次混匀，于24h、 48h、72h、96h、120h分别取样，每次取样后对样品进行检测，用标准滴定法（国家药典委员 会.中华人民共和国药典（一部）.北京：中国医药科技出版社，2010.附录54-55.和附录 56-57.)分别测定灵芝孢子油样品的酸值、过氧化值，用拉曼光谱仪测得灵芝孢子油样品的 拉曼光谱图，获得一系列样品的酸值、过氧化值、拉曼光谱图；
[0060] 所述灵芝孢子油的拉曼光谱的检测方法为：取40 yL灵芝孢子油样品，置于毛细 管或者样品管中，放入拉曼光谱仪（Ddti丨Nu1' Advantage 785型近红外拉曼光谱仪，DeltaNu 公司，美国，波长785nm，激光功率120mW，分辨率4cm-1，带NuScope数字显微镜和XYZ三维 载物台）样品池中，激光强度选择高档，激光照射时间设定为l〇s，自动进行环境杂散光校 准和基线校正，样品测定5次次进行平均，得到灵芝孢子油样品的拉曼光谱图；
[0061] 以拉曼光谱图中1655CHT1的拉曼峰积分强度（拉曼峰积分强度是用分析软件 Grams里的峰面积的积分功能计算的，软件自动计算，然后拷贝或输出数据即可）为纵 坐标、样品的酸值为横坐标作图，获得灵芝孢子油的酸值评价标准图；以拉曼光谱图中 1655CHT 1的拉曼峰积分强度为纵坐标、样品的过氧化值为横坐标作图，获得灵芝孢子油的过 氧化值评价标准图；
[0062] 实施例2 :灵芝孢子油酸值、过氧化值的拉曼光谱快速检测及氧化酸败过程的动 态检测
[0063] 在50°C恒温下，灵芝孢子油暴露在空气中，于5天、7天、14天、21天、28天、35天 分别取样。每次取样后对样品进行检测，检测方法：取20 y L灵芝孢子油样品置于20 y L毛 细管中，放入拉曼光谱仪（DdtaNul: ,Advantage 785型近红外拉曼光谱仪，DeltaNu公司，美 国，波长785nm，激光功率120mW，分辨率4cm-1，带NuScope数字显微镜和XYZ三维载物台） 样品池中，激光强度选择高档，激光照射时间设定为l〇s，自动进行环境杂散光校准和基线 校正。每个样品测定5次进行平均，得到灵芝孢子油样品的拉曼光谱图，计算拉曼光谱图中 1655CHT 1的拉曼峰积分强度，将计算得到的1655CHT1拉曼峰积分强度结果分别与实施例1 得到的酸值评价标准图、过氧化值评价标准图进行对照，获得样品的酸值和过氧化值，进而 得出灵芝孢子油样品的氧化酸败程度评价结果。
[0064] 5天、7天、14天、21天、28天、35天取样时的拉曼光谱图如图2所示。可以看出， 50°C时灵芝孢子油从第7天起就发生了明显的氧化酸败，14天后大约2/3的不饱和双键酸 已经破坏，说明50°C温度下灵芝孢子油氧化酸败的速度很快。
[0065] 以拉曼光谱图中双键峰的积分强度对时间作图得到灵芝孢子油随时间变化的酸 败曲线，将不同反应温度下（10°C，35°C，50°C，7(rC )得到酸败曲线绘于图3中，可以看出， 温度对孢子油氧化酸败的速度影响十分明显，l〇°C时灵芝孢子油经过二十天氧化酸败也很 少，而70°C时经过数小时大部分孢子油即发生了酸败。由酸败曲线的斜率求出初始反应速 率常数，根据阿伦尼乌斯定律，以反应速率常数对温度的倒数作图（图4)，计算得到氧化酸 败反应的表观活化能为AE = 44. 35kJ/mol。
[0066] 实施例3 :利用基于拉曼光谱的检测方法选择最适合灵芝孢子油的抗氧化剂
[0067] 选择TBHQ、VE、茶多酚3种抗氧化剂，分别按0.02wt%的剂量添加。准确称取4 份灵芝孢子油，一份不添加抗氧剂做为对照样，其它三份分别添加TBHQ、VE和茶多酚，置于 70°C恒温器中避光敞口保存，每隔30h搅拌一次混匀，定期取样，用拉曼光谱仪测定灵芝孢 子油的拉曼光谱图，计算拉曼光谱图中1655CHT 1的拉曼峰积分强度，将计算得到的1655〇1^ 拉曼峰积分强度结果分别与实施例1得到的酸值评价标准图、过氧化值评价标准图进行对 照，获得样品的酸值和过氧化值，进而得出氧化酸败程度评价结果
[0068] 如图5所示，在70°C下，监测添加0. 02wt%抗氧剂和不加抗氧剂孢子油的氧化酸 败速率，很显然，不加抗氧剂的孢子油数小时内很快被氧化，抗氧化效果：维生素E>茶多酚 >TBHQ，添加维生素E的孢子油6天后（双键峰强度下降5% )才出现轻微氧化酸败。根据 前面得到的活化能数据（AE = 44. 35kJ/mol)，可以计算出在室温下（20°C )灵芝孢子油货 架期可达90天左右。在密闭低温的环境中，增加维生素E用量，可进一步显著延长孢子油 的货架期。
[0069] 灵芝孢子油货架期计算方法：已知在70°C下货架期是6天（根据酸败曲线，添加 维生素E的孢子油6天后，双键峰强度下降约5%)，根据阿伦尼乌斯公式，lnk= AE/RT In (k7Q/k2Q) = A E/R* [1八70+273) _1八20+273)]，计算出两个温度下的反应速率常数之比 k7Q/k2(l= 15,于是20°C下的保质期为6天乘以15等于90天。
[0070] 以灵芝孢子油双键拉曼峰的积分强度与用标准滴定法测出的灵芝孢子油酸值作 图，如图6所示，可以看出，无论添加抗氧化剂与否，双键拉曼峰的积分强度与其酸值都有 十分良好的线性关系，表明可以利用拉曼光谱法对灵芝孢子油氧化酸败过程中产生的酸值 进行快速定量检测。相比于传统酸碱滴定法，拉曼光谱法简单、方便、快捷，用样量少，成本 低廉，从而使该方法具有相当大的实际应用前景。
[0071] 用同样的方法，以灵芝孢子油双键拉曼峰的积分强度与用标准滴定法测出的灵芝 孢子油过氧化值作图，如图7所示。虽然拉曼强度与过氧化值不呈现线性关系，但仍然可以 通过非线性拟合（软件：〇rigin 8. 0, S拟合，图7虚线所示）或者内插值的方式（该方法 为已有现成的数学方法）对灵芝孢子油的过氧化值进行快速测定。
【主权项】
1. 一种基于拉曼光谱的灵芝孢子油氧化酸败的检测方法，所述灵芝孢子油的氧化酸败 程度以灵芝孢子油的酸值、过氧化值作为评价指标，其特征在于，所述的检测方法包括如下 步骤： (1) 建立灵芝孢子油酸值、过氧化值评价标准图 取灵芝孢子油，置于70°C恒温器中避光敞口保存，每隔24~36h搅拌一次混匀，在5天 内，以每隔24小时的时间梯度取样，每次取样后对样品进行检测，用标准滴定法分别测定 灵芝孢子油样品的酸值、过氧化值，用拉曼光谱仪测得灵芝孢子油样品的拉曼光谱图，获得 一系列样品的酸值、过氧化值、拉曼光谱图； 所述灵芝孢子油的拉曼光谱的检测方法为：取20~200yL灵芝孢子油样品，置于毛细 管或者样品管中，放入拉曼光谱仪样品池中，激光强度选择高档，激光照射时间设定为10s， 自动进行环境杂散光校准和基线校正，样品测定5次次进行平均，得到灵芝孢子油样品的 拉曼光谱图，计算拉曼光谱图中1655CHT1的拉曼峰积分强度； 以拉曼光谱图中1655CHT1的拉曼峰积分强度为纵坐标、样品的酸值为横坐标作图，获 得灵芝孢子油的酸值评价标准图；以拉曼光谱图中1655CHT1的拉曼峰积分强度为纵坐标、 样品的过氧化值为横坐标作图，获得灵芝孢子油的过氧化值评价标准图； (2) 供试样品的检测 取20~200yL灵芝孢子油供试样品，置于毛细管或者样品管中，放入拉曼光谱仪样 品池中，激光强度选择高档，激光照射时间设定为l〇s，自动进行环境杂散光校准和基线校 正，样品测定5次进行平均，得到灵芝孢子油供试样品的拉曼光谱图；计算拉曼光谱图中 1655CHT1的拉曼峰积分强度，将计算得到的1655CHT1拉曼峰积分强度结果分别与步骤（1) 得到的酸值评价标准图、过氧化值评价标准图进行对照，获得供试样品的酸值和过氧化值， 进而得出灵芝孢子油供试样品的氧化酸败程度评价结果。
【专利摘要】本发明提供了一种基于拉曼光谱的灵芝孢子油氧化酸败的检测方法，所述灵芝孢子油的氧化酸败程度以灵芝孢子油的酸值、过氧化值作为评价指标，所述的检测方法包括：首先，以标准样品拉曼光谱图中1655cm-1的拉曼峰积分强度为纵坐标，酸值或过氧化值为横坐标作图，建立灵芝孢子油的酸值、过氧化值评价标准图；然后，检测供试样品的拉曼光谱，将1655cm-1拉曼峰积分强度结果分别与酸值、过氧化值评价标准图进行对照，获得供试样品的酸值和过氧化值，进而得出灵芝孢子油供试样品的氧化酸败程度评价结果；本发明方法检测时间快，样品消耗量少，操作简单便捷，可现场快速检测，从而使该检测方法具有相当大的实际应用前景。
【IPC分类】G01N21/65
【公开号】CN104931482
【申请号】CN201510372342
【发明人】能静, 谭佳媛, 项延楠, 孙培龙
【申请人】浙江工业大学
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月26日