专利名称：抗食管癌细胞核仁抗原单抗及食管癌诊断试剂及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种诊断试剂及其制备方法，特别是抗食管癌细胞核仁单克隆抗体及食管癌诊断试剂及其制备方法。
与肿瘤生长有关的核仁蛋白研究是肿瘤研究的重要组成部分，核仁蛋白成分分析显示，正常核仁的一些重要蛋白质在癌细胞不复存在，而癌细胞核仁出现了一些正常的细胞所没有的蛋白质，称为肿瘤细胞核仁抗原(TNA)，其中只见于人恶性肿瘤细胞者，又称为人恶性肿瘤相关核仁抗原(HMNA)。国内外尚未见用食管癌核基质为免疫原制备抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体的报道。
食管癌是我国最为常见和危害严重的恶性肿瘤之一。目前，食管癌的诊断以食管拉网、内窥镜检查方法为主，缺乏食管癌早期诊断的方法，以这两种检测方法诊断，一经确诊已属晚期，五年存活率低，疗效很差，因为很多病人在作出诊断之前肿瘤已经转移。
本发明的目的就是为了克服目前食管癌无早期诊断方法，一经发现已属肿瘤晚期的缺点，提供一种抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体及能早期诊断食管癌的诊断试剂及其制备方法。
本发明是这样实现的。
本发明先制备抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体，在此基础上制备食管癌的诊断试剂。
一、抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体制备1．食管癌细胞核基质的提取将食管癌组织用预冷0．01MPH7．4PBS(磷酸盐缓冲液)浸过，洗去残留血迹，用手术剪，在冰浴上将组织剪碎，用PBS悬浮，置玻璃匀浆器中，匀浆3～5分钟，悬液通过不锈钢网，离心收集细胞，4℃800g离心10分钟，去上清，加入10倍于沉淀体积的提取液A(0．25M蔗糖，100mMNaCl，50mMKCl，20mMTris-HCl，1mMPMSF，1％NP-40，PH7．4即0．25摩尔蔗糖，100毫摩尔氯化钠，50毫摩尔氯化钾，20毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1毫摩尔苯基甲基磺酰基氟化物，1％NP-40，pH为7．4)悬浮后置于30毫升玻璃匀浆器中，冰浴中匀浆5-10分钟，取少量悬液于干净玻璃片上，用0．1％亚甲基蓝染色，加盖玻片镜下观察，当有大量细胞核游离(90％以上)时，将悬浮液缓慢沿着管壁加入装有四分之一管提取液B(0．5M蔗糖，其余组分同提取液A)垫底的Eppdrof管中，4℃400g离心10分钟，小心去除上清，将沉淀转移至含有10毫升提取液C(2MNaCl，0．01MTris-HCl，10mMPMSF，0．02mM2-ME，pH值7．4即2摩尔氯化钠，0．01摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸，10毫摩尔苯基甲基磺酰基氟化物，0．02毫摩尔二巯基乙醇，pH值为7．4)的玻璃匀浆器内，缓慢抽提至细胞核悬液不再粘稠，约2小时，将悬浮液缓慢加入有三分之一管提取液D(1．8M蔗糖，其余组分同提取液C垫底的塑料离心管中，4℃95000g离心100分钟，小心去除上清，用提取液E(0．01MTris-HCl，0．01MNaCl，3mMMgCl2，0．5mMPMS，PH7．4即0．01摩尔三羟甲基甲烷-盐酸，0．01摩尔氯化钠，3毫摩尔二氯化镁，0．5毫摩尔苯基甲基磺酰基氟化物，pH值为7．4)悬浮沉淀，测定蛋白含量后，分装-20℃保存备用。
2．杂交瘤细胞株的建立材料与方法(1)鼠骨髓瘤细胞鼠骨髓瘤细胞(SP2／0-Ag14)，用含15％小牛血清的RPMI1640培养基传代，选对数生长期、形态好、活细胞数在95％以上的细胞供融合用。
(2)免疫脾细胞取食管癌核基质100ug与不完全佐剂均匀混合，给Balb／c小鼠双侧足垫免疫注射，初次免疫后第12天再取100ug核基质，同法注射，加强免疫后第三天，取腘窝淋巴结制成细胞悬液，用于融合。
(3)腹腔细胞的制备应用0．15M枸橡酸-PBS(PH7．2)溶液，注入Balb／c小鼠腹腔5-6ml后，反复轻揉腹部，抽出腹腔洗液置冰浴中，离心去上清，加入培养液悬浮细胞分种于96孔板。
(4)杂交瘤细胞的产生取淋巴细胞2×107与骨髓瘤细胞5×106于50ml的尖底沉淀管中混合，离心沉淀1000转／分×10分钟，去上清，慢慢滴加50％聚乙二醇(分子量4000)0．5ml，1分钟内加完，在37℃静置90秒，离心沉淀1000转8分钟，弃上清，将细胞悬于HAT(即次黄嘌呤hypoxanthine，氨基蝶呤aminopterin，胸腺嘧啶核苷thymidime)培养基中，分种于有鼠腹腔细胞作饲养细胞的塑料板中，置37℃5％CO2恒温箱培养，隔天换液，一周后改换HT(次黄嘌呤，胸腺嘧啶核苷)培养基，至杂交瘤细胞长至孔底1／5-1／4时，取上清进行免疫组化检测--LSAB法，按试剂盒说明进行，特异性阳性孔用有限稀释法克隆。
3．单克隆抗体特性鉴定(1)单克隆抗体纯化将杂交瘤细胞培养上清，采用中性盐沉淀法，具体过程为向杂交瘤细胞培养上清滴等加体积PH7-8的饱和硫酸铵(分析纯)溶液，边加边搅拌，静置4-6小时后离心，在4℃20000g离心20分钟，沉淀物用半饱和硫酸铵溶液洗两次后，将沉淀物溶在少量PBS中后，直接对PBS充分透析备用。
(2)免疫组化检测将初步纯化的单抗作为第一抗体与食管癌，正常食管，其他肿瘤的冰冻切片以及与食管癌细胞和其他癌细胞抗原片进行免疫组化检测。
(3)免疫印迹分析，采用常规的免疫印迹分析法，免疫印迹(Western blot)食管癌组织核基质和正常食管组织核基质，经SDS-PAGE(Sodium Dadecyl Sulfate，SDS，十二烷基硫酸钠；Polyacrylamid Gel Electrophoresis，PAGE，聚丙烯酰胺凝胶电泳)后用Bio-rad微型转移电泳装置，并按Towbin等方法，将其从凝胶电转印至硝酸纤维素膜，电转印条件4℃、40V、5h，然后将转印后的硝酸纤维素膜取出，丽春红染色，观察转印效果，随后洗去丽春红，用3％BSA(Bovine Serum Alumin，BSA牛血清白蛋白)封闭37℃1小时，加初步纯化的单克隆抗体(1∶5稀释)，4℃孵育过夜，用0．01M PBS洗3次，每次5分钟，加HRP-GAM IgG(Horseradishperoxidase，HRP，Goat Anti Mouse，GAM，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠免疫球蛋白G)1∶100稀释，37℃1小时，洗涤同前，洗涤后显色，用HRP的底物4-氯-1-奈酚，5分钟内完成，显色满意后，用蒸馏水冲洗终止反应，待膜干燥后，立即拍照。
食管癌细胞核仁单克隆抗体的免疫组化检测结果为有一细胞株1-7／E能与人食管癌和其他癌的细胞核仁起反应，而不与正常食管上皮细胞及其他细胞核仁起反应。免疫印迹分析表明，在食管癌蛋白组织41KD处可见一着色带，而正常食管蛋白对照组未见此条带。上述结果表明，该细胞株1-7／E是抗人肿瘤相关核仁抗原的单克隆抗体。
单抗Ig类或亚类鉴定，结果表明该单抗重链为IgM，轻链为K链。
二、食管癌诊断试剂及其制备一)食管癌诊断试剂采用试剂盒的方式，试剂盒中，试剂包括(1)过氧化物酶标记的抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体；(2)抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体；(3)酶的底物邻苯二胺(OPD)；(4)底物溶液为PH5．0磷酸盐柠檬酸缓冲液；(5)2摩尔浓度硫酸溶液。
试剂盒中还可以包括酶标板，可采用聚苯乙烯微量板(40孔或96孔板)。
二)食管癌诊断试剂的制备1．溶液的配制硫酸溶液的配制按常规方法，底物溶剂pH5．0磷酸盐柠檬酸缓冲液的配制按常规方法，临用时，将底物OPD溶解至底物溶剂中即可。
2．酶标抗体的制备(1)缓冲液①包被液在碱性、低离子条件下，对蛋白吸附到载体上较好，一般采用pH9．6的碳酸缓冲液。配方为NaHCO32．93g、Na2CO31．59g，蒸馏水加至1000ml。为不使该液体pH值降低，须密闭4℃保存，且一次配制应用期不超过一周。
②稀释液采用含Tween20的磷酸缓冲液(PBS pH7．4)。以减少非特异性物质在固相载体上的吸附。配方为NaCl 8g，Na2HPO4·12H2O 2．9g，KH2PO40．2g，KCl 0．2g，Tween20 0．5ml临用前加1％BSA，蒸馏水加至1000ml。
③洗涤液普通使用pH7．4 Tris-HCL溶液。配方为将Tris2．42g溶解于蒸馏水80ml后用1N HCL调pH至7．4，加Tween 200．5ml，补加蒸馏水至1000ml。
④底物溶液对应于辣根过氧化物酶(HRP)，所用底物为磷苯二胺(OPD)，底物溶液为pH5．0磷酸盐-柠檬酸缓冲液。配方为0．2mol／L Na2HPO4(28．4g／L)溶液2．57ml，0．1mol／L柠檬酸(19．2g／L)溶液2．43ml，3％H2O20．015ml，OPD4mg，蒸馏水5ml。临用前配制。
⑤显色底物为邻苯二胺，显深桔黄色，测定波长为492nm，2mol／L硫酸终止反应。
(2)酶的选择及标记方法选酶标准高度特异活性；室温下稳定；来源方便；价廉。选取酶为辣根过氧化物酶(HRP)，从植物辣根中提取的，由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合而成。分子量约为40000，由多个具有相同的辅基和类似的分子量的同功酶组成。
HRP与蛋白质分子有机的结合，是采用化学或免疫学的方法。HRP是一种糖蛋白，它的表面有8条碳水化合物链，约占HRP重量的18％，构成HRP的外壳。糖链不影响酶活性。先用过碘酸钠氧化HRP上的碳水化合物基团，使HRP形成为有多个醛基的“聚合物”--HRP-CHO。在适当条件下，让“激活”的HRP的醛基和蛋白质分子的自由氨基反应。然后用硼氢化钠还原成稳定的酶结合物。
底物为邻苯二胺(ortho-phenylenediamine，OPD)，酶与底物反应的产物呈橙色，光吸收峰为495nm，目测或用分光光度计测均获满意结果。
酶标方法A．过碘酸钠法
a．首先将要与HRP接触的玻璃器皿，用1mol／L的NaOH冲洗，以消除有害作用。
b．将5mgHRP溶于新鲜配制的1ml 0．3mol／L pH8．1的NaHCO3溶液中。
c．电磁搅拌下，滴加0．1ml氟二硝基苯无水乙醇溶液，室温避光搅拌1小时，用以封闭HRP分子中的α和ε氨基和羟基，避免酶的本身交联。
d．加1ml 0．16mol／L NaIO4水溶液，室温避光处轻搅拌30分钟。溶液的颜色变为黄绿色(如不出现黄绿色，效果不好。)e．加1ml 0．16mol／L乙二醇，室温避光处轻搅拌1小时，以中止氧化反应。
f．上述各溶液装透析袋对1000ml 0．01mol／L pH9．5碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，中间换液3次。
g．按酶和抗体之比为1∶1．5-2，于透析后的HRP溶液中，加7．5-10mg纯化Ig，此处即为抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体，室温避光处轻搅拌2-3小时。
h．加5mgNaBH4，4℃放置3小时或过夜。
i．装透析袋，对0．O1mol／L pH7．4的PBS透析24小时，换液3次。如出现沉淀物，低速离心去除。
j．通过Sephadex-G100层析柱除去游离HRP或用饱和硫酸铵去除游离HRP。最后分装放-20℃冻存。
过碘酸钠法的交联率很高，约70％的HRP与99％免疫反应物结合，反应的敏感性超过戊二醛法交联的酶结合物，二者的敏感性相差一倍以上。
B．戊二醛法a．一步法①将5mg抗体球蛋白溶于1ml 0．1mol／L pH6．8的PBS液中；抗体即为抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体，②慢慢搅拌下加入12mgHRP，使充分溶解；③在室温搅拌下滴加0．5ml 1％的戊二醛水溶液；④室温放置2小时；⑤在4℃对PBS液透析过夜，换液3次。
b．二步法①将10mgHRP溶解在0．2ml含1．25％戊二醛的0．1mol／L pH6．8的PB液中，在室温放置18小时；②透析物通过Sephadex-G25柱(40×2cm)过滤，柱用0．15mol／L NaCl平衡，洗脱，以除去未反应的戊二醛。然后，将含有棕色的各份洗脱液合并；③将合并液用超滤膜或冰箱吊干，冷室吹干浓缩至1ml，避免用聚乙二醇浓缩；④将1ml含5mg抗体球蛋白的0．15 mol／L生理盐水液加到上述浓缩液中，抗体即为抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体；⑤再加入0．1ml 1mol／L pH9．5的碳酸盐缓冲液，在4℃放置24小时；⑥然后加入0．2mol／L的赖氨酸溶液0．1ml，以封闭被戊二醛活化的酶的残留活性基团；⑦室温放置2小时，对PBS透析过夜。
以上一步和二步法透析的结合物可用硫酸铵沉淀液法提纯。
提取方法透析后，将在4℃预冷的中性饱和硫酸铵溶液，按1∶1(V／V)的比例，在搅拌下缓慢加入结合物中，在4℃放置30分钟。然后以3000g离心15分钟，弃上清液，沉淀物用50％饱和硫酸铵洗2次，最后溶解在小量生理盐水中，在4℃对PBS透析24小时，或在4℃以1800 r／min离心30分钟，去除微量沉淀，分装冻存备用。
二步法比一步法交联率高，抗原(抗体)免疫活性损失小，敏感性高，但交联程序比一步法复杂。
(3)酶标记的抗体纯化纯化方法见前，同单克隆抗体的纯化方法。
(4)结果判定采用酶联免疫法(ELISA)，对ELISA结果的判定，常用的有3种方法。
A．目测法，一般加底物作用后，肉眼下出现颜色的为阳性，无色为阴性。
B．以标本OD值＞阴性对照平均OD值加2-3个标准差作为阳性结果的阈值。
C．以P／N≥2．1为阳性，P／N值＜2．1而≥1．5可疑，P／N值＜1．5为阴性。
三)食管癌的诊断方法(1)于微量酶标反应板每孔加100ul纯化的1-7／E McAb，置4℃过夜后用洗涤液洗3次。
(2)每孔加入不同稀释度的待测血清100ul，每份标本重复双份，每块反应板同时做阴性和试剂空白对照各2孔。放37℃2小时，用洗涤液洗4次。
(3)每孔加适当稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的1-7／McAb 100ul，放37℃2小时，用洗涤液洗4次。
(4)每孔加OPD底物溶液100ul，室温暗处放10～20分钟显色。
(5)每孔加2N H2SO450ul，终止酶反应。
(6)结果判断用分光光度计492nm测定，如P／N≥2．1，结果为阳性。
应用抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体，可用来检测人肿瘤细胞相关核仁抗原的存在，作为判断恶性肿瘤的标志；也可用来在肿瘤患者治疗前后，应用该抗体检测人恶性肿瘤相关核仁抗原阳性细胞比率的变化，对治疗效果及预测复发提供依据。食管癌诊断试剂同样能对恶性肿瘤治疗效果的评价提供敏感方法和指标，并可用来进行对恶性肿瘤的流行病学调查。其诊断结果准确，诊断时间早。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1一、食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体及其制备。
1．其中食管癌细胞核基质的提取与杂交瘤细胞株的建立方法同前。
2．细胞株的接种和培养按常规细胞培养方法大量增殖1-7／E细胞，离心细胞培养液，收集培养液上清，并将细胞注入Balb／c小鼠腹腔，制备腹水，收集腹水，可获得大量单克隆抗体。
具体操作步骤为将杂交瘤细胞株1-7／E接种到15％血清RPMI-1640培养基中，置37℃5％CO2孵育箱中培养，待大量增殖细胞后，收集培养液，离心沉淀，收集上清液，用PBS将细胞悬浮计数，按每只鼠腹腔接种200万细胞，经10天左右，观察鼠有腹水时，立即收集腹水，按与细胞培养上清液相同的方法纯化单克隆抗体，具体见3。
3．单克隆抗体的操作过程同前。
4．免疫组化检测免疫组化的反应结果见表1、表2、表3。
表1．单抗在食管癌和正常食管组织冰冻切片中的免疫组化检测结果。
表2．单抗在其他肿瘤组织冰冻切片中的免疫组化检测结果
表3．单抗在各种肿瘤细胞株抗原片中的免疫组化检测结果
二、食管癌诊断试剂及其制备1．食管癌诊断试剂采用试剂盒的方式，试剂盒中包括(1)过氧化物酶标记的抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体；(2)抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体；(4)酶的底物邻苯二胺OPD；(5)底物溶剂为pH5．0磷酸盐柠檬酸缓冲液；(5)2摩尔浓度硫酸溶液。
试剂盒中还可以包括酶标板。
2．食管癌诊断试剂的制备方法同前。其检测方法为ELISA法。
食管癌诊断试剂对恶性肿瘤早期免疫学诊断和肿瘤治疗效果的评价提供了敏感的方法和指标，其结果与上述免疫组化结果相类，其检测准确率为100％。
本发明所涉及的食管癌诊断试剂盒也可以采用碱性磷酸酶做成酶标反应试剂盒。经融合后的1-7／E细胞可以采用富含牛视网膜蛋白的培养基培养，也可以采用其它培养基培养。
本发明不限于上述实施例。
权利要求
1．一种抗食管癌细胞核仁抗原单抗的制备，包括如下步骤(1)食管癌细胞核基质的提取；(2)杂交瘤细胞株的建立；(3)单克隆抗体提纯；其特征在于食管癌细胞核基质的提取过程为将食管癌组织用预冷0．01MPH7．4PBS浸过，洗去残留血迹，用手术剪，在冰浴上将组织剪碎，用PBS悬浮，置玻璃匀浆器中，匀浆3～5分钟，悬液通过不锈钢网，离心收集细胞，4℃800g离心10分钟，去上清，加入10倍于沉淀体积的提取液A即0．25M蔗糖、100mM NaCl、50mM KCl、20mM Tris-HCl、1mM PMSF、1％NP-40、PH7．4溶液悬浮后置于30毫升玻璃匀浆器中，冰浴中匀浆5-10分钟，取少量悬液于干净玻璃片上，用0．1％亚甲基蓝染色，加盖玻片镜下观察，当有大量细胞核游离即90％以上时，将悬浮液缓慢沿着管壁加入装有四分之一管提取液B即0．5M蔗糖、其余组分同提取液A的溶液垫底的Eppdrof管中，4℃400g离心10分钟，小心去除上清，将沉淀转移至含有10毫升提取液C即2M NaCl、0．01M Tris-HCl、10mM PMSF、0．02mM2-ME、pH值7．4溶液的玻璃匀浆器内，缓慢抽提至细胞核悬液不再粘稠，约2小时，将悬浮液缓慢加入有三分之一管提取液D即1．8M蔗糖、其余组分同提取液C的溶液垫底的塑料离心管中，4℃95000g离心100分钟，小心去除上清，用提取液E即0．01MTris-HCl、0．01MnaCl、3mMMgCl2、0．5mMPMS、PH7．4溶液中悬浮沉淀，测定蛋白含量后，分装-20℃保存备用；制备的单抗重链为IgM，轻链为K链，该单抗能与人食管癌上皮细胞和其它癌的细胞核仁起反应，而不与正常食管上皮细胞及其他细胞核仁反应。
2．一种抗食管癌细胞核仁抗原单抗的制备，采用细胞株的接种和培养的方法，具体为按常规细胞培养方法大量增殖1-7／E细胞，离心细胞培养液，收集培养液上清，并将细胞注入Balb／c小鼠腹腔，制备腹水，收集腹水，获得大量单克隆抗体。
3．一种食管癌诊断试剂，采用试剂盒的方式，试剂盒中包括(1)过氧化物酶标记的抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体；(2)抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体；(6)酶的底物邻苯二胺OPD；(7)底物溶剂为pH5．0磷酸盐柠檬酸缓冲液；(5)2摩尔浓度硫酸溶液。
4．根据权利要求2所述的食管癌诊断试剂，其特征在于试剂盒中有酶标板。
5．一种如权利要求2所述的食管癌诊断试剂的制备，包括(1)底物溶剂pH5．0磷酸盐柠檬酸缓冲液的配制；(2)硫酸溶液的配制；(3)过氧化物酶标记的抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体的制备，其特征在于过氧化物酶标记的抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体的制备选取辣根过氧化物酶，采用过碘酸钠法或一步法或二步法戊二醛法制备。
全文摘要
本发明涉及抗食管癌细胞核仁抗原单抗及食管癌诊断试剂及其制备方法。在制备了抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体后,进一步做成食管癌诊断试剂盒。应用抗食管癌细胞核仁单克隆抗体,可用来检测人肿瘤细胞相关核仁抗原的存在,作为判断恶性肿瘤的标志;也可用来在肿瘤患者治疗前后,应用该抗体检测人恶性肿瘤相关核仁抗原阳性细胞比率的变化,对治疗效果及预测复发提供依据。食管癌诊断试剂同样能对恶性肿瘤治疗效果的评价提供敏感方法和指标,并可用来进行对恶性肿瘤的流行病学调查。其诊断结果准确,诊断时间早。
文档编号G01N33/577GK1291656SQ9911712
公开日2001年4月18日 申请日期1999年10月8日 优先权日1999年10月8日
发明者刘乐和 申请人:中国医科大学科技开发部