一种含有微球填充的微流控芯片的检测系统及其应用

本发明涉及生物医学检测，更具体地，涉及一种含有微球填充的微流控芯片的检测系统及其应用。

背景技术：

1、心血管疾病(cvd)的预防和早期治疗是全球日益关注的公共卫生问题，急性心肌梗塞(ami)是最直接危及生命的心血管疾病形式之一，可对心脏造成不可逆转的损害，伴有心律失常、休克或心力衰竭。ami是全球发病和死亡原因第一的疾病，是严重影响全球人类健康的主要问题，全球每年约700多万人发病，临床死亡率非常高。针对ami的快速诊断和适当治疗将有效降低死亡率，并有效改善患者预后：ami患者在发病后1小时内黄金时段的治疗可将死亡率降低至3％，然而在发病后1.5～3小时内治疗会使死亡率增至4％。由此可知，ami的早期评估、快速诊断和预后对降低死亡率具有重要意义。然而，大约30％的患者不会出现ami的典型症状，如肩、胸、颈、背部和手臂疼痛，这给ami的诊断带来了许多困难。为了在早期阶段诊断ami，可将心肌损伤生物标志物与抗体联系起来。

2、目前，已有几种针对心肌损伤生物标志物的方法，如金标准法、酶联免疫吸附技术(elisa)、聚合酶链反应(pcr)技术等。这些方法具有优良的准确性，但也存在耗时，操作繁琐，需使用昂贵的大型仪器，操作人员专业素质高且容易产生假阳性结果的缺点。而且，上述方法虽然为实验室检测生物标志物提供了标准，但是大多需要在实验室开展，在应对食品和生物医学领域公共突发事件时，无法满足现场检测和临床诊断等各种检测分析的不同要求。针对心肌损伤生物标志物的常见检测方法及其分析性能如表1所示，由表1可知，常见的检测方法检测时间长，检测动态范围窄。

3、表1荧光、化学发光和电化学检测法的分析性能

4、

5、

6、微流控技术是当前检测技术最热门的前沿技术领域。与传统实验平台相比，微流控技术应用于生物标志物检测，可以大大缩短检测时间，减少耗材，降低成本，且具有集成度高、灵敏度高，检测设备小巧便捷的优点。此外，微流控所具有的多种单元操作灵活组合、整体可控性等优点使其和生物标志物检测的研究思路不谋而合，因此，微流控技术已经成为了生物标志物检测研究领域的重要技术平台。

7、但是，微流体装置中的流动通常是层流，会带来传质效率低的问题；生物标志物浓度低和流体速度分布不均匀等问题，还会导致微流控装置壁面上的探针难以捕获流体中的目标生物标志物，进一步导致微流控芯片的生物传感效率和灵敏度低。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种含有微球填充的微流控芯片的检测系统及其应用。

2、本发明的第一个目的是提供一种用于偶联抗体的微球。

3、本发明的第二个目的是提供一种偶联有抗体的微球。

4、本发明的第三个目的是提供一种拉曼检测探针。

5、本发明的第四个目的是提供一种免疫检测组合物。

6、本发明的第五个目的是提供一种检测系统。

7、本发明的第六个目的是提供一种用于非疾病治疗或诊断为目的的免疫检测的试剂盒。

8、本发明的第七个目的提供一种微球填充的微流控芯片的制备方法。

9、一种用于偶联抗体的微球，所述微球的制备方法包括以下步骤：

10、s1.将含二氧化硅的粒径范围为30～300nm的粒子硅烷化，得到硅烷化微球；

11、s2.将步骤s1制得的硅烷化微球与含有胶体金或纳米银颗粒的水溶液充分混合孵育后制得用于偶联抗体的微球。

12、优选地，步骤s1中，将粒径范围为70nm的玻璃颗粒硅烷化，得到硅烷化微球。

13、优选地，步骤s1中，洗涤含二氧化硅的粒径范围为30～300nm的粒子后，将含二氧化硅的粒径范围为30～300nm的粒子硅烷化。

14、更优选地，步骤s1中，使用piranha洗剂洗涤含二氧化硅的粒径范围为30～300nm的粒子。

15、优选地，步骤s1中，使用1％～10％3-氨基丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液与二氧化硅的粒径范围为30～300nm的粒子充分混合孵育，得到硅烷化微球。

16、优选地，步骤s2中，将步骤s1制得的硅烷化微球与胶体金颗粒水溶液充分混合孵育后制得用于偶联抗体的微球。

17、一种偶联有抗体的微球，所述微球的制备方法包括以下步骤：

18、s1.活化所述用于偶联抗体的微球上的羧基，得到活化微球；

19、s2.将抗体与步骤s1制得的活化微球混合孵育后固液分离并取沉淀，洗涤沉淀，得到抗体偶联微球；

20、s3.封闭步骤s2制得的抗体偶联微球，纯化产物，得到偶联有抗体的微球。

21、优选地，步骤s1中，将所述用于偶联抗体的微球与dmsa充分混合孵育后，再加入edc和nhs的混合液，充分混合孵育后纯化产物，得到活化微球。

22、更优选地，步骤s1中，将所述用于偶联抗体的微球与dmsa充分混合孵育后，再加入150mm edc和30mm nhs的混合液，充分混合孵育后纯化产物，得到活化微球。

23、最优选地，所述150mm edc和30mm nhs混合液中150mm edc和30mm nhs的体积比为1:1。

24、优选地，步骤s2中，所述抗体为单克隆抗体。

25、更优选地，步骤s2中，所述抗体为标记抗体。

26、最优选地，步骤s2中，所述标记抗体与步骤s1制得的活化微球的体积比为5～100:1。

27、优选地，步骤s3中，使用bsa封闭步骤s3制得的抗体偶联微球。

28、更优选地，步骤s3中，使用5％bsa封闭步骤s3制得的抗体偶联微球。

29、所述偶联有抗体的微球在非疾病治疗或诊断为目的的免疫检测中的应用也应在本发明的保护范围之内。

30、优选地，所述非疾病治疗或诊断为目的的免疫检测为心肌损伤标志物的检测。

31、更优选地，所述心肌损伤标志物为myo、ctni和/或ck-mb中的一种或几种。

32、所述偶联有抗体的微球在制备微球填充的微流控芯片中的应用也应在本发明的保护范围之内。

33、一种拉曼检测探针，所述拉曼检测探针的制备方法包括以下步骤：

34、s1.将四甲基苯酚或2,3-萘二酰亚胺与含有胶体金或纳米银颗粒的水溶液充分混合孵育，固液分离后洗涤沉淀，得到四甲基苯酚或2,3-萘二酰亚胺标记的金属纳米颗粒；

35、s2.活化步骤s1制得的四甲基苯酚或2,3-萘二酰亚胺标记的金属纳米颗粒上的羧基，得到活化金属纳米颗粒；

36、s3.将抗体与步骤s2制得的活化金属纳米颗粒混合孵育后固液分离并取沉淀，洗涤沉淀，得到偶联抗体的探针；

37、s4.封闭步骤s3制得的偶联抗体的探针后，纯化产物，得到拉曼检测探针。

38、优选地，步骤s1中，将四甲基苯酚或2,3-萘二酰亚胺与纳米银颗粒水溶液充分混合孵育。

39、更优选地，步骤s1中，将1mm四甲基苯酚或1mm 2,3-萘二酰亚胺与纳米银颗粒水溶液充分混合孵育。

40、最优选地，步骤s1中，1mm四甲基苯酚或1mm2,3-萘二酰亚胺与纳米银颗粒水溶液的体积比为1：50。

41、优选地，步骤s2中，将步骤s1制得的四甲基苯酚或2,3-萘二酰亚胺标记的金属纳米颗粒与dmsa充分混合孵育后，再加入edc和nhs的混合液，充分混合孵育后纯化产物，得到活化金属纳米颗粒。

42、更优选地，步骤s2中，将步骤s1制得的四甲基苯酚或2,3-萘二酰亚胺标记的金属纳米颗粒与dmsa充分混合孵育后，再加入150mm edc和30mm nhs的混合液，充分混合孵育后纯化产物，得到活化金属纳米颗粒。

43、最优选地，步骤s2中，所述150mm edc和30mm nhs混合液中150mm edc和30mm nhs的体积比为1:1。

44、优选地，步骤s3中，所述抗体为包被抗体。

45、更选地，步骤s3中，所述包被抗体与活化金属纳米颗粒的体积比为5～100:1优选地，步骤s4中，使用bsa封闭步骤s3制得的抗体偶联微球。

46、更优选地，步骤s4中，使用5％bsa封闭步骤s3制得的抗体偶联微球。

47、优选地，步骤s4中，所述抗体为包被抗体。

48、所述的拉曼检测探针在非疾病治疗或诊断为目的的免疫检测中的应用也应在本发明的保护范围之内。

49、优选地，所述非疾病治疗或诊断为目的的免疫检测为心肌损伤标志物的检测。

50、更优选地，所述心肌损伤标志物为myo、ctni和/或ck-mb中的一种或几种。

51、一种免疫检测组合物，所述免疫检测组合物中包含所述偶联有抗体的微球和所述拉曼检测探针。

52、优选地，所述免疫检测组合物用于非疾病治疗或诊断为目的的免疫检测为心肌损伤标志物的检测。

53、更优选地，所述心肌损伤标志物为myo、ctni和/或ck-mb中的一种或几种。

54、优选地，所述偶联有抗体的微球所偶联的抗体为标记抗体，所述拉曼检测探针所偶联的抗体为包被抗体。

55、一种检测系统，所述检测系统中含有所述偶联有抗体的微球、所述拉曼检测探针和微流控芯片，所述微流控芯片设置有若干个封闭通道，所述封闭通道为通过微流体通道依次连接的进样口、任意数量的检测腔室和出样口；所述检测腔室内填充有所述偶联有抗体的微球。

56、优选地，所述偶联有抗体的微球所偶联的抗体为标记抗体，所述拉曼检测探针所偶联的抗体为包被抗体。

57、优选地，所述微流控芯片的材料为聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、硅或玻璃。

58、更优选地，所述微流控芯片包括顶层检测层和底层基板，微流控芯片的顶层检测层设置有微流体通道、检测腔室、进样口和出样口，底层基板为平板。

59、最优选地，所述微流控芯片包括顶层检测层和底层基板，顶层检测层的材料为聚二甲基硅氧烷。

60、进一步最优选地，所述微流控芯片包括顶层检测层和底层基板，底层基板采用的材料为聚二甲基硅氧烷、硅或玻璃。

61、优选地，所述微流控芯片设置有两个独立的封闭通道，分别用于检测待测样品与标准品溶液。

62、优选地，所述检测腔室的深度比偶联有抗体的微球的粒径大5～30nm，所述微流体通道的深度与宽度比偶联有抗体的微球的粒径小5～30nm。

63、更优选地，所述检测腔室的深度比偶联有抗体的微球的粒径大10nm，所述微流体通道的深度与宽度比偶联有抗体的微球的粒径小10nm。

64、所述检测系统在非疾病治疗或诊断为目的的免疫检测中的应用也应在本发明的保护范围之内。

65、优选地，所述非疾病治疗或诊断为目的的免疫检测为心肌损伤标志物的检测。

66、更优选地，所述心肌损伤标志物为myo、ctni和/或ck-mb中的一种或几种。

67、所述微流控芯片的制备方法也应在本发明的保护范围之内，所述微流控芯片的制备方法包括以下步骤：

68、s1.制备掩膜版，掩膜版图案包括通过微流体通道依次连接的进样口、任意数量的检测腔室和出样口；所述进样口、微流体通道、检测腔室与出样口之间形成封闭通道，并且掩膜版设置有含有若干个封闭通道；

69、s2.洗涤硅片后旋涂光刻胶，得到匀胶后硅片；

70、s3.干燥步骤s2得到的匀胶后硅片，覆盖步骤s1制得的掩膜版，光刻处理，得到光刻完成硅片；

71、s4.干燥步骤s3制得的光刻完成硅片后置于显影液显影1～2min，显影后洗涤干燥，得到阳膜；

72、s5.硅烷化处理步骤s4制得的阳膜，倒模后固化，得到带有通道图案的顶层检测层；

73、s6.洗涤步骤s5制得的顶层检测层，与底层基板封接后，在检测腔室内填充所述偶联有抗体的微球，制得微流控芯片。

74、优选地，步骤s2中，使用piranha洗剂洗涤硅片，

75、优选地，步骤s2中，所述光刻胶为负性su-8胶或负性pspi。

76、优选地，步骤s3中，所述光刻处理的条件为：365nm紫外光下曝光90s。

77、优选地，步骤s3中，90～95℃烘烤1～2min干燥步骤s2得到的匀胶后硅片。

78、优选地，步骤s4中，90～95℃烘烤1～2min干燥步骤s3制得的光刻完成硅片。

79、优选地，步骤s4中，显影液为丙二醇单甲基醚乙酸酯或二甲基乙酰胺。

80、作为具体实施的参考，步骤s5中所述倒模后固化步骤为将pdms与pdms固化剂混合均匀后铺匀在培养皿中，将硅烷化处理后的步骤s5制得的阳膜图案面朝上放入培养皿中，向培养皿中加入pdms至完全覆盖阳膜，室温静置2h后，将培养皿置于75℃环境中反应2h后，将带有通道图案的pdms全部切下，得到带有通道图案的顶层检测层。

81、一种用于非疾病治疗或诊断为目的的免疫检测的试剂盒，所述试剂盒中包括所述检测系统。

82、作为具体实施的参考，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

83、s1.根据待测目标的种类和数量，选择对应检测腔室数量的微流控芯片，所述微流控芯片的检测腔室中分别填充不同种类的所述偶联有抗体的微球，所述抗体为待测目标的标记抗体，获得微球填充的微流控芯片；

84、s2.将待测样品与所述拉曼检测探针充分混合孵育，制备得到样品混合物，所述拉曼检测探针偶联的抗体为用于检测待测目标的包被抗体；

85、s3.将待测目标标准品与所述拉曼检测探针充分混合孵育，制备得到标准品溶液混合物；

86、s4.将步骤s2制得的样品混合物注入步骤s1制得的微球填充的微流控芯片的进样口中，使样品混合物充满封闭通道，同时，将步骤s3制得的标准品溶液混合物注入步骤s1制得的微球填充的微流控芯片的另一个封闭通道的进样口中，使标准品溶液混合物充满微流控芯片中的该封闭通道，得到引入待测样品及标准品的微流控芯片；

87、s5.步骤s4制得的引入待测样品及标准品的微流控芯片避光孵育10～30min后，洗涤微流控芯片中的封闭通道，去除洗涤液；

88、s6.使用拉曼测试法检测步骤s5制得的待检测微流控芯片中不同检测腔室的样品浓度。

89、优选地，步骤s1中，所述待测目标为myo、ctni和/或ck-mb中的一种或几种。

90、作为具体实施的参考，步骤s1中，待测目标为myo、ctni和ck-mb三种心肌损伤标志物时，选择含有两个封闭通道且每个封闭通道均含有三个检测腔室数量的微流控芯片，检测腔室中分别填充有偶联myo抗体的微球、偶联ctni抗体的微球或偶联ck-mb抗体的微球。

91、优选地，步骤s2中，所述待测样品与偶联有待测目标包被抗体的所述拉曼检测探针的体积比为1:1。

92、更优选地，步骤s2中，所述充分混合孵育为37℃避光混合孵育5min，制备得到血清样品混合物。

93、优选地，步骤s3中，待测目标标准品与偶联有待测目标包被抗体的所述拉曼检测探针的体积比为1:1。

94、更优选地，步骤s3中，所述充分混合孵育为37℃避光混合孵育5min，制备得到标准品溶液混合物。

95、优选地，步骤s4中，使用外接芯片动力装置将步骤s2制得的样品混合物注入步骤s1制得的微球填充的微流控芯片的进样口中

96、更优选地，所述外接芯片动力装置为微量注射泵或一次性注射器。

97、优选地，步骤s5中，步骤s4制得的引入待测样品及标准品的微流控芯片避光37℃孵育10min。

98、优选地，步骤s5中，使用外接芯片动力装置将步骤s2制得的样品混合物注入步骤s1制得的微球填充的微流控芯片的进样口中

99、更优选地，所述外接芯片动力装置为微量注射泵或一次性注射器。

100、优选地，步骤s5中，拉曼测试条件为：物镜50×，波长785nm，功率5mw，测量时间10s。

101、更优选地，步骤s5中，针对不同的待测样品，分别绘制标准溶液的拉曼谱图和样品溶液的拉曼谱图，标准溶液的拉曼谱图用于校准标准曲线，样品溶液的拉曼谱图用于计算校准标准曲线中的样品浓度。

102、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

103、(1)本发明提供的利用微球填充的微流控芯片检测生物标志物的方法，相对于传统利用大型仪分析而言，不仅缩短了检测时间，简化操作步骤，而且本发明请求保护的微流控芯片携带方便，适用于快速现场分析，所述利用微球填充的微流控芯片检测生物标志物的方法可以定性检测生物标志物，也可定量检测生物标志物。

104、(2)本发明的微流控芯片可以同时实现多种生物标志物的检测，即在多种生物标志物混合均匀的状态下，每一个检测腔室填充表面负载不同抗体的微球，只需要分别检测各自通道内的标志物，即可一步定性或定量检测多种生物标志物，相较于传统方法或者其他微流控检测的方法更快速有效。

105、(3)本发明的微流控芯片填充了偶联有抗体的微球，可以扰乱液体样品的层流，提高传质效率，增加免疫亲和反应的接触面积，大大增强抗体与靶蛋白的结合，放大拉曼信号，显著提高检测灵敏度和效率。于此同时，连接金属纳米颗粒的拉曼检测探针与偶联有抗体的微球结合，使双金纳米颗粒与抗体抗原一起形成夹心结构，产生对拉曼信号具有增强作用的“热点”，能够进一步提高检测的特异性和灵敏度。

106、(4)本发明所述微球填充的微流控芯片的制备工艺简单，反应条件温和，具有制备成本低，安全系数高的优点，在制备微流控芯片过程中，可根据填充的微球粒径大小灵活调整内部的检测腔室和微流体通道的深度及宽度，达到防止微球被液体冲走的同时防止微球堆积的效果。