远心、宽场荧光扫描成像系统和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及定量荧光成像，并且更具体地涉及宽场荧光成像系统和方法。各种实 施例使得能够以对贯穿整个视场的接近完美的记录和测量，精确、定量、快速、连续宽场荧 光成像，诸如激光线扫描。
【背景技术】
[0002] 近年来，科研团体存在一种在组织成像工具中包括荧光检测的增长的期望。荧光 检测提供一种更可控、稳定的方式，例如以识别某些药物的影响。现在，许多自动显微系统 包括荧光成像能力。这些系统大多数通过使显微镜的载物台自动化，或者向自动扫描仪添 加显微成像器而建立。通常已经使它们的焦距自动执行典型的病理学家在他/她在显微镜 下检查组织载玻片时而执行的任务。这意味着这种系统必须首先是显微镜。显微成像提供 很大的优点，包括亚细胞细节，以及匹配病理学家通过显微镜直接观察的图像的潜力，但是 同时其趋向于非常缓慢。显微镜物镜对非常小的区域成像。例如，20X NA = 0.75物镜以~ 0. 4 ym的解析度对小于0.5mm宽的区域成像。所以，50mm x 25mm的载玻片面积将需要以停 走倾斜成像的5000个图像。通常，这对于彩色成像不是问题，如成像H&E (苏木精和伊红） 染色，因为短曝光时间足以检测信号。然而，对于荧光成像，低丰度标记将需要更长曝光时 间，并且因此这些方法导致扫描时间更长。更长扫描时间与典型实验要求扫描多个载玻片 使得确定进一步研究的感兴趣区域的事实结合意味着每次实验的总处理周期可能变为几 小时，要不就是几天。
[0003] 在较快速显微镜自动技术中，其中之一为现在是徕卡生物系统一部分的Aperio Technologies公司的Soenksen研发的美国专利8, 385, 619中公开的技术。Soenksen意识 到加快显微镜系统中的载玻片成像以及作为减少切片（带）的图像数目的具体实施线成像 自动化的需求。Soenksen使用线扫描时间延迟积分（TDI)相机以及物镜和聚焦光学器件， 以一次对一条线成像。TDI相机允许宽位照明（通过灯或LED)，并且一次读取作为一条线 的图像。这种技术确实提高了显微镜自动化，并且实现了更快的扫描结果以及较少拼图失 配问题。所实现的扫描时间似乎对于直接彩色成像（H&E染色）可接受，其中每个成像线的 曝光时间可能短，所以其覆盖较宽区域的总时间可能是合理的。但是，对于荧光成像，这种 技术仍需要每条线的较长曝光时间，并且结果是总扫描时间长得多。这对其中研究者将在 他/她还未了解他在寻找何物之前存在需要检查的一系列载玻片的情况产生瓶颈。仅基于 扫描载玻片的时间，仍存在一种对快速优先分配步骤的需求，以在自动化显微镜系统上确 定哪个载玻片具有将值得扫描的区域。期望这种优先分配步骤敏感，使得其不丢失下游系 统可能检测到的图像。同样也期望相对位置以及相对信号再现的精确性，使得精确地评定 是否进行至过程中的下一步骤，并且如果进行至下一步骤，确切地以高解析度扫描何处。
[0004] 诸如美国专利8, 385, 619中公开的基于显微镜的系统允许通过使用较低放大率 的物镜"显微成像"，从而对单通以更宽视场成像，并且因而以较少时间覆盖较大面积。然 而，这种方法存在至少两种主要限制的问题。首先，这种方法每线图像需要的曝光时间 长得多，因为低放大率物镜的NA比高放大率物镜低得多。例如，与变为光收集效率小~ (0. 75/0. 075)~2 = 100倍的用于20X的NA = 0. 75相比，典型的2X物镜具有低于0. 075的 NA。其次，显微镜的视场越大，朝着视场周界的衰减和畸变越大。这继而分别变为横跨视场 的敏感性变化以及多次通过之间的不精确记录。这些限制是基于物镜的成像系统工作方式 所固有的。
[0005] 显微和宏观两者的荧光成像的现有技术的另一关键缺点在于由于干涉滤光片的 角谱位移导致的信号吞吐量和横跨视场的光学背景抑制的变化。许多荧光染料的发射光谱 窄并且具有陡坡。图1示出用于LI-C0R的丨RDyeu800cw的典型吸收和发射光谱。在图1 中，也在图形上重叠用于在发射路径中选择某个窗口的典型长通滤光片。其显示两种入射 光条件下的滤光片的发射光谱：零度入射角（曲线3a)和20度入射角（曲线3b)。在用于 丨RDye';_800cw的大多数情况下，将需要将长通滤光片的边缘布置在发射曲线2的陡坡上， 以便允许激发光匹配吸收曲线1的空间。这意味着，如果在光穿过滤光片时入射角度改变， 则所收集的光量（在该角度下）改变。如果从视场的不同点收集的光最终以不同角度穿过 滤光片，则即使以相同的激发光量照亮两个位置，结果测量值也不同。表1示出典型干涉滤 光片的光谱位移量。在许多应用中，该量不大，显微镜应用中尤其如此，其中存在可能限制 其对于量化测量的有用性，例如其对焦距可变性的敏感性的其它更重要因素。对于大多数 显微镜系统，包括美国专利8, 385, 619中公开的系统，都不存在避免这种问题的措施，并且 因此滤光片通常都位于物镜和聚焦光学器件之间，其中通过物镜的成像清晰度，来自不同 场点的光必须以不同角度在与样本侧相反的物镜侧穿过（例如，参见美国专利8, 385, 619 的图2的元件50,以及美国专利申请2011/0121199的图2的Tanikawa元件13)〇
[0006] 本发明人认识到需要平均地提高横跨整个视场的背景抑制并且将其应用于对小 动物成像的需求。例如参见美国专利7, 286, 232。图2示出该方法的一个实施例，其中在成 像光学器件12和检测器阵列13之间产生远心空间18,使得从目标10上的不同点收集的光 以相同的角度范围穿过发射滤光片15。也在目标区域10和成像光学器件12之间添加拒波 滤光片14,以进一步提高拒波滤波。通过在成像光学器件12的前焦距平面处设置光圈16 而产生远心空间。这对于该目的以及任何类似的单拍宏观成像都运行良好。不需要担心如 本情况下的对目标扫描以覆盖更大区域，并且因此也不关注光穿过拒波滤光片时的角度变 化。然后，拒波滤光片的目标在于作为对放置在远心空间内的主发射滤波器的改进而抑制 反射光。不存在不牺牲信号地（即，降低成像NA)将这种前光圈技术应用于拒波滤光片的 明确方式，并且不期望诸如组织截面和组织阵列中的低丰度标记。
[0007] 其他人已经认识到实现各种任务但是不具有这里需要的功能的远心突出体的有 用性，即通过横跨整个视场的光谱滤光均匀性连续地、宽场成像。Sung-Ho Jo的美国专利 申请2012/0313008提供一种荧光检测器设计，其具有位于荧光选择单元（滤波器）和光接 收单元（检测器）之间的远心透镜。使用这种远心透镜的目的在于保持从不同井（well) 收集的光分离。因此，这不是一种其中同时对连续区域或线成像的成像应用。此外，荧光选 择单元仍处于非远心空间内。Gutekunst的美国专利7, 687, 260中的类似设计提供从地点 (井）阵列收集光。这里，通过在井的顶部上使用场透镜而在物侧上产生远心空间。这也未 解决滤光可变性。成像滤光片9(Guntekunst图1)仍处于非远心空间中。此外，这不是其 中关注对失真和相对位置精确性更严要求的宽场、连续成像。这种技术自身不适用于，与其 它上述技术的组合也不适用于本宽场成像问题。
[0008] 其它基于远心的理念也存在于流式细胞仪，其也不是宽场成像应用。例如， Imanishi的美国专利8, 467, 055公开了使用透镜48,以在检测器阵列侧上产生远心空间， 使得光栅47产生的不同光束以类似的角度进入检测器。这里也不存在关注，并且因此未特 别提供其中布置光谱滤光片的空间。
[0009] 因此，仍存在一种不具有取决于场中光所发源的角度的限制的更鲁棒、定量、快速 宏观荧光成像器的需求。此外，仍存在一种对精确地保持荧光在样本上的起源的相对位置 的需求，使得精确地对齐多通图像，并且因而消除当前宏观宽场成像器中存在的焦距相关 位置位移。
【发明内容】
[0010] 本公开涉及定量荧光成像，并且更具体地涉及宽场荧光成像系统和方法。
[0011] 根据实施例，提供一种荧光成像系统，其通常包括：源子系统，其具有保持荧光材 料的样本平台；光源，其以处于荧光材料的吸收带中的激发光照亮荧光材料；和第