剂2接 触，其中偶联剂2包含与可检测标记物（iv)偶联的链霉亲和素；（f)去除非珠结合的组分； 并且（g)通过流式细胞术确定对各可检测标记物（i)、（ii)或（iii)是阳性的珠上可检测 标记物（iv)的阳性或阴性结果，从而确定对象的乙肝感染状态。
[0014] 在一些实施方式中，该试验还包括通过流式细胞术检测至少一个校准对照物，其 中通过与至少一个校准对照物比较来确定对一个或多个可检测标记物是阳性和阴性的。在 一些实施方式中，阳性定义为高于校准对照物，并且阴性定义为低于校准对照物。在一些实 施方式中，该试验包括通过流式细胞术检测可检测标记物（iv)的校准对照物。在一些实施 方式中，该试验包括通过流式细胞术检测可检测标记物（i)、（ii)、（iii)和（iv)各自的校 准对照物。
[0015] 在一些实施方式中，步骤（g)包括当可检测标记物（iv)在珠（iii)和任选地在珠 (ii)上是阳性时确定对象具有急性乙肝感染。在一些实施方式中，步骤（g)包括当可检测 标记物（iv)在珠（i)上是阳性但不在珠（ii)或（iii)上是阳性时确定对象已经对乙肝 感染免疫。在一些实施方式中，步骤（g)包括当可检测标记物（iv)在珠（ii)和任选的珠 (iii)上是阳性但不在珠（i)上是阳性时确定对象曾接触乙肝。在一些实施方式中，步骤 (g)包括当可检测标记物（iv)在珠（i)和（ii)上是阳性但不在珠（iii)上是阳性时确定 对象曾感染乙肝。
[0016] 在一些实施方式中，可检测标记物（i)、（ii)和（iii)是荧光团的不同组合。在一 些实施方式中，可检测标记物（iv)选自PE和FITC。
[0017] 在一些实施方式中，珠（i)、（ii)和（iii)是磁力响应性的。在一些实施方式中， 步骤（b)、（d)和（f)中的1个、2个或全部包括洗涤固体支持物以去除非珠结合的组分。在 一些实施方式中，生物样品选自血液、血液成分（例如，血清或血浆）或经处理的血液。
[0018] 附图的简要说明
[0019] 图1显示了本发明所述的多重HBV试验的实施方式。
[0020] 发明详述
[0021] A.引言
[0022] 本文提供了同时检测微生物感染和/或针对相同感染的免疫接种的应答的试剂 盒、组合物和方法。该方法包括检测针对人乙肝表面抗原（抗-HBsAg抗体）的免疫球蛋白 G(IgG)抗体和针对人乙肝核心抗原的总免疫球蛋白（总HBc抗体）和免疫球蛋白Μ(抗-HBc IgM抗体）。在珠存在下，在相同单一容器（管、孔、样品池等）中测量各抗体的存在和量。 各珠携带特异性可检测物理参数（例如，染料特征）和⑴抗-IgM、（2)HBcAg、或（3)HBsAg。 因此，在单一容器中包含三种类型的可明确检测的珠以进行试验，如图1所示。图1显示了 用HbsAg的2种优势亚型，Ad和Ay包被的HBsAg珠。存在其它亚型，例如，Aw和Ar(参见， 例如，Valet等.（1975)CMA J. 112 :1179)。本领域技术人员会理解在本文所述的试验中可 以任意组合使用任意1种、2种、3种、4种等的HBsAg亚型。
[0023] 本文所述的试验提供了至少2个维度的检测，例如，固定珠的特性（例如，HBsAg、 HBcAg或抗-IgM)，和结合的抗体的存在和量（抗-HBs或抗-HBc)。多维度方面允许多重模 式，使得能够在单一测试中检测超过一种分析物。此外，如下文所述，发明人已经显示本文 所述的多重试验成功地与已知患者样品的感染状态相关联。
[0024] 发明人已经设计了用于检测患者样品中多重抗体的单一试验，本文简单描述了这 些试验，这些抗体指示患者中是否存在HBV感染、HBV感染状态和HBV疫苗接种状态。在第 一步骤中，患者样品，一般是血液或血液组分，与三种类型的固体支持物接触：
[0025] ssl)，其与可检测标记物（例如，荧光团）1和抗-IgM偶联；
[0026] ss2)，其与可检测标记物2和HBcAg偶联；和
[0027] ss3)，其与可检测标记物3和HBsAg偶联。
[0028] ssl将结合患者样品中的所有IgM抗体，无关特异性。ss2将结合患者样品中对 HBcAg有特异性的抗体，包括IgM和IgG。ss3将结合患者样品中对HBsAg有特异性的抗体， 王要是IgG。
[0029] 在去除未结合的材料之后，加入标记的HBcAg和HBsAg。在图1所示的实施例中， 标记物是生物素，但是本领域技术人员会理解可在HBcAg和HBsAg上使用直接可检测的标 记物以产生阳性或阴性信号。
[0030] 在本发明的实施例中，在去除未结合的材料之后，加入可检测标记的链霉亲和素， 与生物素化的HBcAg和HBsAg结合并导致阳性或阴性，以及可定量的信号。通过流式细胞 术检测固体支持物1、2和3 (与可检测标记物1、2和3相关联）、以及各固体支持物上的信 号的存在、缺失和定量水平。下表显示可如何使用结果来诊断患者的HBV状态。
[0032] B.定义
[0033] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常 所理解的同样含义。参见例如Lackie，DICTIONARY OF CELLAND MOLECULAR BIOLOGY(《细胞 分子生物学词典》），埃尔斯威尔出版社（Elsevier)(第4版2007) ;Sambrook等，MOLECULAR CL0NING，A LABORATORY MANUAL(《分子克隆，实验室手册》），冷泉港实验室出版社（冷泉港， 纽约1989)。本发明按照数字或字母指代物项，如标记物、固体支持物、珠、分析物等（例如， 可检测标记物1，珠（ii)等）。这些数字和字母旨在区分该物项与相同类型的其它项（例 如，珠（i)与珠（ii))，并不旨在将特定性质与数字或字母关联。本发明的实践中可以使用 与本文所述类似或等价的任何方法、装置和材料。本文提供的定义是用来帮助理解本文经 常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。
[0034] 多重试验是在单个样品中同时检测超过一种分析物的分析方法。多重试验方法和 试剂描述于，例如美国专利号6, 773, 578和W02008148883。
[0035] 本文所用术语"固体支持物"指固体惰性表面或物体，其上可固定试剂，如抗体或 抗原。本文所用术语"固定"指分子基础的偶联，其在本文所述试验的任意步骤期间所施加 的条件下都不会明显去偶联。这类固定可通过共价键、离子键、亲和型键或任意其他化学键 实现。
[0036] 本文所用术语"颗粒"指任何形状或表面结构的固体或半固体主体，通常线性尺寸 为微米级（即小于1〇〇微米）。除非另有说明，该术语与"微粒"可互换使用，其是指微米级 颗粒，并且与"珠"可互换使用，其是指形状是球形或近似球形的颗粒，通常在组成上是聚合 的。
[0037] 术语"容器"、"器皿"、"管"、"孔"等是指可容纳试剂或任何试验的容器。如果容器 在试剂盒中并容纳试剂，其一般可以是封闭或密封的。如果容器正用于试验，其在试验步骤 期间一般会是打开或可及的。
[0038] 术语"生物样品"包括从生物体中得到的多种样品类型。该术语包括体液，如血 液、血液组分、唾液、血清、血浆、尿液和其它生物来源的液体样品、固体组织活检、组织培养 物或取自培养的患者细胞的上清。在本发明的内容中，生物样品一般是含可检测量抗体的 体液，例如，血液或血液组分。可在试验之前对生物样品进行加工以例如去除细胞或细胞碎 片。该术语包含获得后经处理的样品，如试剂处理、溶解、沉降或对某些组分的富集。
[0039] 本文所用术语"抗体"指由一个或多个免疫球蛋白基因编码的多肽，或其特异性结 合并识别分析物（抗原）的片段。识别的免疫球蛋白轻链被归类为κ或λ。免疫球蛋白重 链分为γ、μ、α、δ或ε，它们进而分别定义免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
[0040] 免疫球蛋白G(IgG抗体）的结构单元的一个示例是四聚体。各这类四聚体由相同 的两对多肽链组成，每对包含一条"轻"链（约25kD)和一条"重"链（约50_70kD)。每条 链的N末端确定约100至110个或更多个氨基酸构成的可变区，所述可变区主要负责抗原 识别。术语"轻链可变区"（VL)和"重链可变区"（VH)分别指这些轻链和重链。
[0041] 例如，抗体作为完整免疫球蛋白或由不同肽酶消化完整免疫球蛋白所产生的成 熟表征的片段而存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中的二硫键连接附近消化抗体，产 生F(ab' )2，Fab的二聚体，其本身是由二硫键连接于VH-CH1的轻链。可在温和条件下 还原F(ab' )2二聚体以打断铰链区中的二硫连接，从而将F(ab' )2二聚体转化为两 个Fat/单体。Fat/单体实质上是具有部分铰链区的Fab(参见Paul编，Fundamental Immunology (《基础免疫学》），第三版，雷文出版社（Raven Press)，纽约，1993)。虽然根据 对完整抗体的消化定义了多种抗体片段，但是本领域技术人员应理解，这类片段也可用化 学方法或重组DNA方法从头合成。因此，本文中所用术语"抗体"也包括通过全抗体修饰或 用重组DNA方法从头合成所产生的抗体片段，如单链Fv。
[0042] 抗体通常按照其靶标来表示。虽然命名有变化，但本领域技术人员会熟悉并理解 可对相同抗体应用数个名称。例如，对IgM有特异性的抗体可被称为"抗-IgM"、" IgM抗体"、 "抗-IgM抗体"等。
[0043] 本文所用术语"抗原"、"免疫原"、"抗体靶标"、"靶标分析物"和类似术语是指由抗 体识别，即可被抗体特异性结合的分子、化合物或复合物。该术语可以指可被抗体特异性识 别的任意分子，例如，多肽、多核苷酸、糖、脂