专利名称：血管紧张素转换酶检测试剂及其应用和检测方法
技术领域：
本发明属生化技术及生物化学检验技术。
血管紧张素转换酶是一种膜结合糖蛋白，分子量为150000，含锌，属二肽羧基酶，能使血管紧张素I(十肽，由肾素转化而成)肽链C端的组氨酸和亮氨酸残基水解，形成具有增压作用的血管紧张素Ⅱ(八肽)，后者进一步使血管收缩、血压升高。血管紧张素转换酶也能使具有降压作用的舒缓激肽(九肽)脱去肽链C末端的苯丙氨酸和精氨酸残基而灭活。血管紧张素转换酶还能直接作用于肾上腺皮质，促进醛固酮分泌。因此，血管紧张素转换酶是肾素-血管紧张素-醛固酮系统以及缓激肽系统的重要调节因素，影响人体多种生理机能。
血管紧张素转换酶活性最早于1968年被测及，它广泛分布于全身各组织。心血管疾病的共同病理基础是血管紧张素转换酶升高，尤其是高血压病在亚临床阶段就已有ACE升高。体外定量测定血清中血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme，ACE)的活性，可作为心血管疾病的早期诊断、药物选择、疗效观察以及呼吸系统疾病如结节病、肺癌和肝胆疾病等的特异诊断指标。迄今，体外测定血管紧张素转换酶的方法有生物法、比色法、分光光度法、动力学法、放射性同位素法、荧光测定法及高压液相色谱法等。但其共同的不足是灵敏度低、检测时间长、所需检测样品量较大、不易在医疗机构普及等。
本发明的目的是提供一种血管紧张素转换酶检测试剂和使用该检测试剂检测血管紧张素转换酶活性的方法，使其具有简便、快速、灵敏、重复性好、所需血样量和检测试剂量少、适合于在全自动生化分析仪上应用、易于在医院推广等优点。
本发明提供的血管紧张素转换酶检测试剂是由呋喃酰基-L-笨丙氨酰甘氨酰甘氨酸(FAPGG)、坚固黄(Fast Y)、弱酸和除垢剂组成的组合物。其中弱酸可使用硼酸；除垢剂可使用胆酸。
本发明检测试剂及检测方法的原理是反应底物呋喃酰基-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸(2-furanacyloy1-L-phenylalanylglycylglycine，FAPGG)在血管紧张素转换酶作用下水解为呋喃酰基笨丙氨酸(FAP)和甘氨酰甘氨酸，呋喃酰基苯丙氨酸(FAP)进一步与显色物质合成染料坚固黄(Fast Y)反应生成黄色化合物，该黄色化合物在405nm处吸光度增加率与血管紧张素转换酶的活性成正比，检测波长405nm处吸光度的变化，即可得出血管紧张素转换酶的活性。
在使用硼酸产生弱酸性反应环境，使用胆酸作本发明检测试剂之染料显色反应的除垢剂时，本发明检测试剂用于检测时的水溶液浓度(每升检测试剂溶液中各组分的含量)为呋喃酰基-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸1．0-5．0mmol／L坚固黄0．5-2．0mmol／L硼酸 50-200mmol／L胆酸 5-2．0mmol／L本发明提供的血管紧张素转换酶活性检测方法，即将本发明检测试剂用于检测血管紧张素转换酶活性的方法，包括
①将反应底物呋喃酰基-L-笨丙氨酰甘氨酰甘氨酸在弱酸性和37℃条件下与待测血清(含血管紧张素转换酶)反应；②在除垢剂存在条件下使呋喃酰基-L-苓丙氨酰甘氨酰甘氨酸与特测血清(含血管紧张素转换酶)的反应产物进一步与合成染料坚固黄反应，生成黄色化合物；③在波长405nm处检测该黄色反应产物吸光度的变化(△A／分)；④再根据公式 得出血管紧张素转换酶活性。
其中弱酸性条件可由硼酸生成，除垢剂可使用胆酸。
本发明采用酶动力学方法测定样本中酶活性，具有简便、快速、灵敏、重复性好的优点。克服了现有技术灵敏度较差的缺点，其灵敏度高于现有技术一个数量级；现有紫外分析方法灵敏度ε为0.5434，而本发明检测技术灵敏度ε为7000；与现有的紫外分析方法比较，其检测所需时间夫为减少，由原来的30至60分钟，减为5至10分钟，可以满足临床上简便快速的需要，且所需血样量大为减少，紫外分析方法需血样为0．1ml，而本发明方法仅需300μl；本发明技术适合于在Falcor全自动生化分析仪上应用，该仪器在医院装备较广，故本发明技术易于推广，对高血压病的旱期诊断、鉴别诊断、药物选择、疗效观察具有十分重要的实用价值。同现有同类技术的血管紧张素转换酶试剂及检测方法相比，本发明也是使用PAPGG为底物，然而本发明血管紧张素转换酶试剂使用了显色物质坚固黄，使监测波长由345nm移到405nm，因而可以用普及较广的生化分析仪(如法国产Falcor全自动生化分析仪)替代传统方法使用的紫外分析仪进行监测，并使血管紧张素转换酶试剂的测定底物减少，避免了仪器本身对底物浓度的限制，使FAPGG浓度能满足使V接近Vmax；能有效避免FAP在345nm处光密度抵消作用。
实施例1．制备检测试剂本发明检测试剂由反应底物--呋喃酰基-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸显色物质--坚固黄产生弱酸性反应环境的物质--硼酸除垢剂--胆酸组成。
用蒸馏水或去离子水按以下浓度(以每升检测试剂溶液中各组分的含量表示)配制用于检测的本发明试剂溶液呋喃酰基-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸1．5mmol／L坚固黄1mmol／L硼酸 80mmol／L胆酸 8mmol／L本发明检测试剂复溶后2-8℃可稳定-周，室温下稳定24小时。
2．检测操作取待测血清30μl，加入上述检测试剂溶液300μl，在37℃条件下作用1分钟，在法国产Falcor全自动生化分析仪上405nm处连续记录吸光度的变化(ΔA／分)，(反应时间3分钟)。
3．计算及正常值根据公式即可得出所测结采[ACE(U/L)] 式中TV=反应总体积SV=样本体积
ε=FAPGG微摩尔吸光系数d=光径(cm)线性范围0-300U/L正常值8-52U／L；超出上限为异常。
精密度批内CV＜1．2％；批间CV＜3．4％根据本实验室条件，可选用手工测定或全自动生化分析仪，修改实验参数使试剂∶样本=9∶1；溶血、黄疸对实验结果有影响。
权利要求
1．一种血管紧张素转换酶检测试剂，是由呋喃酰基-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸、坚固黄、弱酸和除垢剂组成的组合物。
2．根据权利要求1所述的血管紧张素转换酶检测试剂，其特征在于所说的弱酸为硼酸。
3．根据权利要求1、2所述的血管紧张素转换酶检测试剂，其特征在于所说的除垢剂为胆酸。
4．一种血管紧张素转换酶检测试剂，它是含有权利要求1至3中任一项所述物质的溶液。
5．根据权利要求4所述的血管紧张素转换酶检测试剂，在权利要求2和3限定下该检测试剂溶液中各组分的浓度(每升检测试剂溶液中各组分含量)为呋喃酰基-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸1．0-5．0mmol／L坚固黄0．5-2．0mmol／L硼酸 50-200mmol／L胆酸 5-20mmol／L
6．根据权利要求5所述的血管紧张素转换酶检测试剂，其特征在于各组分的浓度(每升检测试剂溶液中各组分含量)为呋喃酰基-L-笨丙氨酰甘氨酰甘氨酸1．5mmol坚固黄 1mmol硼酸80mmol胆酸8mmol
7．权利要求1至6中任一项所限定的血管紧张素转换酶检测试剂用于检测血管紧张素转换酶活性。
8．一种血管紧张素转换酶活性检测方法，包括将反应底物呋喃酰基-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸在弱酸性和37℃条件下与待测血清(含血管紧张素转换酶)反应，其特征在于在除垢剂存在条件下使呋喃酰基-L-笨丙氨酰甘氨酰甘氨酸与待测血清(含血管紧张素转换酶)的反应产物进一步与合成染料坚固黄反应，生成黄色化合物，在波长405nm处检测该黄色反应产物吸光度的变化(ΔA／分)；再根据公式ACE 计算血管紧张素转换酶活性。
9．根据权利要求8所述的血管紧张素转换酶活性检测方法，其特征在于所说的除垢剂为胆酸。
10．根据权利要求8所述的血管紧张素转换酶活性检测方法，其特征在于所说的弱酸性条件由硼酸生成。
全文摘要
本发明提供的血管紧张素转换酶检测试剂,是由坚固黄、呋喃酰基－L－苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸、弱酸和除垢剂组成的组合物,弱酸和除垢剂可分别由硼酸、胆酸构成;本发明采用酶动力学方法测定样本中酶活性,具有简便、快速、灵敏、重复性好、所需血样量少等优点,其灵敏度高于现有技术一个数量级,检测时间5至10分钟,可以满足临床上简便快速的需要,且适合于在Falcor全自动生化分析仪上应用。
文档编号G01N33/50GK1282793SQ99116569
公开日2001年2月7日 申请日期1999年7月28日 优先权日1999年7月28日
发明者艾学蛟, 邹光楣 申请人:武汉埃克玛生物技术有限公司