血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白检测技术领域，涉及一种蛋白定量检测方法及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] sH2a是一种在肝脏特异性表达的可溶性分泌型蛋白，分子量约35KD。它与另一种 也只在肝细胞表达的去唾液酸受体蛋白（ASGPR)的H2亚基同源，但研究表明，sH2a并不参 与ASGRP H2亚基的组装。sH2a的前体蛋白在肝细胞表达出来后，在内质网被剪切去除约5 个氨基酸变成sH2a，即被释放到细胞外，进入血液循环。正常人外周血中sH2a保持较高水 平，但在肝损伤、肝炎、肝纤维化等肝病患者中sH2a的含量显著下降，因此，通过检测患者 血中sH2a含量可获得肝脏功能状况的信息，便于临床肝损伤、肝炎、肝纤维化等肝病的辅 助诊断。
[0003] 发明人在前期研究工作中发明了一种sH2a定量检测试剂盒（CN103336125A)，系 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法来定量检测sH2a，但该发明仍然存在线性范围较窄，检测 本底较高，检测耗时较长等问题，还有待进一步改进。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析 法及其检测试剂盒，具有线性范围宽、零本底、稳定性好、灵敏度高、特异性强、准确度高、检 测时间短等优点。
[0005] 经研究，本发明提供如下技术方案：
[0006] 1.血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法，包括以下步骤：
[0007] A.固相抗体的制备
[0008] 将抗sH2a单克隆抗体稀释后作为包被液包被固相材料，洗涤去除包被液，再用含 有封闭蛋白的缓冲液作为封闭液封闭固相材料，洗涤去除封闭液，干燥，制得包被抗sH2a 单克隆抗体的固相材料；
[0009] B.标记抗体的制备
[0010] 选择能够与步骤A中所述抗sH2a单克隆抗体配对的抗sH2a单克隆抗体，进行镧 系元素离子标记，制得标记抗体；
[0011] C.检测
[0012] 在步骤A制得的包被抗sH2a单克隆抗体的固相材料中，加入sH2a标准品或待测 血清样品，孵育，洗涤固相材料，再加入步骤B制得的标记抗体，孵育，洗涤固相材料，再加 入解离增强液，震荡，测定荧光强度，根据sH2a标准品测定结果绘制标准曲线，根据标准曲 线计算待测血清样品中的sH2a含量。
[0013] 进一步，所述血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法包括以下步骤：
[0014] A.固相抗体的制备
[0015] 将抗sH2a单克隆抗体用浓度为50mM、pH为9. 6的碳酸盐缓冲液稀释后作为包被 液包被微孔反应板，洗涤去除包被液，再用含有牛血清白蛋白的PBST作为封闭液封闭微孔 反应板，洗涤去除封闭液，干燥，制得包被抗sH2a单克隆抗体的微孔反应板；
[0016] B.标记抗体的制备
[0017] 选择能够与步骤A中所述抗sH2a单克隆抗体配对的抗sH2a单克隆抗体，进行三 价铕离子标记，制得标记抗体；
[0018] C.检测
[0019] 将sH2a标准品用PBS稀释至不同浓度，作为梯度sH2a标准溶液；将步骤B制得的 标记抗体用反应缓冲液稀释，制得标记抗体工作液；在步骤A制得的包被抗sH2a单克隆抗 体的微孔反应板中，加入上述梯度sH2a标准溶液或待测血清样品，孵育，洗涤微孔反应板， 再加入标记抗体工作液，孵育，洗涤微孔反应板，再加入解离增强液，震荡，用时间分辨免疫 荧光分析仪于激发波长340nm、发射波长614nm测定荧光强度，根据梯度sH2a标准溶液测定 结果绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测血清样品中的sH2a含量。
[0020] 更进一步，所述血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法包括以下步骤：
[0021] A.固相抗体的制备
[0022] 将抗sH2a单克隆抗体用浓度为0. 05mol/L、pH为9. 6的碳酸盐缓冲液稀释至 5 μ g/ml作为包被液，以100 μ 1/孔包被微孔反应板,4°C包被过夜,洗漆去除包被液,再用 含有质量百分含量为1%的牛血清白蛋白的PBST作为封闭液，以100 μ 1/孔封闭微孔反应 板，37°C封闭2小时，洗涤去除封闭液，37°C干燥，制得包被抗sH2a单克隆抗体的微孔反应 板；
[0023] B.标记抗体的制备
[0024] 选择能够与步骤A中所述抗sH2a单克隆抗体配对的抗sH2a单克隆抗体，进行三 价铕离子标记，制得标记抗体；
[0025] C.检测
[0026] 将sH2a标准品用PBS分别稀释至0· l、l、10、100、1000、10000ng/ml，作为梯度 sH2a标准溶液；将步骤B制得的标记抗体用反应缓冲液按体积比为1:5000进行稀释，制得 标记抗体工作液；在步骤A制得的包被抗sH2a单克隆抗体的微孔反应板中，加入上述梯度 sH2a标准溶液或待测血清样品，100 μ 1/孔，37°C孵育1小时，洗涤微孔反应板，再加入标 记抗体工作液，100 μ 1/孔，37°C孵育1小时，洗涤微孔反应板，再加入解离增强液，100 μ 1/ 孔，震荡20分钟，用时间分辨免疫荧光分析仪于激发波长340nm、发射波长614nm测定荧光 强度，根据梯度sH2a标准溶液测定结果绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测血清样品中 的sH2a含量。
[0027] 进一步，步骤B中所述标记抗体为含有三价铕离子标记抗sH2a单克隆抗体与牛 血清白蛋白的Tris-HCl缓冲液；步骤C中所述sH2a标准品为含有sH2a、牛血清白蛋白与 防腐剂的Tris-HCl缓冲液；步骤C中所述反应缓冲液为含有牛血清白蛋白、乙二胺四乙 酸、T Ween40、惰性染料与防腐剂的Tris-HCl缓冲液；步骤C中所述解离增强液为由曲拉通 X-100、冰乙酸和螯合剂组成的水溶液；步骤A和C中所述洗涤均以含有TWeen20与防腐剂 的Tris-HCl缓冲液作为洗涤液。
[0028] 更进一步，步骤B中所述标记抗体为含有三价铕离子标记抗sH2a单克隆抗体与牛 血清白蛋白的Tris-HCl缓冲液，其中三价铕离子标记抗sH2a单克隆抗体的浓度为0. 1 μ g/ ml，牛血清白蛋白的质量百分浓度为0. 5%，Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM、pH为7. 8 ;步 骤C中所述sH2a标准品为含有sH2a、牛血清白蛋白与防腐剂的Tris-HCl缓冲液，其中牛 血清白蛋白的质量百分浓度为〇. 5%，防腐剂的质量百分浓度为0. 05%，Tris-HCl缓冲液的 浓度为50mM、pH为7.8 ;步骤C中所述反应缓冲液为含有牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、 TWeen40、惰性染料苋菜红与防腐剂的Tris-HCl缓冲液，其中牛血清白蛋白的质量百分浓 度为0. 5%，乙二胺四乙酸和TweeMO的质量百分浓度分别为0. 01%，惰性染料的质量百分浓 度为0. 02%，防腐剂的质量百分浓度为0. 05%，Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM、pH为7. 8 ; 步骤C中所述解离增强液为由曲拉通X-100、冰乙酸和螯合剂氨三乙酸组成的水溶液，其中 曲拉通X-100的质量百分浓度为0. 1%，冰乙酸的质量百分浓度为0. 01%，螯合剂的浓度为 15 μ M ;步骤A和C中所述洗涤均以含有TWeen20与防腐剂的Tris-HCl缓冲液作为洗涤液， 其中T Ween20的质量百分浓度为0. 01%，防腐剂的质量百分浓度为0. 05%，Tris-HCl缓冲液 的浓度为50mM、pH为7. 8。
[0029] 2.血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法检测试剂盒，包含以下组分：包被抗 sH2a单克隆抗体的固相材料，镧系元素离子标记的抗sH2a单克隆抗体，以及sH2a标准品； 所述固相材料上包被的抗sH2a单克隆抗体能够与镧系元素离子标记的抗sH2a单克隆抗体 配对。
[0030] 进一步,所述包被抗sH2a单克隆抗体的固相材料为包被抗sH2a单克隆抗体的微 孔反应板，所述镧系元素离子标记的抗sH2a单克隆抗体为含有三价铕离子标记抗sH2a单 克隆抗体与牛血清白蛋白的Tris-HCl缓冲液；所述sH2a标准品为含有sH2a、牛血清白蛋 白与防腐剂的Tris-HCl缓冲液。
[0031]