一种细胞中葛根素分布差异荧光检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体涉及一种细胞中葛根素分布差异荧光检测方法。
【背景技术】
[0002] 由于大脑组织的复杂性，药物在脑部不同种类神经细胞中的分布差异研究是神经 药理学研究的一大难题。葛根素是中药葛根的主要药效成分，现代药理学研究表明，葛根素 对6-羟多巴胺、D-半乳糖、H202、缺氧复氧等各种因素诱导的阿尔茨海默症、帕金森病、缺血 /再灌注损伤等动物模型及原代培养的神经元、胶质细胞及其它神经细胞系细胞等细胞模 型具有明显的保护活性，其机制包括减轻线粒体氧化应激、抗细胞凋亡、减轻神经细胞兴奋 性毒性及促进细胞增殖等。尽管葛根素的神经保护作用已被广泛证实，但其在神经系统的 靶细胞及作用靶位仍不清晰，目前尚未见葛根素在不同种类神经细胞间分布差异的报道。
[0003] HPLC、UPLC-MS/MS、毛细管电泳及流动注射化学发光法等方法已经普遍用于不同 组织样品中葛根素的含量分析，但这些方法存在成本较高、耗时较长等缺点。基于其异黄酮 类化学结构，紫外光源下葛根素可发射蓝色荧光，S.Michihara(2011)建立了葛根中葛根素 含量测定的荧光分光光度法，但尚未见该法应用于细胞中葛根素含量检测的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一是为解决细胞中葛根素分布差异检测困难，成本高，耗时长的 问题，提供一种方便快捷的细胞中葛根素分布差异荧光检测方法。
[0005] 本发明提供一种细胞中葛根素分布差异荧光检测方法，包括以下步骤：
[0006] 在细胞培养体内加入葛根素；
[0007] 收集细胞并制备样品；
[0008] 将所述样品以xex/em为342/461nm，激发狭缝10nm，发射狭缝10nm的条件，用焚 光分光光度法检测葛根素含量。
[0009] 进一步的，所述制备样品包括清洗细胞、消化细胞、重悬细胞和破碎细胞。
[0010] 进一步的，所述清洗细胞方法为，以0.Olmol/L的PBS清洗两次，每次0. 5min。
[0011] 进一步的，所述消化细胞方法为采用0. 25%胰蛋白酶-EDTA= 1:1的复合消化液 进行细胞消化。
[0012] 进一步的，所述重悬细胞方法为以0. 01mol/L的PBS重悬细胞至细胞密度为 5X105个/mL，终体积为2mL。
[0013] 进一步的，所述破碎细胞方法为超声破碎。
[0014] 进一步的，所述加入葛根素终浓度为1000ng/mL。
[0015] 本发明的有益效果在于：本发明的细胞中葛根素分布差异荧光检测方法具有较好 的专属性、精密度、回收率及线性关系，并具有简便、快捷及成本较低的优点，可用于不同细 胞中葛根素含量的检测。本研究发现，在新生大鼠原代神经元与星形胶质细胞共培养体及 单独培养细胞内，葛根素星形胶质细胞中浓度较低，在神经元中的浓度更高。当葛根素加入 60min到90min时，单独培养及共细培养体中的星形胶质细胞中未检出葛根素，而神经元中 葛根素维持在12. 8ng/mL，且在观察时间120min内一直未被细胞完全排出。葛根素在神经 元中的分布浓度和时间始终高于在星形胶质细胞中的分布，这无疑对于神经元的保护和修 复作用有利，也从另一个角度揭示了葛根素对脑保护临床疗效的作用基础。
【附图说明】
[0016] 图1所示为本发明细胞中葛根素分布差异荧光检测方法葛根素激发光谱；
[0017] 图2所示为本发明细胞中葛根素分布差异荧光检测方法葛根素342nm发射光谱；
[0018] 图3所示为本发明细胞中葛根素分布差异荧光检测方法专属性细胞提取液吸收 曲线；
[0019] 图4所示为本发明细胞中葛根素分布差异荧光检测方法线性标准曲线；
[0020] 图5所示为本发明细胞中葛根素分布差异荧光检测方法测得不同培养时间下两 种细胞内葛根素的浓度变化。
【具体实施方式】
[0021] 下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中 描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达 到更好的技术效果。
[0022] 荧光检测方法建立：
[0023] 1、扫描检测波长：将不含葛根素的神经元细胞与星形胶质细胞培养物按1 :1的比 例混合，以0.Olmol/L的PBS清洗2次，每次0. 5min。清洗后的细胞用0. 25%胰蛋白酶-EDTA =1:1的复合消化液消化细胞。再以〇.Olmol/L的PBS重悬细胞至密度为5X105个/mL， 终体积为2mL。超声破碎细胞，1. 5X104(Xg)离心20min，得到细胞提取液。向细胞提取 液中加入葛根素至终浓度为50ng/mL，用以检测最大激发波长和发射波长，激发与发射狭缝 均为10nm。经测定，葛根素的Aex/em为342/461nm。葛根素激发光谱如图1所示，葛根素 342nm发射光谱如图2所示。
[0024] 2、建立检测方法：以不含葛根素的细胞提取液考察方法的专属性，专属性细胞提 取液吸收曲线如图3所示。以细胞提取液配制6. 25,12. 5, 25, 50,100ng/mL葛根素标准品 溶液并建立标准曲线，线性关系为y= 4. 5107x-0. 375，R2= 0. 9978,标准曲线如图4所示。 检测限为3. 45ng/mL。以6. 25, 25,100ng/mL标准葛根素溶液考察方法的精密度与回收率。 精密度和回收率如表1所示。
[0025] 表1荧光分光光度法的精密度与回收率上SD，n==5)
[0026]
[0027] 3、细胞内葛根素浓度检测：在受试细胞培养体内加入葛根素至终浓度为lOOOng/ mL。在药物加入后的0,10,20,30,60,90min收集细胞。每个时间点收集的细胞以0.Olmol/ L的PBS清洗2次，每次0. 5min。清洗后的细胞用0. 25%胰蛋白酶-EDTA= 1:1的复合消 化液消化细胞。再以0. 01m〇l/L的PBS重悬细胞至密度为5X105个/mL，终体积为2mL。超 声破碎细胞，1. 5X104(Xg)离心20min后用荧光分光光度计检测葛根素含量，荧光条件为 入ex/em为342/461nm，入射狭缝10nm，激发狭缝10nm。
[0028] 葛根素在受试细胞中的浓度变化如图5所示。与星形胶质细胞相比，单独培养及 共培养神经元中葛根素具有更高的峰浓度及更长的分布时间，当药物与细胞共培养60min 到90min时，星形胶质细胞内未见药物检出，而神经元内葛根素维持在12. 80ng/mL。
[0029] 本发明的细胞中葛根素分布差异荧光检测方法具有较好的专属性、精密度、回收 率及线性关系，并具有简便、快捷及成本较低的优点，可用于不同细胞中葛根素含量的检 测。本研究发现，在新生大鼠原代神经元与星形胶质细胞共培养体及单独培养细胞内，葛 根素星形胶质细胞中浓度较低，在神经元中的浓度更高。当葛根素加入60min到90min 时，单独培养及共细培养体中的星形胶质细胞中未检出葛根素，而神经元中葛根素维持在 12. 8ng/mL，且在观察时间120min内一直未被细胞完全排出。葛根素在神经元中的分布浓 度和时间始终高于在星形胶质细胞中的分布，这无疑对于神经元的保护和修复作用有利， 也从另一个角度揭示了葛根素对脑保护临床疗效的作用基础。
[0030] 本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在 不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不 应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。
【主权项】
1. 一种细胞中葛根素分布差异荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 在细胞培养体内加入葛根素； 收集细胞并制备样品； 将所述样品以X ex/em为342/461nm，激发狭缝10nm，发射狭缝IOnm的条件，用焚光分 光光度法检测葛根素含量。2. 如权利要求1所述的细胞中葛根素分布差异荧光检测方法，其特征在于，所述制备 样品包括清洗细胞、消化细胞、重悬细胞和破碎细胞。3. 如权利要求2所述的细胞中葛根素分布差异荧光检测方法，其特征在于，所述清洗 细胞方法为，以〇. Olmol/L的PBS清洗两次，每次0. 5min。4. 如权利要求2所述的细胞中葛根素分布差异荧光检测方法，其特征在于，所述消化 细胞方法为采用〇. 25%胰蛋白酶-EDTA = 1:1的复合消化液进行细胞消化。5. 如权利要求2所述的细胞中葛根素分布差异荧光检测方法，其特征在于，所述重悬 细胞方法为以〇. Olmol/L的PBS重悬细胞至细胞密度为5 X IO5个/mL，终体积为2mL。6. 如权利要求2所述的细胞中葛根素分布差异荧光检测方法，其特征在于，所述破碎 细胞方法为超声破碎。7. 如权利要求1-6任一项所述的细胞中葛根素荧光检测方法，其特征在于，所述加入 葛根素终浓度为l〇〇〇ng/mL。
【专利摘要】本发明公开了一种细胞中葛根素分布差异荧光检测方法，包括以下步骤：在细胞培养体内加入葛根素；收集细胞并制备样品；将所述样品以λex/em为342/461nm，激发狭缝10nm，发射狭缝10nm的条件，用荧光分光光度法检测葛根素含量。本发明的细胞中葛根素分布差异荧光检测方法具有较好的专属性、精密度、回收率及线性关系，并具有简便、快捷及成本较低的优点，可用于不同细胞中葛根素含量的检测。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105021583
【申请号】CN201510424839
【发明人】魏述永, 徐晓玉, 吴俊伟, 刘娟, 陈红伟, 华玲
【申请人】西南大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月16日