的cDNA必需的所有试 剂。
[0062] 提供以下实施例1-3以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求书中 列出。应当理解可以在不偏离本发明的精神的前提下对所列的规程进行修改。
[0063] 实施例1
[0064] 用聚-L-赖氨酸包被膜载玻片
[0065] 将 PEN 膜载玻片（MicroDissect GmbH)用约 Iml 聚-L-赖氨酸溶液（0· 1 % w/ V，Sigma-Aldrich Chemie GmbH)覆盖，并在湿度室中于室温温育30分钟。通过实施有力的 摇动除去聚-L-赖氨酸溶液。随后，在UV光下将PEN膜载玻片干燥过夜。
[0066] 观察到的结果（未显示）：
[0067] 在应用于低温加热诱导的表位修复（LT-HIER，60°C，16h，pH 8)时，用聚-L-赖氨 酸包被PEN膜载玻片导致升高的组织切片对膜载玻片的附着。用聚-L-赖氨酸包被的膜载 玻片：3个组织切片中的0个从载玻片分离。没用聚-L-赖氨酸的膜载玻片：3个组织切片 中的3个从载玻片分尚。
[0068] 实施例2
[0069] 在没有/具有2M氯化钠的情况中的⑶31染色
[0070] 使用肿瘤样品的FFPET切片进行基于抗体的染色和随后的RNA分离。以下描述仅 涉及为了在存在2M氯化钠的情况中染色FFPET切片而实施的规程。对于没有氯化钠的实 验，在下述差异的情况下实施完全相同的规程：1)在染色规程中省略氯化钠，2)将与二抗 的温育实施30分钟（代替在2M氯化钠的情况中的2小时）。高盐浓度由于降低的二抗结 合效率而需要延长的温育时间。
[0071] 将5 μ m FFPET切片附着于经聚-L-赖氨酸包被的PEN膜载玻片，并在无尘环境中 干燥过夜。随后，在3% H2O2 (AppliChem GmbH)中温育FFPET切片5分钟。然后，在H2O PCR 级中将FFPET切片清洗2分钟。于60°C在表位修复溶液（Leica Microsystems GmbH)中 实施切片温育16小时。然后，实施用EnVision?抗小鼠 （DAKO GmbH)的⑶31染色。将氯 化钠（分子生物学级，Sigma-Aldrich Chemie GmbH)在所有染色试剂（Protein Block无 血清（DAKO GmbH)、一抗和二抗、DAB-色原体（Thermo Fisher Scientific GmbH)和 Tris 缓冲盐水和Tween 20 (TBS-T)清洗缓冲液）中溶解。氯化钠的终浓度是约2M。将切片在 TBS-T/氯化钠中冷却至室温达5分钟。在湿度室中将切片与100 μ IProtein Block/氯化 钠一起温育5分钟。随后，对切片抖落液体，并添加100 μ 1 -抗/氯化钠，用石蜡覆盖，并 于37°C温育1小时。用TBS-T/氯化钠清洗切片2次2分钟，然后添加100 μ 1二抗/氯化 钠，并在湿度室中于室温温育2小时。在用TBS-T/氯化钠清洗2次2分钟后，添加100 μ 1 DAB-色原体/氯化钠，并在湿度室中于室温温育5 - 10分钟。用TBS-T/氯化钠将切片清 洗2分钟。随后，用H2O (PCR级）将切片清洗2分钟。切割染色切片，并分离总的RNA (High Pure Paraffin RNA Kit, Roche Diagnostics GmbH)。通过光谱光度测定分析（NanoDrop ND 1000分光光度计）测定RNA浓度。通过本领域中公知的方法将RNA转录成cDNA。预扩 增cDNA。随后，通过实时PCR(!LigMGyd$r⑩Platform)实施扩增。
[0072] 观察到的结果：
[0073] 与未染色切片相比，在没有氯化钠情况中的⑶31染色切片的RNA浓度显著更低。 在具有氯化钠情况中的⑶31染色FFPET切片的RNA浓度与未染色切片没有显著差异（参 见图1)。
[0074] 与未染色切片相比，在没有氯化钠情况中的⑶31染色切片的Cp值（参照基因 HPRT)显著更高。在具有氯化钠情况中的⑶31染色FFPET切片的Cp值与未染色切片没有 显著差异（参见图2)。
[0075] 与未染色切片相比，在没有氯化钠情况中的⑶31染色切片的Cp-值（参照基因 ALAS1)显著更高。在具有氯化钠情况中的⑶31染色FFPET切片的Cp值与未染色切片没有 显著差异（参见图3)。
[0076] 实施例3
[0077] 对来自⑶31染色FFPET切片的两种标志物的基因表达分析
[0078] 本实施例显示了用根据描述的方法自⑶-31染色FFPET切片分离的RNA对基因表 达实验的适合性。对来自3份独立肿瘤样品的FFPET切片应用实施例2中描述的方法。在 膜载玻片上封固样品。使用连续激光捕捉显微切割来显微切割感兴趣区域（肿瘤和血管）。 通过分析分离的RNA获得分别关于肿瘤切割和血管切割中两种不同标志物（标志物1和标 志物2)表达的数据。一式两份实施实验。使用本领域中公知的方法将RNA转录成cDNA。 预扩增cDNA以获得足够的起始材料并且提高灵敏性。最终，使用实时PCR -式两份分析预 扩增的cDNA。分别通过相对应于参照基因 HPRT标准化标志物1和标志物2的表达获得标 志物1和标志物2的相对表达。
[0079] 观察到的结果：
[0080] 与先前对未染色的肿瘤样品实施的实验一致（数据未显示），图4显示了关于从3 份独立的⑶31染色肿瘤样品获得的标志物1和标志物2的相对表达样式的数据。图4A) 显示了与血管细胞相比，在肿瘤细胞中以更大的程度表达标志物1。此外，图4B)显示了与 肿瘤细胞相比，在血管细胞中以更大的程度表达标志物2。在此情况中，与血管细胞相比，月中 瘤细胞中的表达是非常低的，从而不能检出表达（未检出=n. d.)。由于可以再现未染色肿 瘤样品的分析（数据未显示），可以推断根据描述的染色方法不以影响结果的方式来显著 影响RNA质量。因此，凭借根据描述的方法，可以使RNA降解最小化，从而来自FFPET样品 的RNA的质量对于基因表达分析或用于分析RNA的任何其它方法是足够的。
【主权项】
1. 用于经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片的免疫组织化学染色的方法，其包 括以下步骤： a) 提供固体支持物， b) 将所述经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片封固到所述固体支持物上， c) 自所述经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片除去石蜡， d) 于50至70°C加热所述固体支持物上封固的组织切片达12至24小时以修复表位， 并 e) 染色所述固体支持物上封固的所述组织切片， 其中至少步骤e)在存在0. 5至3. OM氯化钠的情况中实施。2. 权利要求1的方法，其进一步包括以下步骤： f) 自所述固体支持物上封固的染色组织切片切出感兴趣区域， g) 自所述感兴趣区域分离RNA， h) 将分离的RNA逆转录成cDNA， i) 扩增和定量所述cDNA。3. 权利要求1或2的方法，其中用聚-L-赖氨酸包被所述固体支持物。4. 权利要求1-3的方法，其中氯化钠以1. 5至2. 5M的浓度存在。5. 权利要求1-4的方法，其中氯化钠以约2M的浓度存在。6. 权利要求1-5的方法，其中通过在二甲苯中温育所述固体支持物上封固的所述组织 切片实施除去所述石蜡。7. 权利要求1-6的方法，其中于55至65°C实施加热所述固体支持物上封固的所述组 织切片达14至18小时。8. 权利要求1-6的方法，其中于约60°C实施加热所述固体支持物上封固的所述组织切 片达约16小时。9. 权利要求1-8的方法，其中所述染色包括使用经标记的抗体。10. 权利要求1-9的方法，其中所述固体支持物是膜载玻片。11. 权利要求2-10的方法，其中步骤f)包括显微切割或宏观切割（macrodissecting) 感兴趣区域。12. 权利要求2-11的方法，其中所述感兴趣区域具有l-2mm2的大小。13. 权利要求2-12的方法，其中通过实时PCR实施扩增和定量cDNA的步骤。14. 一种用于实施根据权利要求1-13的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含： a) 用聚-赖氨酸包被的固体支持物， b) 用于表位修复的溶液，和 c) 用于免疫组织化学染色的溶液，其包含0. 5至3. OM浓度的氯化钠。15. 根据权利要求14的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含对于实施从RNA逆转录成 cDNA、cDNA的扩增和定量必需的所有试剂。
【专利摘要】本发明涉及用于经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片的免疫组织化学染色的方法，其包括以下步骤：a)提供固体支持物，b)将经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片封固到固体支持物上，c)自经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片除去石蜡，d)于50至70℃加热固体支持物上封固的组织切片达12至24小时以修复表位，并e)染色固体支持物上封固的组织切片，其中至少步骤e)在存在0.5至3.0M氯化钠的情况中实施。本发明进一步涉及用于实施所述方法的试剂盒。
【IPC分类】G01N1/30
【公开号】CN105051514
【申请号】CN201480004948
【发明人】B.巴尔, A.赫罗尔德, S.洛曼, S.穆斯曼, J.舒斯特, M.辛格
【申请人】霍夫曼-拉罗奇有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2014年1月22日
【公告号】CA2897360A1, EP2948750A1, US20150353992, WO2014114650A1