A制得的包被抗sH2a单克隆抗体的 微孔反应板中，加入上述梯度sH2a标准溶液或待测血清样品，孵育，洗涤微孔反应板，再加 入标记抗体工作液，孵育，洗涤微孔反应板，再加入解离增强液，震荡，用时间分辨免疫荧光 分析仪于激发波长340nm、发射波长614nm测定荧光强度，根据梯度sH2a标准溶液测定结果 绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测血清样品中的sH2a含量。
3. 如权利要求2所述的血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法，其特征在于，包括 以下步骤： A. 固相抗体的制备 将抗sH2a单克隆抗体用浓度为0. 05mol/L、pH为9. 6的碳酸盐缓冲液稀释至5 ii g/ml 作为包被液，以100 U 1/孔包被微孔反应板，4°C包被过夜,洗漆去除包被液,再用含有质量 百分含量为1%的牛血清白蛋白的PBST作为封闭液，以100 iil/孔封闭微孔反应板，37°C封 闭2小时，洗涤去除封闭液，37°C干燥，制得包被抗sH2a单克隆抗体的微孔反应板； B. 标记抗体的制备 选择能够与步骤A中所述抗sH2a单克隆抗体配对的抗sH2a单克隆抗体，进行三价铕 离子标记，制得标记抗体； C.检测 将8取&标准品用？85分别稀释至0.1、1、10、100、1000、100001^/1111，作为梯度8112&标 准溶液；将步骤B制得的标记抗体用反应缓冲液按体积比为1:5000进行稀释，制得标记抗 体工作液；在步骤A制得的包被抗sH2a单克隆抗体的微孔反应板中，加入上述梯度sH2a标 准溶液或待测血清样品，100 Ul/孔，37°C孵育1小时，洗涤微孔反应板，再加入标记抗体工 作液，100 Ul/孔，37°C孵育1小时，洗涤微孔反应板，再加入解离增强液，100 Ul/孔，震荡 20分钟，用时间分辨免疫荧光分析仪于激发波长340nm、发射波长614nm测定荧光强度，根 据梯度sH2a标准溶液测定结果绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测血清样品中的sH2a 含量。
4. 如权利要求2或3所述的血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法，其特征在 于，步骤B中所述标记抗体为含有三价铕离子标记抗sH2a单克隆抗体与牛血清白蛋白 的Tris-HCl缓冲液；步骤C中所述sH2a标准品为含有sH2a、牛血清白蛋白与防腐剂的 Tris-HCl缓冲液；步骤C中所述反应缓冲液为含有牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、T Ween40、 惰性染料苋菜红与防腐剂的Tris-HCl缓冲液；步骤C中所述解离增强液为由曲拉通 X-100、冰乙酸和螯合剂氨三乙酸组成的水溶液；步骤A和C中所述洗涤均以含有T Ween20 与防腐剂的Tris-HCl缓冲液作为洗涤液。
5. 如权利要求4所述的血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法，其特征在于，步骤 B中所述标记抗体为含有三价铕离子标记抗sH2a单克隆抗体与牛血清白蛋白的Tris-HCl 缓冲液，其中三价铕离子标记抗sH2a单克隆抗体的浓度为0.1 ii g/ml，牛血清白蛋白的质 量百分浓度为〇. 5%，Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM、pH为7. 8 ;步骤C中所述sH2a标准 品为含有sH2a、牛血清白蛋白与防腐剂的Tris-HCl缓冲液，其中牛血清白蛋白的质量百分 浓度为〇. 5%，防腐剂的质量百分浓度为0. 05%，Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM、pH为7. 8 ; 步骤C中所述反应缓冲液为含有牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、TWeen40、惰性染料苋菜红 与防腐剂的Tris-HCl缓冲液，其中牛血清白蛋白的质量百分浓度为0. 5%，乙二胺四乙酸和 Tween40的质量百分浓度分别为0. 01%，惰性染料的质量百分浓度为0. 02%，防腐剂的质量 百分浓度为〇. 05%，Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM、pH为7. 8 ;步骤C中所述解离增强液为 由曲拉通X-100、冰乙酸和螯合剂氨三乙酸组成的水溶液，其中曲拉通X-100的质量百分浓 度为0. 1%，冰乙酸的质量百分浓度为0. 01%，螯合剂的浓度为15 iiM ;步骤A和C中所述洗 涤均以含有TWeen20与防腐剂的Tris-HCl缓冲液作为洗涤液，其中T Ween20的质量百分浓 度为0. 01%，防腐剂的质量百分浓度为0. 05%，Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM、pH为7. 8。
6. 血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法检测试剂盒，其特征在于，包含以下组 分：包被抗sH2a单克隆抗体的固相材料，镧系元素离子标记的抗sH2a单克隆抗体，以及 sH2a标准品；所述固相材料上包被的抗sH2a单克隆抗体能够与镧系元素离子标记的抗 sH2a单克隆抗体配对。
7. 如权利要求6所述的血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法检测试剂盒，其特征 在于，所述包被抗sH2a单克隆抗体的固相材料为包被抗sH2a单克隆抗体的微孔反应板，所 述镧系元素离子标记的抗sH2a单克隆抗体为含有三价铕离子标记抗sH2a单克隆抗体与牛 血清白蛋白的Tris-HCl缓冲液；所述sH2a标准品为含有sH2a、牛血清白蛋白与防腐剂的 Tris-HCl缓冲液。
8. 如权利要求7所述的血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法检测试剂盒，其特 征在于，所述镧系元素离子标记的抗sH2a单克隆抗体为含有三价铕离子标记抗sH2a单克 隆抗体与牛血清白蛋白的Tris-HCl缓冲液，其中三价铕离子标记抗sH2a单克隆抗体的浓 度为0.1 y g/ml，牛血清白蛋白的质量百分浓度为0. 5%，Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM、pH 为7. 8 ;所述sH2a标准品为含有sH2a、牛血清白蛋白与防腐剂的Tris-HCl缓冲液，其中牛 血清白蛋白的质量百分浓度为〇. 5%，防腐剂的质量百分浓度为0. 05%，Tris-HCl缓冲液的 浓度为50mM、pH为7.8。
9. 如权利要求6-8任一项所述的血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法检测试剂 盒，其特征在于，还包含反应缓冲液、解离增强液和洗涤液；所述反应缓冲液为含有牛血清 白蛋白、乙二胺四乙酸、T Ween40、惰性染料与防腐剂的Tris-HCl缓冲液；所述解离增强液 为由曲拉通X-100、冰乙酸和螯合剂组成的水溶液；所述洗涤液为含有T Ween20与防腐剂的 Tris-HCl缓冲液。
10. 如权利要求9所述的血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法检测试剂盒，其 特征在于，所述反应缓冲液为含有牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、T Ween40、惰性染料苋菜红 与防腐剂的Tris-HCl缓冲液，其中牛血清白蛋白的质量百分浓度为0. 5%，乙二胺四乙酸 和Tween40的质量百分浓度分别为0. 01%，惰性染料的质量百分浓度为0. 02%，防腐剂的质 量百分浓度为〇. 05%，Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM、pH为7. 8 ;所述解离增强液为由曲 拉通X-100、冰乙酸和螯合剂氨三乙酸组成的水溶液，其中曲拉通X-100的质量百分浓度为 0. 1%，冰乙酸的质量百分浓度为0. 01%，螯合剂的浓度为15 ii M ;所述洗涤液为含有TWeen20 与防腐剂的Tris-HCl缓冲液，其中TWeen20的质量百分浓度为0. 01%，防腐剂的质量百分浓 度为0. 05%，Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM、pH为7. 8。
【专利摘要】本发明公开了一种血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法，是在包被抗sH2a单克隆抗体的固相材料中，加入sH2a标准品或待测血清样品，孵育，洗涤，再加入镧系元素离子标记的能够与前述抗sH2a单克隆抗体配对的抗sH2a单克隆抗体，孵育，洗涤，再加入解离增强液，震荡，测定荧光强度，根据sH2a标准品测定结果绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测血清样品中的sH2a含量；本发明同时公开了一种血清sH2a含量的时间分辨免疫荧光分析法检测试剂盒；本发明检测方法和试剂盒具有线性范围宽、零本底、稳定性好、灵敏度高、特异性强、准确度高、检测时间短等优点，可用于肝病患者血清sH2a含量检测，便于临床肝病的辅助诊断。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104808001
【申请号】CN201410042011
【发明人】王弢, 秦勇, 周小进, 陈菲
【申请人】苏州工业园区为真生物医药科技有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2014年1月28日