更进一步，所述镧系元素离子标记的抗sH2a单克隆抗体为含有三价铕离子标记 抗sH2a单克隆抗体与牛血清白蛋白的Tris-HCl缓冲液，其中三价铕离子标记抗sH2a单克 隆抗体的浓度为〇. 1 μ g/ml，牛血清白蛋白的质量百分浓度为0. 5%，Tris-HCl缓冲液的浓 度为50mM、pH为7. 8 ;所述sH2a标准品为含有sH2a、牛血清白蛋白与防腐剂的Tris-HCl 缓冲液，其中牛血清白蛋白的质量百分浓度为〇. 5%，防腐剂的质量百分浓度为0. 05%， Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM、pH为7. 8。
[0032] 进一步，所述血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法检测试剂盒还包含反 应缓冲液、解离增强液和洗涤液；所述反应缓冲液为含有牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、 TWeen40、惰性染料与防腐剂的Tris-HCl缓冲液；所述解离增强液为由曲拉通X-100、冰乙 酸和螯合剂组成的水溶液；所述洗涤液为含有T Ween20与防腐剂的Tris-HCl缓冲液。
[0033] 更进一步，所述反应缓冲液为含有牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、Tween40、惰性染 料苋菜红与防腐剂的Tris-HCl缓冲液，其中牛血清白蛋白的质量百分浓度为0. 5%，乙二胺 四乙酸和Tween40的质量百分浓度分别为0. 01%，惰性染料的质量百分浓度为0. 02%，防腐 剂的质量百分浓度为〇. 05%，Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM、pH为7. 8 ;所述解离增强液 为由曲拉通X-100、冰乙酸和螯合剂氨三乙酸组成的水溶液，其中曲拉通X-100的质量百分 浓度为〇. 1%，冰乙酸的质量百分浓度为〇. 01%，螯合剂的浓度为15 μ M ;所述洗涤液为含有 TWeen20与防腐剂的Tris-HCl缓冲液，其中TWeen20的质量百分浓度为0· 01%，防腐剂的质 量百分浓度为〇. 05%，Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM、pH为7. 8。
[0034] 本发明的有益效果在于：本发明提供了一种血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光 分析法及其检测试剂盒，具有线性范围宽、零本底、稳定性好、灵敏度高、特异性强、准确度 高、检测时间短等优点，可用于肝损伤、肝炎、肝纤维化等肝病患者血清sH2a含量检测，便 于临床肝损伤、肝炎、肝纤维化等肝病的辅助诊断。
【附图说明】
[0035] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行 说明：
[0036] 图1为sH2a基因片段PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA分子量标 准，1和2为PCR扩增产物。
[0037] 图2为IPTG诱导的pET28a-sH2a转化BL21 (DE3)细菌裂解上清的SDS-PAGE图。
[0038] 图3为sH2a重组蛋白的western blotting图，其中1、2、3、4、5、6分别对应图2 六个不同浓度IPTG诱导的蛋白泳道。
[0039] 图4为SDS-PAGE鉴定纯化的抗sH2a单抗。
[0040] 图5为western blotting鉴定纯化的抗sH2a单抗。
[0041] 图6为本发明血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法的sH2a标准曲线。
[0042] 图7为以肝硬化患者血清组和正常人血清组测定结果绘制的ROC曲线。
【具体实施方式】
[0043] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0044] 实施例1、sH2a重组蛋白的表达、纯化及鉴定
[0045] 以肝癌组织 cDNA 为模板，以 5'-CGGGATCCATGGCCAAGGACTTTCAAGATATCCA-3'（SEQ ID No. 1)和 5' -CGGAATTCTCAGGCCACCTCGCCGGT-3'（SEQ ID No. 2)为引物，PCR 扩增 sH2a 基因片段（图1 )，切胶回收纯化后，连接至克隆载体PCR2. 1并进行测序鉴定，再将序列鉴定 正确的sH2a基因片段克隆至表达载体pET28a(+)中，酶切位点为BamH I和EcoR I，获得重 组质粒pET28a-sH2a，该重组质粒含6XHIS标签，便于后续的蛋白纯化。
[0046] 将重组质粒pET28a_sH2a转化大肠杆菌BL21 (DE3)，挑取转化成功的克隆，37°C培 养至0D600nm值约0. 6,分别加入0. 2、0. 5、lmM IPTG，继续培养3h诱导目的蛋白表达。诱 导结束后，超声裂解菌体，取裂解上清，用HIS蛋白纯化柱纯化，获得sH2a重组蛋白。
[0047] 用western blotting方法对sH2a重组蛋白的活性进行鉴定。首先，取裂解上清 进行SDS-PAGE，同时设立未经IPTG诱导的pET28a空载体转化BL21 (DE3)细菌裂解上清作 为对照，结果显示，目的蛋白大小为35KD(图2)，与sH2a重组蛋白理论值相符；然后，将目的 蛋白利用转印仪转印到NC膜上，将NC膜用含有1%BSA的磷酸盐缓冲液于4°C封闭过夜，再 用含0. 5%Tween20的磷酸盐缓冲液洗膜，再加入鼠抗人sH2a抗体于37°C振荡温育2小时， 洗膜后再加入抗鼠 IgG酶标二抗振荡温育1小时，最后洗膜、ECL显色，结果显示，在目的蛋 白相应位置处有明显的特异性条带（图3)，而在对照相应位置处无条带，证明所得sH2a重 组蛋白具有良好的生物学活性。
[0048] 实施例2、抗sH2a单克隆抗体的制备
[0049] 取6周龄BALB/c雌性小鼠2只，按照以下步骤进行免疫：
[0050] 首次免疫：将sH2a重组蛋白溶液与弗式完全佐剂按体积比1:1混合，充分乳化后， 于小鼠背部皮下分两点注射〇. Iml (sH2a重组蛋白30 μ g/只）；
[0051] 第二次免疫：间隔14天后，将sH2a重组蛋白溶液与弗式不完全佐剂按体积比1:1 混合，充分乳化后，于小鼠两侧腹股沟部皮下分点共注射〇. lml(sH2a重组蛋白50yg/只）；
[0052] 第三次免疫：间隔14天后，将sH2a重组蛋白溶液与弗式不完全佐剂按体积比1:1 混合，充分乳化后，于小鼠两侧肩后部及腹部皮下分点共注射〇. lml(sH2a重组蛋白50 μ g/ 只）；
[0053] 末次免疫：间隔10天后，尾静脉采血ELISA检测血清效价，达到1:10000 (表1)后 加强免疫，于小鼠腹腔注入sH2a重组蛋白溶液0.1 ml (sH2a重组蛋白50 μ g/只）。
[0054] 表1鼠抗血清效价测定
[0055]
【主权项】
1. 血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法，其特征在于，包括以下步骤： A. 固相抗体的制备 将抗sH2a单克隆抗体稀释后作为包被液包被固相材料，洗涤去除包被液，再用含有封 闭蛋白的缓冲液作为封闭液封闭固相材料，洗涤去除封闭液，干燥，制得包被抗sH2a单克 隆抗体的固相材料； B. 标记抗体的制备 选择能够与步骤A中所述抗sH2a单克隆抗体配对的抗sH2a单克隆抗体，进行镧系元 素离子标记，制得标记抗体； C. 检测 在步骤A制得的包被抗sH2a单克隆抗体的固相材料中，加入sH2a标准品或待测血清 样品，孵育，洗涤固相材料，再加入步骤B制得的标记抗体，孵育，洗涤固相材料，再加入解 离增强液，震荡，测定荧光强度，根据sH2a标准品测定结果绘制标准曲线，根据标准曲线计 算待测血清样品中的sH2a含量。
2. 如权利要求1所述的血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法，其特征在于，包括 以下步骤： A. 固相抗体的制备 将抗sH2a单克隆抗体用浓度为50mM、pH为9. 6的碳酸盐缓冲液稀释后作为包被液包 被微孔反应板，洗涤去除包被液，再用含有牛血清白蛋白的PBST作为封闭液封闭微孔反应 板，洗涤去除封闭液，干燥，制得包被抗sH2a单克隆抗体的微孔反应板； B. 标记抗体的制备 选择能够与步骤A中所述抗sH2a单克隆抗体配对的抗sH2a单克隆抗体，进行三价铕 离子标记，制得标记抗体； C. 检测 将sH2a标准品用PBS稀释至不同浓度，作为梯度sH2a标准溶液；将步骤B制得的标记 抗体用反应缓冲液稀释，制得标记抗体工作液；在步骤