癌预测的标志物。

3、乙酰胆碱为中枢及周边神经系统中常见的神经传导物质，在自主神经系统及体运动神经系统中参与神经传导，稳定体内乙酰胆碱含量能够有效的治疗和改善老年痴呆症，因此乙酰胆碱的检测在基础性研究和临床应用中具有重要的意义。葡萄糖监测是诊断糖尿病的主要依据。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸、维生素d以及甾体激素的原料，但长期大量摄入胆固醇，不利于身体健康，会使血清中的胆固醇含量升高，增加患心血管疾病的风险。尿酸是嘌呤碱的氧化分解产物，在人体中无生理功能。临床研究表明尿酸的增高，直接与痛风、高血压、高血脂、糖尿病等病人有着直接的关系，因此检测血液中尿酸的含量对临床诊断具有非常重要的意义。

4、目前，对于与人类疾病密切相关的疾病标志物的检测方法主要有电化学方法、电泳法等，但这些方法对仪器成本要求高，技术操作复杂，检测时间长，因此急需研发一种成本低、操作简便、灵敏度高的疾病标志物检测方法。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，由此，在本发明的第一方面，本发明提供一种比率荧光比色双模式酶级联传感器，包括rgo/pcn纳米片、负载于所述rgo/pcn纳米片的包埋天然酶的多金属有机框架enzyme@femn-zif-8及固定在所述包埋天然酶的多金属有机框架enzyme@femn-zif-8上的金纳米簇auncs。

2、在本发明的一个或多个实施例中，所述rgo/pcn纳米片的制备方法包括：

3、步骤1)：制备磷掺杂的类石墨相氮化碳pcn纳米片：制备尿素水溶液，向所述尿素水溶液中加入磷酸二氢铵，溶解，去水，在500-600℃下反应1.5-2.5h，得到块状p-g-c3n4，研磨，放入水中，离心，干燥，放入盐酸中，搅拌，洗涤，干燥，得到所述磷掺杂的类石墨相氮化碳pcn纳米片；

4、步骤2)：制备rgo/pcn纳米片：将步骤1)制备得到的磷掺杂的类石墨相氮化碳pcn纳米片加入水中，得到磷掺杂的类石墨相氮化碳pcn纳米片分散液，将氧化石墨烯加入水中，得到氧化石墨烯分散液，将所述磷掺杂的类石墨相氮化碳pcn纳米片分散液和所述氧化石墨烯分散液混合均匀，在90-110℃下反应5-7h，离心，得到所述rgo/pcn纳米片。

5、在本发明的一个或多个实施例中，氧化石墨烯的制备方法，包括：在30ml硫酸中加入1-2g石墨和1-2g硝酸钠，在冰浴中连续搅拌4h，然后将4g高锰酸钾与溶液缓慢混合，室温搅拌1h，向溶液中加入100ml去离子水，在37℃加温1h，升温至95℃回流2h，用25ml 30％过氧化氢终止进一步反应。制备的氧化石墨烯用5％的盐酸和去离子水多次洗涤后烘干备用。

6、在本发明的一个或多个实施例中，所述包埋天然酶的多金属有机框架enzyme@femn-zif-8的制备方法包括：

7、步骤一：制备包埋天然酶的单金属有机框架enzyme@zif-8：分别制备zn(no3)2水溶液、2-甲基咪唑水溶液、天然酶水溶液，将天然酶水溶液加入2-甲基咪唑水溶液中，混合均匀，得到混合溶液，将所述混合溶液加入所述zn(no3)2水溶液中，搅拌，离心，得到所述包埋天然酶的单金属有机框架enzyme@zif-8；

8、步骤二：制备包埋天然酶的多金属有机框架enzyme@femn-zif-8：将步骤一制备得到的包埋天然酶的单金属有机框架enzyme@zif-8溶于水中，加入feso4水溶液、mn(no3)2水溶液，搅拌，离心，得到所述包埋天然酶的多金属有机框架enzyme@femn-zif-8。

9、在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤一中，所述天然酶选自肌氨酸氧化酶、乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶、黄嘌呤氧化酶、葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、β半乳糖苷酶和尿酸氧化酶中的一种，优选地，znno3水溶液中的硝酸锌与混合溶液中的2-甲基咪唑的摩尔比为1：(4-12)。

10、在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤二中，feso4水溶液的浓度为2-3mg/ml，mn(no3)2水溶液的浓度为2-3mg/ml。

11、在本发明的一个或多个实施例中，所述金纳米簇auncs的制备方法包括：将谷胱甘肽与haucl4反应，得到金纳米簇auncs。

12、优选地，haucl4和谷胱甘肽的摩尔比为(0.5-2):1。

13、优选地，反应为60-100℃下反应12-24h。

14、在本发明的一个或多个实施例中，所述金纳米簇auncs的平均粒径为2～3nm。

15、在本发明的第二方面，本发明提供一种在本发明第一方面所述的比率荧光比色双模式酶级联传感器的制备方法，包括如下步骤：rgo/pcn纳米片加入水中，得到rgo/pcn纳米片分散液，包埋天然酶的多金属有机框架enzyme@femn-zif-8加入水中，得到包埋天然酶的多金属有机框架enzyme@femn-zif-8分散液，将所述rgo/pcn纳米片分散液与包埋天然酶的多金属有机框架enzyme@femn-zif-8分散液混合，超声，离心，得到的固体溶于水中，加入金纳米簇auncs，超声，离心，得到所述比率荧光比色双模式酶级联传感器。

16、在本发明的第三方面，本发明提供一种在本发明第一方面所述的比率荧光比色双模式酶级联传感器在制备体外检测疾病标志物的试剂中的应用。

17、优选地，体外检测疾病标志物的试剂选自体外检测肌氨酸、乙酰胆碱、胆碱、黄嘌呤、葡萄糖、胆固醇、β半乳糖苷或尿酸的试剂。

18、在本发明的第四方面，本发明提供一种体外检测疾病标志物的方法，包括如下步骤：配置一系列不同浓度的疾病标志物标准溶液分别加入到包含本发明第一方面所述的比率荧光比色双模式酶级联传感器的缓冲液中，检测反应体系荧光强度，根据荧光强度随疾病标志物标准品溶液浓度的变化绘制标准曲线，得到疾病标志物浓度的荧光标准曲线方程，将待测疾病标志物样品加入到包含本发明第一方面所述的比率荧光比色双模式酶级联传感器的缓冲液中，检测反应体系的荧光强度，根据所述疾病标志物浓度的荧光标准曲线方程，计算出所述待测疾病标志物样品的浓度；

19、优选地，所述比率荧光法检测疾病标志物时，检测反应体系在430nm与627nm处的荧光强度；比色法检测疾病标志物时，检测反应体系在652nm处的吸光度；

20、优选地，所述疾病标志物选自肌氨酸、乙酰胆碱、胆碱、黄嘌呤、葡萄糖、胆固醇、β半乳糖苷或尿酸中的一种。

21、本发明的有益效果在于：

22、1、本发明提供了一种比率荧光比色双模式酶级联传感器，通过构建多金属有机框架femn-zif-8，fe与mn的引入具有类芬顿效应，首先引发电子传递的过程；将天然酶包载在femn-zif-8中，增加了固定化酶的稳定性，减少了酶级联反应的中间产物的损失，以及加速酶级联反应的进行，提高了酶级联反应效率；rgo与pcn的结合改产了pcn的电子传递性能；p元素的存在构成p桥，促进p，fe与mn之间的电子传递；将enzyme@femn-zif-8负载到rgo/pcn纳米片上，zif-rgo/pcn异质结的形成促进了界面的电子传递；在多金属有机框架上固定金纳米簇auncs，由于auncs与zif的聚集诱导发光效应，使auncs的荧光强度大幅提升；au/enzyme@fmzif-rgo/pcn在430nm与627nm处有双荧光发射波长；au/enzyme@fmzif-rgo/pcn纳米传感平台不仅可以提高传感器的灵敏度与准确性，还可以降低检测限。

23、2、本发明提供的比率荧光比色双模式酶级联纳米传感器既可产生双发射波长的荧光信号，比率荧光提高了纳米平台的抗干扰能力，也可产生比色信号，丰富了检测方式，且两种检测信号既可独立响应，又能相互验证，提高了检测结果的可靠性；利用天然酶与底物的特异性结合，提高了检测方法的特异性。