一种胎儿有核红细胞的捕获及鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种胎儿有核红细胞的捕获及鉴定方法。
【背景技术】
[0002]胎儿有核红细胞是胎儿造血系统及胎儿外周血液循环的一个特征性标志，它不仅存在于胎儿的血液循环中，而且可以通过胎盘屏障进入母体外周血液。胎儿有核红细胞具有多种特征:①正常人外周血中不存在有核红细胞，若出现则属于病理现象；②属单个核细胞，含胎儿全部基因组；③表面具有较多的相对特异的抗原成份如CD71，CD36和血型糖蛋白(GPA)等；④妊娠妇女外周血中含量较少，在1: 105?1: 109之间；⑤生命周期短，约90天产后在母血中很快消失，用于诊断时不受前次妊娠影响。有核红细胞的特殊性质，为某些病理妊娠的预测和诊断提供了新思路，其中，产前利用母血中的胎儿有核红细胞筛查胎儿遗传性疾病，已经成为近年新发展起来的一项无创性产前诊断技术。
[0003]正常人血液中，有核红细胞和白细胞同属于单核细胞，白细胞直径约为7-20um，有核红细胞直径约为10-20um，且形态相差不大，但是，白细胞的数目大约为4-10 *106/ml，而有核红细胞的数目仅为几颗到几百颗，数量上相差巨大，因此，如何实现高效率和高纯度的从数百万颗白细胞中分选出所需要的几颗到几百颗有核红细胞，即从血液中捕获到有核红细胞并对其进行鉴定，是一个重要的研宄课题。
[0004]目前，常用的细胞分选技术是流式细胞术，但是该技术使用的设备昂贵、体积庞大、需要专业人员进行操作，而且细胞的用量较大，难以在实验室和医院普及推广。磁激活细胞分选法操作相对简单，费用相对低廉，用时短，其原理是在外加磁场的作用下，将结合磁性微粒的单克隆抗体标记的细胞分离出来。所使用的抗体可以分为阳性选择标记和阴性选择标记，阳性标记包含胎儿有核红细胞表面一些特异性的抗原标志物如转铁蛋白受体(transferrin receptor, CD71)、血型糖蛋白 A (glycophorin A, GPA )、血检敏感素受体(thromboxane receptor, 0)36);阴性选择标记包括⑶45，0)14，0)32等。但该方法分离的纯度不高，除需要分离的靶细胞外，淋巴细胞和一些单核细胞也可能被激活，所以，分选时抗体的选择显得至关重要。单细胞显微操作分离法是在显微镜下从形态学上识别靶细胞，并用微操作器将其逐一挑取出，然后进行分析。该技术分选纯度高，但是技术难度大，仪器设备要求高，不易推广。
[0005]另外，对有核红细胞进行鉴定所采用方法包括:免疫化学法，免疫荧光蛋白标记法。免疫化学法主要观察细胞核与细胞质的比例判断细胞类型，但是工作费时且误判率较高；免疫荧光蛋白标记法使用带有荧光基团的抗体标记细胞，例如转铁蛋白受体CD71或者Y珠蛋白(gamma-hemoglobin-chain)等，但是抗体特异性不高，检测效果不好；另外还有对男性胎儿细胞中Y染色体特异序列进行PCR扩增或用Y染色体特异序列的探针进行荧光原位杂交(FISH )，若检测出Y染色体考虑为胎源性的有核红细胞，这种方法简单但受性别限制。因此，本领域迫切需要一种新型的高灵敏度、高特异性的有核红细胞捕获及鉴定的方法。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种灵敏度高、特异性强、操作简便的胎儿有核红细胞的捕获及鉴定方法。
[0007]具体地，所述方法包括以下步骤:
步骤一:制备生物素标记的抗体，所述抗体为识别一种或多种胎儿有核红细胞表面特异性蛋白的抗体；
步骤二:将步骤一所得抗体亲和到化学修饰后的纳米基底膜上，再加入胎儿有核红细胞悬浮液，在恒温细胞培养箱中静置，使胎儿有核红细胞被纳米基底膜上的抗体捕获；步骤三:以激发波长不同的荧光染料分别标记的胎儿红细胞血红蛋白抗体和胎儿有核红细胞膜蛋白抗体作为双抗体，采用“双阳性”免疫荧光染色法鉴定经步骤二捕获的胎儿有核红细胞。
[0008]本发明所述步骤一中:
所述抗体是胎儿有核红细胞表面特异性蛋白的抗体，所述特异性蛋白作为抗原标志物，包括 CD14、CD32、CD35、CD36、CD45、CD47、CD71、CD147、GPA 或 ΕΡΟ-r，上述特异性蛋白除可在有核红细胞表达外，在活化的淋巴细胞、网织红细胞、血小板表面也有一定程度的表达。在使用单一的抗体时，分选所得的胎儿有核红细胞保持较高纯度，所述抗体优选为CD 147抗体蛋白；联合使用CD36与GPA或CD71与GPA抗体蛋白可以实现有核红细胞捕获的富集效果。
[0009]所述抗体可由市场购买的抗体蛋白按照常规方法与生物素进行结合后得到；或直接购买生物素标记后的抗体蛋白母液经稀释后得到，具体步骤为:取生物素标记的抗体蛋白母液，使用无菌PBS将抗体的浓度稀释10倍，在-20°C条件下保存备用。
[0010]本发明所述步骤二中:
所述纳米基底膜以纳米颗粒为原料，在玻璃衬底上制备而成，所述玻璃底衬表面应光滑、平整、干净，使纳米颗粒能够在其表面成膜。具体的，制备纳米基底膜的步骤为:使用钛酸四丁酯在去离子水中水解合成粒径为300~500nm纳米颗粒，将合成的纳米颗粒分散到有机溶剂中，优选有机溶剂的组成为0.05g月桂酸、0.2g乙基纤维素、1ml松油醇和1ml乙醇，均匀涂覆到干净玻璃表面，450-5500C高温退火10~20分钟，优选为500°C高温退火15分钟，即得表面粗糙度为40~100nm的纳米基底膜。本发明提供的纳米材料捕获基底能够增强与细胞表面化合物的相互作用，提高捕获的效果，这是其他荧光活化法和免疫磁珠法捕获有核红细胞所不具备的优势。本发明可以通过改变制备条件合成不同粒径的纳米颗粒以及控制纳米基底膜表面的粗糙度来达到有核红细胞的最佳捕获效果，作为最优选方案，本发明所使用的纳米颗粒粒径为400nm，纳米基底膜的表面粗糙度为85nm。
[0011]所述纳米基底膜的化学修饰具体包括以下步骤:使用无水乙醇清洗纳米基底膜表面；将纳米基底膜浸泡到浓度为4%的3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTM)溶液中1~1.5小时，使用无水乙醇清洗3次，再使用二甲基亚砜(DMSO)清洗3次；将纳米基底膜浸泡到浓度为lmg/ml的N-马来酰亚胺琥珀酰亚胺酯(GMBS)溶液中45~60分钟，使用DMSO清洗3次，再使用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次；在纳米基底膜表面覆盖上50ug/ml的链霉亲和素(SA)，在4°C放置过夜，即得化学修饰后的纳米基底膜。
[0012]所述抗体亲和到纳米基底膜上的方法为静置，静置时间为1~3小时，优选为2小时。
[0013]所述胎儿有核红细胞悬浮液的制备方法为常规的密度梯度离心法，其中，分离液的密度优选为1.097-1.099，离心力优选为400g。
[0014]所述在恒温细胞培养箱中静置的时间优选为1~1.5小时。
[0015]所述步骤二还包括:用PBS洗掉纳米基底膜上未被捕获的胎儿有核红细胞细胞。
[0016]本发明所述步骤三中:
“双阳性”免疫荧光染色法采用激发波长不同的荧光染料分别标记的胎儿红细胞血红蛋白抗体和胎儿有核红细胞膜蛋白抗体作为双抗体，对胎儿有核红细胞进行识别，以双抗体同时标记为阳性作为胎儿有核红细胞鉴定的标准；在众多的胎儿有核红细胞的膜蛋白中，结合使用膜蛋白CD71和细胞质蛋白ε -HbF鉴定胎儿有核红细胞特异性较高。
[0017]具体的，步骤三包括以下步骤:对胎儿有核红细胞进行预处理，用4%多聚甲醛溶液固定，固定时间优选为10分钟；用0.1%的Triton X-100溶液打孔，打孔时间优选为10分钟；使用封闭液封闭，封闭时间优选为10分钟；加入含有激发波长不同的焚光染料分别标记的⑶71抗体和ε -HbF抗体的混合液，所述混合液的配制比例为ε -HbF抗体:⑶71抗体:封闭液(w%) =0.5-1.5:0.5-1.5:6-10，优选所述混合液的配置比例为ε-HbF:⑶71:封闭液(w%) =1:1: 8，在4°C下避光保存过夜；使用浓度为0.lug/ml的细胞核染料DAPI复染细胞核，复染时间优选为10分钟；用去离子水清洗后置于荧光显微镜下观察，并使用(XD拍摄结果。
[0018]本发明所述磷酸盐缓冲液的浓度优选0.09-0.llmol/Lo
[0019]本发明所述胎儿有核红细胞的鉴定标准为:胎儿有核红细胞荧光结果为ant1-ε-HbF亮/ anti_CD71亮/DAPI亮，并且ant1-ε-HbF和DAPI荧光亮度形成互补，细胞尺寸为10-30um;白细胞的荧光结果为ant1-e-HbF不亮/ ant1-⑶71稍亮/DAPI亮，细胞尺寸小于15um。
[0020]与现有技术相比，本发明提供的方法具有显著优点，主要表现在:(1)使用新型抗体蛋白实现对特殊细胞的识别捕获对于新型抗体蛋白的相关研宄有重要意义；(2)利用新型抗体对胎儿有核红细胞进彳丁特异性识别捕获，可以有效提尚目标细胞的识别捕获效率，对于胎儿有核红细胞的相关研宄有重要意义；(3)运用“双阳性”免疫荧光蛋白对胎儿有核红细胞进行鉴定分析，可以提高鉴别的可靠性和灵敏度，有助于胎儿有核红细胞的相关研宄。
【附图说明】
[0021]图1示出了本发明所述方法的流程图。
[0022]图2示出了纳米基底膜的实物图。
[0023]图3示出了新型抗体对胎儿有核红细胞捕获的示意图，其中，100为玻璃衬底，200为纳米颗粒，胎儿有核红细胞300的表面抗原被特异性抗体201识别捕获。
[0024]图4示出了特异性识别捕获的明场效果图；其中200表示纳米基底膜，300表示捕获到基底上的细胞。
[0025]图5示出了方法利用“双阳性”免疫荧光蛋白染色鉴定胎儿有核红细胞的荧光效果图；其中a、e为血红蛋白荧光(红色)，b、f为转铁蛋白荧光(绿色)，C、g为细胞核(蓝色)，d、h为荧光合成图，a、b、c均有荧光表示为胎儿有核红细胞；而e、f不亮，仅g