专利名称：性病的集成诊断芯片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种性病的集成诊断芯片以及这种芯片的制备方法。
性病是一种发病率较高，对人类健康危害极大的传染性疾病，常见的如淋病、梅毒、尖锐湿疣、软下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器疱疹、性病性淋巴肉芽肿、爱滋病等，更有部分癌症也是由性传播疾病引起。引起性病的病原微生物常见的包括淋球菌、梅毒螺旋体、单纯疱疹病毒、乳头瘤病毒、一些真菌、支原体、衣原体等类型，病原种类多，难以诊断和判定，故对它们的快速、有效的诊断对性病的监控、预防和治疗极为重要。为此，各国投入了大量的经费和人力进行这方面的研究，并且发展了一些诊断性病病原的物理、化学方法，物理方法一般是经过取样，实验室培养后镜检，程序复杂。常见的化学方法有ELISA测抗原或抗体，PCR测抗原基因等。但传统的免疫学方法都是首先将纯化的抗原或抗体与酶或其它标记物结合，再加相应的底物通过显色或特殊的仪器来测定其相应的抗原或抗体，这些方法化学计量关系较复杂，染料着色的程度和部位很难控制，操作烦琐，导致假阳性假阴性较多，成本也较高PCR方法由于符合率差等原因已被国家暂时取消。而且，所有这些方法都还有一大缺陷，就是效率低，一次只能测一种病原或几次才能鉴定出一种病原。而现实的情况是病人往往感染了几种病原，多种性病病原都能感染人体。传统的方法针对有限的几种病原进行检测，末免带有盲目性。为此，急需发展一种标准化的程序和方法能够一次性地诊断出受染微生物的种类和受染程度，便于正确、快速地采取治疗措施。
基因(或DNA)芯片技术的出现，使这道难题迎刃而解。基因芯片技术是一项可与计算机芯片技术媲美、具有划时代意义的革命性技术。基因芯片实质上是一种高密度的寡聚核苷酸(DNA探针)阵列，它采用在位组合化学、合成化学和微电子芯片的光刻技术，或者利用其它方法将大量特定序列的DNA探针有序地固定在玻璃或硅衬底上，它已能实现在1万平方厘米见方玻璃上固定40余万个寡聚核苷酸片段，每种探针的空间尺度可达10-20微米，在与待测样品DNA作用后，DNA芯片即可检测到大量相应的生命信息，用于基因识别、鉴定，以及基因突变和基因表达等。到目前为止，DNA芯片技术的出现不过几年时间，主要在两个方面进行了研究，一是用大量寡核苷酸探针来测定基因序列，使破解人类DNA编码的速度达到常规方法的25倍；二是开发了检测癌症患者P53基因突变的芯片。
本发明的目的在于提供一种性病的集成诊断芯片以及这种芯片的制备方法，利用这种芯片可对淋病、梅毒、尖锐湿疣、软下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器疱疹、性病性淋巴肉芽肿、爱滋病等传染性性病原微生物进行集成诊断，一次操作就可方便、快速、准确地完成上述几种性病的检测以及各自的感染程度等。
本发明的目的是这样实现的本发明的性病集成诊断芯片是在玻璃或硅片上固定有淋病、梅毒、尖锐湿疣、软下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器疱疹、性病性淋巴肉芽肿、爱滋病等性病病原的具有诊断意义的特征基因(单链)，或者固定用于PCR扩增这八种性病病原的引物。这八种性病原的分子生物学研究在国内外已有大量的报导，具有诊断意义的特征基因的序列已公布，这些特征基因(或其引物)可直接购买，也可利用分子生物学的基因操作实验技术提取。
首先将病人血清、黏膜或尿样中病原微生物的DNA提取出来作为模版，参照公布的基因序列设计引物，PCR或RT-PCR扩增目的基因，然后克隆到质粒载体上在大肠杆菌中扩增，酶切、纯化提取得到所需的特征基因。
玻璃或硅片先经过表面设计规划基因(探针、引物)分布，采用微电子光刻技术将表面刻制成所需的微坑阵列。
具体的技术方案如下一种性病集成诊断芯片，它是在玻璃或硅片上光刻有微坑阵列，这些阵列分为八个区域，依次在这些微坑中固定有淋病、梅毒、尖锐湿疣、软下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器疱疹、性病性淋巴肉芽肿、爱滋病等性病病原的具诊断意义的特征基因，或者是用于扩增它们的引物。
制备上述性病集成诊断芯片的方法先将玻璃或硅片采用微电子光刻成微坑阵列；用表面键合偶联活化剂对其进行活化处理，活化试剂为亲水性硅烷化试剂等。处理条件为常温，0.5～2.5小时。
依次将淋病、梅毒、尖锐湿疣、软下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器疱疹、性病性淋巴肉芽肿、爱滋病等性病病原的具诊断意义的特征基因或其引物转移到八个区域的微坑阵列中；用偶联剂经偶联反应将这些特征基因或其引物固定在芯片上；即得到本发明的性病集成诊断芯片。
基因或其引物固定时偶联反应条件为偶联剂(0.5～1.5％)+2-[N-吗啉]乙磺酸溶液，室温下12～36小时。
所用的偶联剂可为水溶性碳二亚胺、N-羟基瑚珀酰亚胺、或WOODWARD试剂等。
所得到的性病集成诊断芯片可采用电化学标记、化学发光标记、荧光标记等方法加以检验，标记试剂可为苄基紫晶、水溶性卟林、溴化乙啶、丫啶橙、荧光素。用电化学方法、激光诱导荧光/电荷耦合器件(CCD)配套诊断芯片的临床检测。
采用本发明的上述技术方案具有如下特点利用本发明的性病集成诊断芯片可通过一种材料、一次反应就能完成上述八种性病的检测诊断。而传统方法检测一种性病需要多次不同的反应才能确定。
利用本发明的性病集成诊断芯片进行性病诊断的准确率、符合率可达到98％以上，既可做到定性检测，也可做到定量检测。
本发明的性病集成诊断芯片的制造成本低，诊断时每检测的费用不高于传统方法的单项检测的费用。
近年来，性病在我国的流行已成为一个突出的社会问题，发病人数年年上升，发病地区也在不断扩大，对这类疾病的及时监控、预防和诊断极其重要，因此本发明应用前景广阔，具有极大的社会效率和经济效率。
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明实施例一种性病集成诊断芯片，它是在玻璃或硅片上光刻有微坑阵列，这些阵列分为八个区域，依次在这些微坑中固定有淋病、梅毒、尖锐湿疣、软下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器疱疹、性病性淋巴肉芽肿、爱滋病等性病病原的具诊断意义的特征基因。
制备上述性病集成诊断芯片的方法先将玻璃或硅片采用微电子光刻成微坑阵列；用表面键合耦联活化剂对其进行活化处理，活化条件为用亲水性硅烷化试剂常温下处理2小时。依次将淋病、梅毒、尖锐湿疣、软下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器疱疹、性病性淋巴肉芽肿、爱滋病等性病病原的具诊断意义的特征基因转移到八个不同区域的微坑阵列中，用交联剂经耦联反应将这些特征基因或其引物固定在芯片上即得到本发明的性病集成诊断芯片。
所用的交联剂为1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐。
偶联反应条件为1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(1％)+2-[N-吗啉]乙磺酸溶液(pH6.5)，室温下24小时。
权利要求
1.一种性病集成诊断芯片，其特征在于它是在玻璃或硅片上光刻有微坑阵列，这些点阵分为八个区域，依次在这些微坑中固定有淋病、梅毒、尖锐湿疣、软下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器疱疹、性病性淋巴肉芽肿、爱滋病等性病病原的具诊断意义的特征基因或其引物。
2.一种制备权利要求1所述的性病集成诊断芯片的方法，其特征在于先将玻璃或硅片采用微电子光刻成微坑阵列；用表面键合偶联活化剂对其进行活化处理，活化条件为依次将淋病、梅毒、尖锐湿疣、软下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器疱疹、性病性淋巴肉芽肿、爱滋病等性病病原的具诊断意义的特征基因或其引物转移到八个区域的微坑阵列中，用偶联剂经偶联反应将这些特征基因或其引物固定在芯片上，即得到本发明的性病集成诊断芯片。
3.按权利要求2所述的性病集成诊断芯片的方法，其特征在于所述的偶联反应条件为0.5～1.5％偶联剂+2-[N-吗啉]乙磺酸溶液，室温下12～36小时。
4.按权利要求2所述的性病集成诊断芯片的方法，其特征在于所述的偶联剂为水溶性碳二亚胺、N-羟基瑚珀酰亚胺或WOODWARD试剂。
全文摘要
本发明公开了一种性病的集成诊断芯片以及这种芯片的制备方法,它是在玻璃或硅片上光刻有微坑阵列,这些阵列分为八个区域,依次在这些微坑中固定有淋病、梅素、尖锐湿疣、软下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器疱疹、性病性淋巴肉芽肿、爱滋病等性病病原的具诊断意义的特征基因或其引物。这种芯片对性病的及时监控、预防和诊断极其重要,诊断操作简单、快速,而且准确率高,因此应用前景广阔,具有极大的社会效益和经济效率。
文档编号G01N33/48GK1271098SQ9911644
公开日2000年10月25日 申请日期1999年4月20日 优先权日1999年4月20日
发明者王业富, 庞代文 申请人:武汉大学