] 移除前面的玻璃板，然后固定凝胶并用Sypro Ruby染色，该荧光染料用于引导从 凝胶中切取目的点。使用对凝胶中所有蛋白质进行染色的Sypro Ruby的原因在于，进行Cy 染料标记以使掺入的程度对于每摩尔蛋白质的Cy染料摩尔数而言< 5%。由于Cy染料有 约580Da的丽，用Cy染料标记的低丽蛋白质（例如10Kd)不会在SDS PAGE方向与未标记 的对应物准确地共迀移。
[0058] 用GE Healthcare DeCyder?软件对凝胶图像进行定量，以鉴定待切取并进行基于 MS之蛋白质鉴定的差异表达蛋白点的"选取名单"。DeCyder?软件可以分析任何两个同一 凝胶或不同凝胶上的Cy染色凝胶图像，将两个图像上的点匹配，然后鉴定差异表达的蛋白 质点。DeCyder?软件使用Cy-2内部标准，自动输出包含t检验值的蛋白质表达有统计学 显著差异的名单。使用多种标准（包括面积、体积、3D峰斜率、3D峰高度和/或统计变异） 来鉴定差异表达的点。通过软件高亮两个样品中显示不同强度程度的蛋白质点，并进行人 工确认。DeCyder?软件还用于分析Sypro Ruby图像，将用Sypro染色发现的点与用Cy染 料染色鉴定的点相匹配，然后从Sypro染色的凝胶图像中选择"选取名单"。
[0059] 将蛋白质点选取名单转移到Ettan? Spot Picker仪器（GE Healthcare)，其自动 从凝胶中切取所选的蛋白质点，并将它们转移到96孔微滴定板中。
[0060] 然后在Ettan? TA消化器上对切取的蛋白质点进行自动的凝胶内胰酶消化。
[0061] 将每个消化物的等分试样点在（与基质一起）MALDI_MS靶上。
[0062] 对每个靶获得高质量准确度、自动的MALDI-MS/MS谱（使用Applied Biosystems 4800 Tof/Tof仪器），使用Mascot算法对所得的肽质量进行数据库搜索。
[0063]对未通过该方法鉴定的蛋白质点消化物的剩余等分试样进行纳米喷雾 (nanospray)或 LC/MS/MS 分析（Micromass Q-Tof)，然后对所得的 MS/MS 谱进行 Sequest 数据库搜索以鉴定样品中存在的蛋白质。
[0064] 将CSF富集的蛋白磷酸化位点作为CSF测试试片的抗原
[0065] 在鉴定CSF富集蛋白的焚光差异凝胶电泳（Fluorescence Difference Gel Electrophoresis，DIGE)过程中，鉴定了在CSF中高度富集（即在血液样品中不存在）的 在pH维分布的点，但是通过LC-MS鉴定蛋白质后，发现这些蛋白质中很多实际上存在于血 液中，但在凝胶的pH维具有不同的图谱（图6)。相同分子量的规律性间隔点通常表示相 同蛋白质的不同磷酸化形式。pH维的不同且规律的迀移指示PCV基团负电荷大但量子化 (quantal)的特性。在对这些点阵列进行磷酸化肽图谱后，认定事实上就是这种情况。这 些蛋白质中的几种（包括血管紧张肽原）（图6)具有高度CSF富集的磷酸化。在一些情况 下，这些磷酸化位点是丝氨酸/苏氨酸磷酸化，另一些情况下它们是酪氨酸磷酸化。总之， 选择每个蛋白具有多个CSF富集位点的蛋白质（即血管紧张肽原）。由于可以生成仅在磷 酸化时识别单个表位的抗体，在本文所述的测定中包含磷酸化位点来作为抗原。这些磷酸 化表位作为候选是吸引人的，因为它们非常普遍，而且在单个蛋白质上存在2个CSF富集磷 酸化位点使得可以制造针对不同位点的抗体对，将它们分别用于试片的流动和固定区以获 取阳性反应的双磷酸化。我们进行DIGE电泳比较已用碱性磷酸酶去磷酸化的CSF蛋白（图 9)。这鉴定出了本文列出的在CSF中被差异性磷酸化的蛋白质。
[0066] 使用2维DIGE凝胶电泳然后通过胰酶消化和LC-MS来鉴定抗原。在电泳之前通 过亲和柱去除血液和CSF中的主要蛋白质。这些蛋白质在体液中普遍存在（即白蛋白、免 疫球蛋白等）。我们将所有样品过柱两次以去除14种主要血清蛋白质。我们在凝胶上对 来自l-2ml全血的提取蛋白质和来自200 yl CSF的蛋白质进行电泳。这富集了血液蛋白 质以确保我们鉴定的蛋白质是在CSF中富集的。使用Cy3或Cy5荧光标记来自CSF的蛋白 质。与之相反，血液蛋白质分别用Cy5或Cy3标记。然后混合样品，并上样到2维PAGE凝 胶。进行多种不同的凝胶电泳，它们集中于分子量维（Y维）和pH维（X维）的不同区域。 凝胶电泳之后，通过自动化的计算机程序对可见差异性荧光标记的蛋白质的强度进行量化 和比较。机械自动收集在CSF中富集至少5倍的那些点，用胰酶消化并通过LC-MS分析。 将肽分子量与公开的数据库进行比较。选择富集的蛋白质作为候选，使用标准分子生物学 方法在细菌中生产组氨酸标记的重组蛋白质，或者通过合成产生对应于蛋白质特定区域的 肽。商业公司使用所提供的抗原生产单克隆和多克隆抗体。使用溴化氰活化柱通过标准柱 技术进行亲和纯化，使用重组蛋白质进行免疫。通过胰酶和胰凝乳蛋白酶消化，然后通过 LC-MS和磷酸化肽测定来鉴定CSF特异抗原。
[0067]如下进行CSF富集抗体的确认：在SDS-PAGE上分离分离体积的全部体液蛋白质， 转移到硝化纤维素膜，先用针对抗原的第一抗体进行免疫印迹，然后用HRP标记的第二抗 体进行免疫印迹，然后进行ECL定量。与在更大体积的全血、鼻和耳流出物、泪液、唾液或汗 液中水平相比，在CSF中的免疫反应性> 5倍的抗原被选择。测试20至30个不同个体的 体液样品中的每种抗原。从保证纯度的商业实验室购得流体样品或者直接采集。被测试体 液的个体范围为：年龄从婴儿至老年（75岁），男性和女性，以及几种常见的病理状态（即 晚期糖尿病、冠状动脉病、哮喘等）。
[0068]为了鉴定具体抗原的磷酸化状态，如上所述进行二维凝胶，但生成3种标记的蛋 白质级分（Cy2、Cy3和Cy5) :CSF、全血和CSF蛋白，其中标记前在额外的步骤中通过碱性磷 酸酶去除所有蛋白质的磷酸化。然后比较去磷酸化和正常CSF通道之间的差异。收集去磷 酸化后消失以及在血液蛋白质荧光通道中不存在的点并进行测序。通过磷酸化肽和磷酸化 氨基酸分析，体外磷酸化重组蛋白质和蛋白质片段和与磷酸化特异抗体的免疫反应性来对 磷酸化位点进行确定性鉴定。
[0069]抗体被选择用于测试试片后，通过使用重组抗原的纯样品测定稀释曲线来测定每 种抗体的相对亲和力。这将指导待加入测试试片的抗体的混合。
[0070] 在一个实施方案中，本文包括在床边或伤员分类点（triage site)快速测试体液、 手术部位或伤口是否存在脑脊液的装置和方法。在另一实施方案中，提出了允许检测血液、 血浆或血清样品中的CSF富集蛋白以作为中枢神经系统（CNS)伤口、缺口或损伤之指示的 测试。测试可以包含本文所述的一种或多种抗原作为CNS损伤的标志物。本文描述了新鉴 定的CSF特异或富集抗原，它们可以单独或组合使用来检测多种（从儿童至老年）个体的 CSF，而无需考虑可改变体液成分的疾病、个人习惯或个体遗传变异情况。
[0071] 在一个实施方案中，本文包括在样品（例如被怀疑含有脑脊液的样品）中检测脑 脊液的装置，其中所述装置包含对上述一种或更多种CSF抗原特异的一种或更多种抗体。 可以组合使用CSF抗原以提高信噪比，并且克服不同体液中上述抗原表达有个体差异的问 题。在一些实施方案中，多抗原检测提供超过单CSF富集抗原检测的敏感性和选择性。
[0072] 在一个实施方案中，本文描述了在样品（例如被怀疑含有脑脊液的样品）中检测 脑脊液的装置，其中所述装置包含对一种或更多种CSF抗原特异的一种或更多种抗体，所 述CSF抗原为翻译后修饰状态，该状态对脑脊液特异，并且能通过翻译后修饰与其他体液 中的相同抗原区分开。
[0073]在一些实施方案中，本文描述了在样品（例如被怀疑含有脑脊液的样品）中检测 脑脊液的装置，其中所述装置包含对一种或更多种CSF抗原特异的一种或更多种抗体，所 述CSF抗原为磷酸化状态，该状态对脑脊液特异，并且能通过磷酸化与其他体液中的相同 抗原区分开。
[0074]使用本文所公开的装置进行测试的样品可以获取自人体的不同部位，例如可能有 CSF渗漏的手术部位（即头、颈、耳、PB、鼻或脊椎手术）；硬脑膜外注射或脊椎抽液部位；或 者可发生脑膜破损（即头、颈、脊髓、鼻腔、鼻、耳、咽、颅骨等）或受伤当事人显示出可能有 脑膜破损或中枢神经系统严重损伤之征兆的区域中的损伤部位；或硬脑膜外注射、脊椎注 射或脊椎抽液部位。本文鉴定的抗原尤其是脑损伤的良好标志物。另外的样品包括唾液和 尿液样品。
[0075] 进行2D-DIGE研宄以比较人CSF和血清的成分的独特方法得到了对CSF特异或在 其中高度富集的多种抗原。对这些抗原特异的抗体是CSF在体液或伤口、手术或注射部位 存在的标志物，CSF在这些部位的存在是不正常的，并且潜在地威胁患者或外伤受害者的健 康或生命。
[0076] 在一些实施方案中，上述CSF抗原具有翻译后修饰，如磷酸化、糖基化、SUM0化 (sumoylation)、泛素化、脂化、亚硝基化、酰化、类泛素化（neddylation)，其中这些对CSF 形式的抗原特异的翻译后修饰可用于侧向流测定、Western印迹、ELISA或免疫沉淀。
[0077] 在一些实施方案中，可以在任意的多种测定（侧向流、western印迹、ELISA或免疫 沉淀）中使用多抗原，可以包括检测简单抗原（即未修饰抗原）的抗体与检测翻译后修饰 抗原（如以上所述）的抗体的组合。
[0078] 在一个实施方案中，使用抗体测定样品中是否含有指示CSF是否存在的与CSF存 在相关之多肽。抗体结合可以通过以下来检测，例如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附 测定）、"夹心法"免疫测定、免疫放射性测定（immunoradiometric assay)、表面等离子共 振、免疫细胞化学、免疫组织化学、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定（例如 使用胶体金、酶或放射同位素标记）、western印迹、沉淀反应、凝集测定（例如凝胶凝集测 定、血凝素测定等）、补体结合测定（complement fixation assay)、免疫焚光测定、蛋白A 测定和免疫电泳测定等。可以使用酶学、生色、荧光、生物发光、发光、有色胶乳珠、胶体金和 /或银的方法进行抗体结合的检测。
[0079] 在一个实施方案中，通过检测第一抗体上的标记来检测抗体结合。在另一实施方 案中，通过检测第二抗体或针对第一抗体的试剂的结合来检测第一抗体。在又一实施方案 中，标记第二抗体。本领域已知许多在免疫测定中检测结合的方法。
[0080] 在一些实施方案中，使用自动化的检测测定。免疫测定的自动化方法包括美国专 利No. 5, 885, 530、4, 981，785、6, 159, 750和5, 358, 691 (每个均通过引用并入本文）中描述 的那些。在一些实施方案中，分析和结果的提供也是自动化的。例如，在一些实施方案中， 软件根据所使用的免疫测定的结果生成与特定多肽存在相关的分数和样品中存在CSF的 可能性。
[0081]在另一些实施方案中，免疫测定描述于美国专利No. 5, 599, 677和5, 672, 480,它 们每个通过引用并入本文。
[0082]本文提供了分离的抗体或抗体片段（例如Fab片段、Fab2片段等）。可以生成抗 体以检测与CSF存在相关之多肽。使用多种与CSF存在相关之多肽、合成肽和/或重组蛋 白质及其片段制备抗体。在一个实施方案中，免疫原是与CSF存在相关之多肽、合成肽和/ 或重组蛋白质，以生成识别与CSF存在相关之多肽的抗体。在一个实施方案中，抗体对天然 或"折叠"蛋白质有反应性。在另一实施方案中，抗体对变性蛋白质（包括用去污剂增溶蛋 白质）有反应性。这些抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段、Fab表达文 库或重组（例如嵌合、人源化等）抗体，前提是其可识别蛋白质。可以根据常规抗体或抗血 清制备方法是用蛋白质或肽作为抗原生成抗体。
[0083] 使用多种方法生成靶向与CSF存在相关之多肽的多克隆抗体。对于抗体的生成， 通过用与CSF存在相关之多肽、合成肽和/或重组蛋白质或其片段来注射免疫多种宿主动 物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、鸡、驴等。在一个具体的实施方案中，将肽与免 疫原性载体（例如白喉类毒