免疫鉴定脑脊液的装置和方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请号为201080045270. 4的中国专利申请的分案申请，原申请是2010 年8月6日提交的PCT国际申请PCT/US2010/044690于2012年4月6日进入中国国家阶 段的申请。
[0002] 与相关申请的交叉引用
[0003] 本申请是2009年8月7日提交的美国临时申请No. 61/232, 033(其通过整体引用 并入本文）的正式申请。
技术领域
[0004] 本公开内容涉及样品中是否存在脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF)的检测，其 通过检测与在其他体液中的水平相比在CSF中富集的一种或更多种蛋白质来进行。本文描 述了用于检测来自跨种族、年龄、性别、健康状态和遗传变异的广泛人群的混合体液样品中 是否存在脑脊液的装置和方法。
【背景技术】
[0005] 脑脊液（CSF)或脑脊髓液（liquor cerebrospinalis)存在于蛛网膜下腔以及围 绕并穿过中枢神经系统（CNS)的腔室中。脑和脊髓浸泡于CSF中，CSF向神经元和胶质提供 水分、营养、代谢废物的去除和静液冲击的缓冲。CSF通过扩散、胞饮和主动转运的组合过程 通过侧脑室和第四脑室的脉络丛从动脉血中产生。该流体还包含产生自神经元和胶质的成 分。在通过脑室系统扩散至蛛网膜下腔后，大部分CSF经硬脑膜静脉丛被蛛网膜颗粒重吸 收进入血流。每天产生约500ml的脑脊液；成人的总体积为140-150ml，总CSF每6-8小时 更新。在整个CNS中CSF与硬脑膜连接。大部分流体在吻端CNS产生，而且大部分最终在 尾端脊髓排出，形成吻端至尾端的净流体流。CSF是等渗混合物，大部分成分为盐、葡萄糖、 蛋白质和水。来自腰区（lumbar region)的CSF含有15至45mg/dl蛋白质（0.3-1%血清 蛋白质浓度）和50-8011^/(11葡萄糖（60%血液葡萄糖）。脑池和脑室05?中的蛋白质浓度 较低。
[0006] CSF中的蛋白质类型可以分为两类：构成健康个体CSF的主要成分的血液来源蛋 白，以及脑来源蛋白。CSF中约20%的蛋白质来源于脑实质，但其中只有一部分是脑特异 的。
[0007] 尽管事实上大部分脑脊液蛋白质也存在于血清中，但是多种蛋白质来源是CSF特 有的：
[0008] 从神经元和胶质细胞释放的蛋白质，例如tau蛋白、S-100和神经元特异性烯醇酶 (neuron-specific enolase, NSE)〇
[0009] 从软脑膜（leptomeniges)释放的蛋白质，例如|3-微量蛋白（0-trace protein) 和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(cystatin C)。
[0010] 在脉络丛中进行合成期间被糖基化或磷酸化差异性修饰的蛋白质，例如运甲状腺 素蛋白（transthyretin，TTR)、血管紧张肽II和胰岛素样生长因子II。
[0011] CSF和血浆的蛋白质谱有很大的重合，有相当数目的蛋白质是CSF特有的，或者在 CNS中通过磷酸化或糖基化独特地修饰。
[0012] 设计侧向流测试（Lateral Flow Test)(或者也称为侧向流免疫色谱测定或试 条测试）来快速检测异质基质中是否存在给定分析物。目前市场上有多种侧向流测试用 于家用测试、即时测试（point of care testing)或实验室使用，例如怀孕测试（例如 FirstResponse?，ClearBlue?)、hiv测试（例如QraQuickADVANCE?, Clearview? Complete)或衣原体测试（例如ClearvieW?Chlamydia，inSTIcheck?Chlamydia)。
[0013]需要与 HIV 测试（如 OraQuickADVANCE?或ClearvieW?Complete)类 似的适于检测CSF的测试：它是即时测试；该测试仅是定性的；操作者使用该测试仅需最低 程度的训练；该测试在试片上有内部对照以确认准确取样。
【发明内容】
[0014] 在一个实施方案中，用于检测样品中是否存在脑脊液的装置包含：
[0015] 样品施加区，
[0016] 样品标记区，其包含针对CSF富集蛋白（CSF-enriched protein)的第一抗体，其 中所述第一抗体与流动颗粒缀合；
[0017] 样品检测区，其包含针对所述CSF富集蛋白的第二抗体，其中将所述第二抗体固 定到所述样品检测区，
[0018] 其中在第二区存在可检测条带指示所述样品中存在脑脊液。
[0019] 在另一实施方案中，检测样品中是否存在CSF的方法包括：
[0020] 将所述样品与对CSF富集蛋白特异的结合伴侣（binding partner)接触，以及
[0021] 检测结合伴侣-CSF富集蛋白复合物是否存在，其中可检测复合物的存在指示所 述样品中存在CSF。
[0022] 在上述实施方案中，所述CSF抗原是神经细胞粘附分子样蛋白同工型1(SEQ ID N0:1;登录号gi :62088238);链A，与牛胰胰蛋白酶抑制剂（Bpti)复合的人中胰蛋白 酶（Mesotrypsin) (SEQ ID N0 :2;登录号 gi :162330095) ;CNTN2 接触蛋白-2 前体（SEQ ID N0:3;登录号gi|4827022);CNTNl接触蛋白-1的同工型2(SEQ ID N0:4;登录号gi: 28373119);与SPARC样蛋白1高度相似的cDNA(未命名的蛋白质产物）（SEQ ID NO :5;登 录号：gi |194388050) ;NRCAM蛋白（神经元细胞粘附分子）[人（Homo sapiens)]可能的稍 长片段（~96kDa)(登录号：SEQ ID NO :6 ;gi | 68534652 和 SEQ ID NO :7 ;gi 11〇97315〇1); NCAM2 神经细胞粘附分子 2,同工型 CRA_a(SEQ ID NO :8 ;登录号 gi 1119630409) ;SERPINA3 丝氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子，进化枝A，成员3前体/a 1-抗胰凝乳蛋白酶的同工 型1/生长抑制蛋白25[人]或a 1-抗胰凝乳蛋白酶前体的稍长片段（SEQ ID N0 :9;登录 号gi 146981961) ;AGT血管紧张肽原（SEQ ID N0 :10;登录号gi |553181);血管紧张肽原 前体（丝氨酸蛋白酶抑制因子（Serpin)A8) (SEQ ID N0 :11;登录号gi|4557287);未命名 的蛋白质产物，也称为免疫球蛋白超家族，成员4B;在人中也称为细胞粘附分子3 (SEQ ID NO :12;登录号 gi 1187608363) ;cDNA FLJ59893, dickkopf 同源物 3 前体（SEQ ID NO :13; 登录号gi|40548389) ;SERPINF1丝氨酸（或半胱氨酸）蛋白酶抑制因子，进化枝F(a-2抗 纤溶酶（antiplasmin)，色素上皮衍生因子，Pedf)，成员1同工型4因子（SEQ ID N0:14 ; 登录号gi 115988024);与GC维生素D结合蛋白相似的人蛋白质，预测为维生素D结合蛋 白[黑猩猩（Pan troglodytes)] (SEQ ID NO :15;登录号181482) ;CD14人单核细胞抗原 CD14(CD14)(SEQ ID NO :16;登录号 gi |117646212) ;CADM3 人细胞粘附分子 3(CADM3)，转 录变体 1(SEQ ID N0:17;登录号 gi|90080503;SEQ ID N0:18;gi|l87608363(人）；神经 细胞粘附分子变体（SEQ ID N0:19;登录号gi :62088238);与CLU cDNA FLJ57622相似的 未命名蛋白质，与簇蛋白高度相似（SEQ ID N0:20;登录号gi|l89054091);与簇蛋白高度 相似的蛋白质（SEQ ID NO :21;登录号gi |193787502) ;LMAN2囊泡整合膜蛋白（Vesicular integral-membrane protein)VIP36(SEQ ID NO :22;登录号gi|l57834800);族蛋白同工型 1 [人](SEQ ID N0:23;登录号NM_001831.2);超氧化物歧化酶3,细胞外前体（SEQ ID NO: 24;登录号gi 1118582275);纤维蛋白a C端片段（SEQ ID NO :25;登录号gi | 223057);链 A，人激肽释放酶6 (Hk6)活化形式或KIK6激肽释放酶6的同工型1 (SEQ ID NO :26 ;登录号 gi | 21465970) ;APCS血清淀粉样P成分/链A或五聚体人血清淀粉样P成分（SEQ ID NO : 27 ;登录号gi|576259) ;FAM3C蛋白FAM3C/序列相似家族3,成员C前体[人]note ="预 测的成骨细胞蛋白；白介素样EMT诱导因子（SEQ ID N0:28 ;登录号gi|55629272);与未命 名蛋白质产物[食蟹猴（Macaca fascicularis)]相似的蛋白质，也称为免疫球蛋白超家 族，成员4B，在人中也称为细胞粘附分子3(SEQ ID N0:29;登录号gi|l87608363);上述CSF 抗原的CSF富集磷酸化或去磷酸化形式；或者两种或更多种上述CSF抗原的组合。
[0023] 在另一实施方案中，在体液、组织或微生物中检测反应物（reactant)的方法包 括：将所述体液、组织或微生物与两种或更多种抗体接触，其中每种抗体与所述反应物中的 抗原特异地反应，其中与单种抗体的反应不指示所述反应物的阳性测试，以及其中与所述 两种或更多种抗体的反应指示所述反应物的阳性测试。
【附图说明】
[0024] 图1是侧向流测定。通过滴管或通过直接浸蘸来将分析物添加到试片的左端。液 体（约75 y 1)被吸过试片到达右端。缀合物垫包含与可视颗粒（即金或胶乳微球）结合 的可溶IgG。如果分析物溶液含有分析物，抗体缀合并且复合物沿试片迀移。混合物首先接 触测试试片，其包含针对所述分析物的固定化抗体。然后分析物、可溶第一和可视标签与测 试线结合。如果不存在分析物，可溶成分流过测试线。无论是否存在分析物，与指示剂结合 的过量可溶IgG与结合至固定化抗球蛋白IgG相结合，所述抗球蛋白IgG与对照试片结合。
[0025] 图2显示CSF检测的多抗原方法的优势。上图显示多种测试条件的单抗原测定结 果，下图显示多抗原测定的结果。沿X轴的柱表示不同的测定条件，Y轴表示测定显示的免 疫反应性程度。上方阴影区表示在侧向流测定的测试线上有阳性比色反应。免疫反应性进 入阴影区的测定产生阳性测试结果。柱1 :上图的CSF柱表明单个抗原的免疫反应性足以产 生阳性测试结果。或者在多抗原图（下方）中，每个产生部分信号的抗原组合累积产生阳 性测定结果。柱2 :被血液污染的CSF产生类似的阳性反应，具有较小但叠加的血液免疫反 应性（上方粗边柱）。柱3:异常CSF/血液样品，其中抗原1免疫反应性弱。在单个抗原测 定中，测定产生假阴性，但由于其他5种抗原的免疫反应性未减弱，多抗原测定仍高于测定 阈值。柱4 :不具抗原1的免疫反应性的CSF/血液。与柱3的结果相同。柱5 :无CSF但血 液中含有交叉反应性抗原。在这种情况下，单个抗原测定产生加阳性，但是由于单个抗原的 免疫反应性不足以在多抗原测定中产生阳性信号，测定产生正确的阴性结果。柱6 :无CSF 但抗原1的血液水平病理性升高。单抗原测定产生与升高的血液水平反应的假阳性。多抗 原测定与血液中的病原性抗原1水平反应，但未达到假阳性的阈值。该测定用5种抗原/ 抗体1/抗体2的混合进行，但另一些实施方案可以包含2至多达10种的抗原/抗体1/抗 体2混合。
[0026] 图3 :CSF和血液蛋白质的二维凝胶电泳。单个试验的实例，其中对100 y g的Cy 标签化CSF蛋白⑷与100 y g的Cy3标签化血液蛋白⑶进行二维分离。A和B是使用不 同激发和发射条件的同一凝胶的灰度图。pH范围为4-8。C)是两通道的RGB合并，其中黄 色点表示显著重叠。D)是CSF或血液中富集>5倍的点的自动提取。所有样品均2次耗尽 (cbpleted)主要血