测定CP装载siRNA体系中siRNA释放的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于药物分析领域，具体涉及一种实时测定阳离子聚合物（Cat i on i c Polymeric, CP)装载siRNA体系中siRNA释放的方法。
【背景技术】
[0002] 小干扰RNA (siRNA)由21~23个碱基对构成，可在细胞质中特异性与其碱基对互 补的信使RNA (mRNA)结合并使其经核酸酶降解，从而阻断其编码蛋白质的表达，即通过RNA 干扰（RNAi)实现基因沉默。因此，siRNA作为药物在癌症和流感、炎等病毒感染疾病治疗 领域有重要科学意义和应用价值。然而，荷负点的亲水性siRNA难以跨越表面负电的疏水 性细胞膜，易被核酸酶降解及快速从血液循环中清除。因此需要安全高效的载体释放系统 保护并高效运送进入细胞发挥功能。
[0003] 理想的siRNA载体应具有高效、稳定，并且无毒、靶向性好等特点。siRNA载体主要 分为病毒型和非病毒型两种。病毒型siRNA载体虽然转染效率高，但同时具有免疫原性、潜 在的致瘤性，且装载容量有限、成本高等缺陷而限制其应用。因此，非病毒型载体的应用受 到重视。
[0004] 阳离子聚合物作为非病毒SiRNA载体的一类，其转导效率虽低于病毒载体，但因 其具有无免疫原性、低毒、装载容量大、制备容易等优势而引起广泛关注。阳离子聚合物所 携带正电荷，可与带负电荷siRNA通过静电相互作用，自聚集形成纳米结构复合体系，无需 使用有机溶剂及超声处理，减少对核酸损伤。
[0005] 阳离子聚合物装载siRNA进入细胞，即要在siRNA进入细胞前保持复合状态的稳 定而避免siRNA提前释放而遭核酸酶降解；同时还要求载体到达细胞质后及时释放siRNA 而发挥基因沉默功能。无论siRNA递送过程中释放过早或过晚，都会降低最终基因沉默效 果。因此，明确siRNA释放过程对提高阳离子聚合物载siRNA体系的基因沉默效果有重要 意义。实际操作中siRNA浓度极低，一般低于50nM，同时游离siRNA与处于复合态的siRNA 亦极难分离，最终导致常规方法无法检测siRNA释放过程。
[0006] 移荧光共振能量转移（FRET)是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子 吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互 作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移)。产生FRET的条件(附图 1)主要有三个：（1)供体与受体间在合适的距离（1~l〇nm) ;(2)供体的发射光谱与受体的 吸收光谱有一定的重叠，这是能量匹配的条件；（3)供体与受体的偶极具一定的空间取向， 这是偶极一偶极耦合作用的条件。
[0007] FRET的效率用E表示，E值可由以下几种方式测定：用荧光强度表征（E=I-Ida/ ID，Ida表示A存在时D的荧光强度）；用量子产率表征（E=l-(tDA/> D);用荧光寿命表征 (Ε=1- τ Μ/ τ D)。这表示研究FRET可以通过不同的实验设备，既可以用普通光谱仪测定其 荧光强度、量子产率，也可以用时间分辨仪测定其荧光寿命。随着成像技术的发展，用显微 成像的方法可更直观地观测FRET地发生。
[0008] 由于FRET现象的效率对荧光探针间距离变化十分敏感，即两种荧光物质间距变 化即导致FRET效率变化。阳离子聚合物载siRNA FRET体系中，siRNA释放过程伴随FRET 探针的分离及FRET效率的降低。因此体系FRET效率降低曲线即为siRNA释放曲线。
[0009] Christopher A. Alabi 等人将分别标记了 AlexaFluor594 (突光供体）与 AlexaFluor647(突光受体)的siRNA共同装载入PEI纳米复合物中（Christopher A. Alabi， Kevin T. Love,Gaurav Sahay, et al. FRET-Labeled siRNA Probes forTracking Assembly and Disassembly of siRNANanocomplexes[J].ACS Nano, 6(2012):6133_6141)。当 siRNA 处于复合态时，两种荧光分子间发生FRET现象，而随着siRNA释放，这种FRET效率逐渐减 弱。文中比较了三种载体装载siRNA在细胞内的释放过程：b-PEI组几乎不见siRNA释放， C14-113组siRNA于2小时内快速释放；而ND98组可在6小时内几乎保持相同的释放速率。
[0010] Shan Jiang and Yong Zhang将B0B0-3标记的siRNA装载于上转换量子点上构成 FRET体系（Shan Jiang and Yong Zhang,Upconversion Nanoparticle-Based FRET System for Study of siRNAin Live Cells [J]· Langmuir, 26 (9) ,2010:6689-6694),通过 FRET 效 率变化曲线得出载体在SK-BR-3细胞中20小时内释放完全。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于提供一种实时测定阳离子聚合物装载siRNA体系中siRNA释放 的方法，该方法无需将释放的siRNA分离，直接检测样品荧光的变化而得出体系FRET效率 进而得出siRNA释放曲线。
[0012] 本发明阳离子聚合物装载siRNA体系中siRNA释放是利用FRET效率随探针间距 离发生改变的特性，FRET效率定义为：
【主权项】
1. 测定CP装载SiRNA体系中SiRNA释放的方法，其特征在于：体系中阳离子聚合物 (Cationic Polymeric, CP)及其所装载siRNA皆选用带有突光基团的原料，且载体阳离子聚 合物与siRNA所标记两种荧光物质可构成荧光共振能量转移（FRET)效应的荧光供体/受 体对，即可根据体系中FRET效率的变化获得siRNA释放信息。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：选用经FRET荧光供体/受体对分子 Donor/Acc印tor (D/A)分别标记 CP 与 siRNA，即 D-CP、A-siRNA 或 A-CP、D-siRNA ; 当标记形式为D-CP、A-siRNA时，具体步骤如下： (1) CP溶于0. 5-5mL溶剂S中，使得溶液中阳离子聚合物所携带阳离子基团浓度为 1-600μΜ ； (2) 取体积为5 μ L-500 μ L、浓度1 μ Μ-100 μ M的SiRNA搅拌条件下缓慢加入步骤（1) 所得溶液中，避光反应5-60分钟后得CP/siRNA复合物； (3) 采用与步骤（1)、步骤（2)所述相同的条件和过程，不同之处是将CP更换为D-CP， 得到D-CP/siRNA复合物；采用与步骤（1)、步骤（2)所述相同的条件和过程，将siRNA更换 为A-s iRNA，得到CP/A-s iRNA复合物；采用与