内脏脂肪型肥胖或糖尿病、糖耐量、胰岛素抵抗性、冠状动脉疾病、代谢综合征等的各 种各样的病态、再者由就餐疗法或手术的减量效果等中，也示相比脂联素总量更相关强，示 脂联素的分子别定量的重要性。再者，在由肥胖所致的胰岛素抵抗性中，也看出高分子量的 脂联素特别相关。另外，根据对于脂联素和肾障碍探讨的报告，在脂联素缺损小鼠中，见到 肾脏的足细胞的足突起的融合，确认白蛋白尿。也有报告说，向该处补充脂联素，则见到肾 脏的病理组织的正常化及白蛋白尿的改善，提示脂联素有对于肾障碍有保护性的作用的可 能性（Sharma Ketal :Adiponectin regulates albumin uria and podocyte function in mice. J Clin Invest 118(5) ： 1645-1656, 2008.)〇
[0039] 再有知，在ICT-EIA法中测定主要HMW脂联素，测定一部分MMW脂联素和单分子。 但是，虽然是非常弱的反应，但已知也测定LMW脂联素。
[0040] 本发明的"肾功能"是指肾脏的肾小球的过滤及再吸收功能。
[0041] 本发明的"评价指标"是指尿中的脂联素浓度除以血中的脂联素浓度的数值，例如 在健康人的情况中，如见于受试者A和B，是0. 3 X KT4以下。另一方面，在被提示是早期的 肾功能障碍（微量白蛋白尿）的受试者D中，成4.0X10'如此，本发明的评价指标成10 倍以上的数值的差异，是易区别的指标。可使此数值再乘以1〇 4,作为整数，也会使评价变容 易。
[0042]【本发明的第二的实施方式】
[0043] 本发明的第二的实施方式是涉及肾功能疾病的预防或治疗方法的发明，其特征在 于，是使用上述的评价指标进行肾功能疾病的进行度评价方法的方法，还有，对于有肾功能 障碍的患者进行介入疗法。
[0044] 本发明的"进行度评价方法"是指通过测定尿中的脂联素浓度/血中的脂联素的 比的变动来确切评价受试者的肾功能疾病的进行状况的方法。由此评价方法，变得确切进 行用于抑制受试者的肾功能疾病的进行而改善的治疗剂的施用或生活指导等的介入疗法。 [0045] 本发明的"介入疗法"是指基于流程的生活习惯（就餐一身体活动中心）的改善或 公知的高脂血症治疗剂、糖尿病疾病治疗剂的服用。即，指导将就餐疗法或运动疗法并入生 活习惯之中，进行必要热和消费热的控制，减轻精神性的应激，进行删除减轻糖尿病性肾疾 病的发症中涉及的要因。还有，对于初期症状的肾功能疾病患者，作为介入疗法含进行用于 降低本发明的评价指标的数值的药物疗法。使用上述的肾功能疾病的进行度评价方法，通 过开始早期的介入疗法，抑制、回避例如糖尿病性肾病等的重症度的向肾功能障碍的迀移， 改善症状，返回健康的状态。
[0046] 再有，在本发明的第二的实施方式中使用的用语中，与第一的实施方式共通的用 语表示相同的含意。因此，不特别言及。 【实施例】
[0047] 接下来举实施例再说明本发明，但本发明不限于这些。
[0048] 【实施例1 :由ICT-EIA法的血中和尿中的脂联素浓度的测定】
[0049] 【（1)试剂】
[0050] 【（a)抗原】
[0051] 标准重组体一人?脂联素从 Bio Vendor Lab Med Inc 公司（Palackecho，Czech Republic)购入。
[0052] 【（b)抗体】
[0053] 单克隆抗人一脂联素抗体（BAF1065 及 MAB10651)从 R&DSystems Inc. (MN，USA) 购入。
[0054] 【（c)缓冲液】
[0055] 缓冲液 A :含 0· IM NaCl、0. 01% BSA、lmM 1%(：12及 0· 1% NaN3的 0· OlM 磷酸钠缓 冲液（ρΗ7· 0)、
[0056] 缓冲液B :含5mM EDTA的0.1 M磷酸钠缓冲液（ρΗ6. 0)、
[0057] 缓冲液 C :含 0· IM NaCl、0. 1 % BSA、ImM MgCl2& 0· 1 % NaN 3的 0· OlM 磷酸钠缓冲 液（ρΗ7· 0)、
[0058] 缓冲液 D :含 0· 4Μ NaCl、0. 1 % BSA、ImM MgCl2& 0· 1 % NaN 3的 0· 05Μ 磷酸钠缓冲 液（ρΗ7· 0)、
[0059] 缓冲液E :含0.1 M NaCl的0.0 lM磷酸钠缓冲液（ρΗ7. 0)
[0060] 【（d)血液样品】
[0061] 将受试者的血清样品在12小时绝餐后的早朝空腹时采血（NIPR0,22G座付，大 阪）、于室温静置30分钟后，用离心机（日立微量高速离心机CF16RXII，日立工机，东京） 以3000rpm离心10分钟，得到血清。血清于负30°C冷冻保存。
[0062] 【（e)尿样品】
[0063] 向受试者的晨尿（IOmL)加1/50容量的5% BSA及5% NaN3，于4°C保存至透析。 24小时以内透析采集的尿。
[0064] 透析使用透析用纤维素管（透析膜UC8-32-25、三光纯药、东京），对于缓冲液（含 0.1 M NaCl的0.0 lM磷酸钠缓冲液pH7. 0)进行I. 5ml的上述尿样品的透析。透析后，秤量透 析尿的重量，进行由稀释倍率的补正。透析尿立即分注于微管（Safe-Lock Tubes 1.5ml)， 于-20°C进行冷冻保存。再有，尿中肌酸酐浓度由市售试剂盒（肌酸酐-测试WAK0、和光纯 药、大阪）测定。
[0065] 【(2)方法】
[0066] 测定方法使用基于非专利文献1中记载的ICT-EIA法的方法。即，准备将市售 ELISA试剂盒附带的标准高分子人一脂联素标准液用缓冲液D稀释的100 μ L、或者将尿及 血清用缓冲液D稀释40, OOO倍的100 μ L，向其加将酶被标记抗体及捕获用被标记抗体溶 解于缓冲液D的混合液100 μ L，于4°C温育16小时，使由酶被标记抗体一脂联素一捕获用 被标记抗体的3者组成的免疫复合物形成。接下来，向此反应液加抗DNP-IgG不溶化聚苯 乙烯珠1个，使反应0. 5小时，在珠上捕获免疫复合物。将此珠用缓冲液A (2mL)清洗2次 后，溶解于缓冲液C的2mMDNP-Lys (150 μ L)，并使反应0. 5小时，从珠使免疫复合物溶出。 除去抗DNP-IgG不溶化聚苯乙烯珠之后，向溶出液加链霉亲和素不溶化聚苯乙烯珠1个， 再使反应0. 5小时，使免疫复合物转移到第2珠上。与珠的反应全部于25°C在210次/分 的振荡下进行。再将珠用缓冲液C(2mL)清洗3次后，使用转移到珠上的β-D-吡喃半乳 糖苷（荧光底物；4MUG) (400 μ L)于30°C温育，加0· IM甘氨酸钠缓冲液（ρΗ10· 5) (2mL)而 停止反应后，使用荧光分光光度计（F-2500,日立）进行测定。再有，使用激发波长360nm 荧光波长450nm，荧光强度以1(T8M4MU作为100而进行换算（Hashida Sand Ishikawa E : Detection of one milliattomole of ferritin by novel and ultrasensitive enzyme immunoassay. J Biochem 108 :960-964. 1990.)〇
[0067] 【⑶测定结果】
[0068] 【（a)受试者】
[0069] 为了评价作为肾功能指标的尿中脂联素，筛选有不同的性别、年龄、肾功能的对象 者，进行血中及尿中脂联素的探讨。以年轻的有健康的肾功能的20~29岁女性A、有健康 的肾功能的40~49岁女性B、与年龄一同作为肾功能推定指标的eGFR(mL/min/l. 73m2)见 降低倾向的50~59岁男性C、eGFR不变成C，但被提示处于微量白蛋白尿倾向，肾小球的 过滤能力的降低的60~69岁肥胖男性D作为对象者。
[0070] 【（b)评价结果】
[0071] 首先，从一般生物化学检查的结果、血中肌酸酐浓度及年龄和性别算出eGFR。结果 示于表1。受试者A是97. 4mL/min/l. 73m2、受试者B是107. 2mL/min/l. 73m2、受试者C是 48. 2mL/min/l. 73m2、受试者 D 是 50.0 mL/min/1. 73m2。
[0072]【表1】
[0073]
【主权项】
1. 肾功能的评价指标，其特征在于，是用免疫复合物转移测定方法（ICT-EIA法）测定 的尿中的脂联素浓度的测定值除以血中的脂联素浓度的数值。
2. 权利要求1所述的肾功能的评价指标，其中上述脂联素浓度是高分子量（HMW)脂联 素浓度。
3. 权利要求1或2的肾功能的评价指标，其特征在于是权利要求1或2的数值乘以10 4 的数值。
4. 肾功能疾病的进行度评价方法，其特征在于，使用权利要求1~3所述的评价指标。
5. 权利要求4所述的肾功能疾病的进行度评价方法，其特征在于，肾功能疾病是糖尿 病性肾病。
6. 肾功能疾病的预防或治疗方法，其特征在于，使用权利要求1~3的评价指标，对于 肾功能疾病患者及/或其罹患危险者进行介入疗法。
7. 权利要求6所述的肾功能疾病的预防或治疗方法，其特征在于，肾功能疾病是糖尿 病性肾病。
8. 权利要求6或7所述的糖尿病性疾病的预防或治疗方法，其中介入疗法是就餐疗法、 运动疗法或药物疗法。
【专利摘要】本发明以提供肾功能疾病的初期症状的早期诊断指标和其评价方法作为课题。特别是，以提供可确切进行糖尿病性肾病的初期症状的诊断的评价指标和其评价方法作为课题。本发明人为了解决上述的课题，使用免疫复合物转移酶联免疫测定方法(ICT-EIA法)，通过以尿中和血中的脂联素浓度的比作为评价指标，发现更确切进行肾功能的评价。结果，变得也可确切掌握肾脏的功能障碍的进行状况或介入疗法的效果。
【IPC分类】A61P3-10, G01N33-53, A61P13-12, G01N33-543, A61K45-00
【公开号】CN104737020
【申请号】CN201380052667
【发明人】桥田诚一, 山本真弓
【申请人】桥田诚一
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2013年3月27日
【公告号】WO2014034168A1