专利名称：抗TORCH－IgM型ELISA检测试剂盒的制作方法
抗TORCH-IgM型ELISA检测试剂盒是一项发明技术。该试剂盒是用于临床检测一组“TORCH”病原微生物的IgM型抗体，这一组病原微生物包括弓形虫(TOX)、风疹病毒(RUV)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒I、II型(SHVI、II)。孕妇若感染可导致流产、早产、死胎或胎儿畸形。IgM型抗体出现于现症感染患者，对于与优生优育密切相关的孕妇检查具有一定的实用价值。近年来北京、深圳、兰州等地先后有抗TORCH-IgM型ELISA间接法试剂盒问世，但是在实际应用中，普遍存在的是特异性不高，易出现假阳性，检测结果的模式不清晰，本底高，阴、阳性反差不明显，给直接目测带来不便且试剂盒不够稳定，重复性不理想，因此不能有效地应用于临床实验诊断。根据国内现有技术存在的缺点，我们采用一定的技术手段，使本试剂盒的特异性高于国内现有试剂盒，并使试剂盒在效期内保持较高度的稳定性。
科学地制定结果判定标准。被检血清中若有类风湿因子(RF)用ELISA间接法检测，可使IgM型抗体的检查出现假阳性，用试剂盒检测可显示不同程度的显色结果。本发明根据RF干扰显色的OD值(A值)，求出其A值平均值，即A(X)，把真阳性血清稀释到略高于这一A(X)稀释度，多次测定，求出稀释阳性血清(即弱阳性血清)的A(X)，使弱阳性血清的A(X)或其下限(X-2S即真阳性)大于RF A(X)上限(X+2S即假阳性)，其弱阳性的A(X)即为阳性判断值(cut-off值)，这样既考虑了RF干扰，又注意到低值阳性的检出，制定的cut-off值，使假阳性被剔除，真阳性不漏检。本发明判断标准定为RFA(X)+2S为0.178；TOX A(X)-2S为0.222；RUV A(X)-2S为0.195；CMVA(X)-2S为0.223；SHVI A(X)-2S为0.229；SHVII A(X)-2S为0.214。
有效地使用了自行研制的吸附剂。血清中的RF是IgM型的抗IgM自身抗体，它能与变性IgG或IgG-抗IgG免疫复合物结合。当用吸附剂稀释被检血清时，吸附剂中的抗人IgG与血清IgG，形成免疫复合物，此复合物与RF结合通过洗涤从液相中清除，从而可排除RF对检测的干扰，降低了假阳性的检出，另外吸附剂内又含有诸多高分子物质，使抗人IgG在吸附剂溶液中能在试剂盒效期内相对稳定，保持对RF的清除能力。
成功地采用了自行研制的稳定剂，本发明的稳定剂内含有高分子及脱水性物质，可使蛋白质免疫活性物在一定时期内保持稳定，当包被有病原微生物抗原的固相载体(聚乙二烯塑孔)经稳定剂处理后，则固相载体上的抗原稳定，免疫活性不消失。另外由于酶结合物稀释液中有高分子聚乙二醇，使酶结合物在稀释的溶液中仍然保持应有的活性。
本发明的优点或技术效果对假阳性的检出(试剂盒的特异性)RF干扰影响了ELISA间接法的特异性，现有技术对消除RF干扰不甚理想，常易出现假阳性，由于本发明采用了有效的吸附剂可吸附清除一部分RF，并科学地制定了结果判定标准，确定了cut-off值，这样既考虑了RF干扰，又注意到弱阳性的检出，使假阳性被剔除，真阳性不漏检，从而保证了本试剂盒高度的特异性。
用本试剂盒与进口试剂盒以及国内市售的同类产品检测有RF的血清15份，其中5份(11#15#17#20#24#)在本试剂盒中出现假阳性；4份(1#11#15#20#)在进口试剂盒中出现假阳性；8份(1#2#3#11#15#17#24#31#)在国内市售同类试剂盒中出现假阳性(表1)。
表1 假阳性检出(“+”假阳性、“-”阴性)TOXRUV CMV HSVI HSVII本品- - - - -1#国产+ + - - -进口- + + - -本品- - - - -2#国产- + + - -进口- - - - -本品- - - - -3#国产+ - - + +进口- - - - -本品+ + + + +11#国产+ + + + +进口+ + + + +本品+ + + + +15#国产- + + + +进口- + + + +本品+ - - - -17#国产+ - - - -进口- - - - -本品- + + - -20#国产- - - - -进口+ - + - -本品+ + + + +24#国产- + + + +进口- - - - -本品- - - - -31#国产- + - + +进口- - - - -注本品本发明试剂盒 国产国内市售同类产品进口进口试剂盒稳定性检定根据阿雷尼期方程推37℃24小时相当于4℃1.5个月，把本试剂盒放置于37℃温箱内，在第4天用此试剂盒检测阳性、阴性血清各3次，并以放置4℃的本试剂盒作为标准对照，结果本试剂盒经37℃4天破坏后(相当于放置4℃6个月)检测的阳性显色下降接近于对照显色(4℃)存放A(X)-2S，阴性显色上升也与对照显色A(X)+2S相当，即阳性检测的特异性显色无明显下降，阴性检测的非特异性显色无明显上升，阴性、阳性变异系数可接受(表2)表2稳定性检定37℃存放4天检测A(X) 4℃存放对照检测A(X)±2S CV％阳性 阴性 阳性A(X)-2S 阴性A(X)+2S 阳性阴性TOX0.241 0.078 0.245 0.078 15.62.7RUV0.421 0.047 0.40 0.047 13.39.7CMV0.558 0.081 0.62 0.072 9.4 13.9HSVI 0.587 0.052 0.486 0.058 14.410.4HSVII 0.477 0.105 0.475 0.103 9.1 6.6本试剂盒的综合评价。本试剂盒具有高度的特异性，大大降低了假阳性的检出，优于国内同类产品，接近进口试剂盒，反应模式清晰，本底低，易于肉眼直接读判结果，为基层医疗单位开展检测提供了方便；试剂盒在效期内质量稳定，检测的重复性好，吸附剂一次配就其溶液稳定，不失吸附清除RF之功能，克服了国内有的同类产品吸附剂需现配现用之弊端。
本发明的技术实施方式。
吸附剂(样本稀释液)甘油15ml，小牛血清10ml，聚乙二醇(分子量2万)1-3g，蔗糖4.8g，硫柳汞0.01g，庆大(8万/ml)250μl，PH7.4BPS至100ml，抗人IgG血清3-5％。
稳定剂氯化钠0.9g，聚乙二醇(分子量2万)0.5-3g，甘油20-50ml，蒸馏水至100ml。
酶结合物稀释液聚乙二醇(分子量2万)1-3g，吐温-20 0.05ml，小牛血清10ml，硫柳汞0.01g，庆大(8万/ml)250μl，PH7.4BPS至100ml。
吸附剂使用用本试剂盒检测时，以吸附剂稀释被检血清(1∶100稀释)，置37℃15-30分钟后，用此稀释液血清进行检测即在已包被抗原塑孔内，每孔加入此稀释血清100μl。
稳定剂使用将抗原按工作度用包被液(PH9.6碳酸盐缓冲液)稀释，以100μl/孔加入聚苯乙烯微孔，置4℃24小时进行包被，次日弃孔内液以100μl/孔加入封闭剂(10％小牛血清)置4℃过夜，再弃孔内液，以100μl/孔加入稳定剂，甩干备用。
酶结合物稀释液使用将抗IgM抗体-辣根酶结合物按工作度用酶结合物稀释液稀释备用。
权利要求
1.吸附剂的配方和使用本发明吸附剂对RF的吸附清除能力强，可排除RF对检测的干扰，降低了假阳性的检出，本底低，阴阳性反差明显。另外，吸附剂内又含有诸多高分子物质，使吸附剂的有效成份在一次配就的溶液中保持稳定，勿需目前有些市售同类产品的现配现用。
2.稳定剂的配方和使用本发明稳定剂其配方构思新颖，技术独特，巧妙地将高分子及脱水性物质配合在一起，协同发挥作用，使免疫活性物质保持稳定。保证了检测的精密性，重复性好。
3.酶结合物稀释液的配方和使用由于高分子聚乙二醇，使酶结合物在稀释溶液中仍然保持活性，使检测的反应模式在效期内始终清晰，易于判定结果。
全文摘要
抗TORCH－IgM ELISA检测度剂盒是一项发明技术。排除RF干扰是ELISA间接法检测IgM抗体的重要课题,本发明采用吸附剂能高度吸附清除RF,使试剂盒具有高度特异性,大大降低了假阳性的检出;由于采用含有高分子及脱水性物质的稳定剂,试剂盒在效期内质量稳定,重复性好,经37℃破坏,阳性显色下降接近于对照显色A(x)－2S,阴性显色上升也与对照显色A(x)+2S相当。
文档编号G01N33/53GK1263267SQ9911635
公开日2000年8月16日 申请日期1999年2月8日 优先权日1999年2月8日
发明者刘剑雄, 何祥旺 申请人:刘剑雄, 何祥旺