诊断结核病的方法

诊断结核病的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种诊断结核病的方法。具体地，本发明涉及活动性结核病（active tuberculosis(TB))的血清学诊断方法，该血清学诊断方法基于检测哺乳动物受试者中针 对源于结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis)的脂质抗原的抗体。
【背景技术】
[0002] 对于诸如TB的疾病，尽管已有报道在针对患有TB的患者血清中结核分枝杆菌的 各种抗原的抗体的研究上取得了极大的进展，但迄今一直没有能足够有效地保证TB诊断 结果的商业化血清学TB诊断测试（Weyer等人，2011年）。
[0003] 本发明提供一种通过检测含有免疫球蛋白的体液样品中的替代标记物抗体诊断 结核病的方法。替代标记物是疾病的指标，由宿主对感染的响应产生，而不是由感染因子自 身产生。
[0004] 所述替代标记物抗体是特异性地识别源自结核分枝杆菌的分枝菌酸抗原的抗体 (Verschoor等人，1998年，US7, 122, 577)，且本申请人认识到，这样的抗体的流行率不会 因HIV协同感染而受影响，HIV是引起AIDS的病毒（Schleicher等人，2002年）。本申请 人还认识到，可通过竞争性结合抑制免疫测定的手段检测抗体，以便将该抗体与普遍存在 的交叉反应抗胆固醇抗体区别（Verschoor等人，2005年，Thanyani等人，2008年，Benadie 等人，2008年）。本申请人进一步认识到，可使用稀释的样品利用生物传感技术实时检测抗 体与固定在传感器表面上的含分枝菌酸抗原的脂质体的结合，以提高检测的灵敏度和特异 性相比于标准免疫测试如ELISA(Verschoor等人，2005,Thanyani等人，2008年，Lemmer等 人，2009年）。本申请人进一步认识到，使用电化学阻抗谱（EIS)技术，可以在具有嵌入分枝 菌酸抗原的自组装脂质单层上对替代标记物抗体进行终点检测（Mathebula等人，2009年， Ozoemena等人，2010 年）〇
[0005] 在所引用的现有技术中，已经给予适用于结核病的诊断的技术缩写"MARTI"，即分 枝菌酸抗体实时抑制测试（Lemmer等人，2009年）。然而，由于所述MARTI-测试需要昂贵且 费力的生物传感器技术，如表面等离子体共振（surfaceplasmonresonance)、伴随低样品 通量以及高维护要求，其应用是具有挑战性的。Mathebula等人（2009年）和Ozoemena等 人（2010年）的电阻抗谱技术试图找到一种所述替代标记物抗体的生物传感器检测方法， 以更适合于实际诊断应用。尽管技术上成功，但其偏离了将MARTI作为终点抗体结合检测 测试予以实施的原理，当使用较多的血清样品组进行验证时，会预期到不足的灵敏度。
[0006] 本发明通过以新颖的方式配置电阻抗的测定，将电阻抗生物传感器途径应用于 MARTI-测试的原理，对现有技术提供了改进。这需要排除抗体-抗原在电极传感器表面暴 露后的洗涤步骤，并包含与含抗体的样品结合的氧化还原探针或类似的导电物质。这种设 置通过防止低亲和力的生物标志物抗体连同未结合的血清成分的洗除提高了测试的灵敏 度。本发明利用价格低廉、耐化学溶剂、丝网印刷型、一次性的电极使MARTI-测试的原理适 用于高样品通量。另外，本发明为抑制的样品和非抑制的样品提供了连续注射，即将所述抑 制的样品和非抑制的样品依次暴露于相同的传感器表面，这使得每个样品仅需要一个一次 性的电极即可进行全面分析。
[0007] 以前已经探索了用于TB的检测的各种方法。基于压电的生物传感器（He等人， 2002年，Ren等人，2008年）、基于DNA结合的生物传感器（Das等人，2010年）、基于磁弹性 的生物传感器（Pang等人，2008年），基于声波的生物传感器（He等人，2003年），以及基于 SPR的DNA传感器（Duman和Erhan，2010)。然而，这些创新旨在直接的杆菌检测，并未涉及 低亲和力的抗体的洗除。Pang等人（2008年）的方法中使用痰样品，并已知为适合HIV协 同感染的患者。用于TB检测的生物传感器具有巨大的科学和商业利益，但对肺外、儿科和 HIV协同感染的群体中还没有提供解决方案。
[0008]Mathebula等人（2009年）为可使用电化学阻抗谱（EIS)检测结核抗分枝菌酸抗 体的生物标志物提供了原理的证明。EIS本质上是一种检测具有电流的电极表面上的变化 的分析技术。这篇文献建议使用共价连接的自组装单层，以形成包含分枝菌酸的电容层。然 而，在其目前的配置中，所述方法由于费力的电极抛光和化学方法，不能用于高样品通量。 本申请人现已发现丝网印刷电极（SPEs)与电化学阻抗谱结合可以用于检测抗分枝菌酸的 抗体。
[0009] 丝网印刷技术或丝网印刷已知多年，并已成功地用于生产丝网印刷电极。在本发 明的方法中，金"墨水"用于图1中所示的陶瓷氧化铝载体上，以产生三个电极的系统。可 通过如图2和图3中所示的高温固化或低温固化将所述金电极固化。这避免了费力的抛光 的要求（Garcia-Gonzdilez等人，2008年）。在电极系统中，控制参数如表面粗糙度和自组 装单层（SAM)的重现性是重要的。高通量抗体检测要求用于控制所述表面粗糙度的方法应 被优化，以在获得重现性结果中提供置信度。
[0010] 丝网印刷使高品质的一次性的电极重复生产价格低廉。由于用于诊断目的的表面 再生是不切实际的，一次性是很重要的。当使用替代技术（例如，BiacoreSPR生物传感器） 时，必须在每次分析前，对石英杯（cuvette)的金表面进行化学再生。这可能导致当使用自 组装单层膜（SAMs)时，引起该表面的蚀刻。此外，促溶剂（chaotropicagents)如尿素可 能存在于血清中；这些试剂对电极具有破坏影响（Dijksma，2003年）。这可以通过不定误 差（indeterminateerror)破坏重现性和精确度。由于这些因素，表征多次再生之间的表 面变化是极其困难、昂贵且不切实际的。一次性的SPEs为重现性和成本提供了解决方案。
[0011] 电化学阻抗谱是由OliverHeaviside(Barsoukov和MacDonald，2〇〇5 年）于 188〇 年首次提出的。大约125年后，电化学技术被证明适用于在自组装单层（SAMs)上监控结合 相互作用（Campuzano等人，2006年）。电荷转移经氧化还原探针发生在溶液中的工作电极、 参考电极和对电极上。简单地说，在该池的E1/2处的恒定电压保持在基于所定义的扫描参 数的一组不同频率上。交流电流具有幅度和相位角。该相位角由于系统中的变化而发生改 变，包括由于增加的电容的离子扩散。频率响应分析（FRA)在本测定中测定。EIS用于研究 两组参数：影响材料的例如导电性，介电常数，电荷迀移率，带电荷种类的平衡浓度，主体反 应速率的那些参数，以及属于电极材料界面，包括吸附反应速率常数，界面区域上的电容和 电极自身中的中性物质的扩散系数的那些参数（Barsoukov和MacDonald，2005年）。SAMs 形成制约了电荷转移的绝缘层，从而产生电容（Gebbert等人，1992年）。由于通过物理吸 附的抗体结合，在电解质-SAM-工作电极界面产生电荷转移电阻（RJ(Tudorache和Bala， 2007年）。可以使用EIS技术量化Ret，并在本文使用用作分析的基础。
[0012] 在电位脉冲（脉冲电流检测）的期间，可以通过阻抗测量实现抗体-抗原响应的 直接、不含标记的检测。通过结合蛋白质在SAM上形成一个附加层，使得能够检测所引入的 电极的电容的改变和/或电荷转移电阻的改变（Berggren和Johansson，1997年）。
[0013] 使用循环伏安法（cyclicvolta_etry)校准系统是需要的，以确定该系统的平衡 电位（E1/2)(见图4)。该值用于EIS以测量在工作电极（WE)和对电极（counterelectrode) (CE)之间的电流扰动。当使用金作为该工作电极时，用于测量之前报道的SAMs的对电极 的例子为氯化银，且氧化还原探针是铁氰化物或[Fe(CN)6]4/[Fe(CN)6]3 (Mathebula等人， 2009 年）。
[0014] 工作电极作为在界面区域交换的电子的来源，必须是生物惰性的（换句话说，它 们将不会产生响应所施加的电势的电流）。金由于其惰性和导电性能，以前已经用作工作电 极。它很容易与乙酰半胱氨酸或任何硫醇缀合，在硫和金表面之间形成高度稳定的配位共 价键。如果所述硫是长链烷烃或类似分子的一部分，则会形成绝缘层。如果所述电极是会 被重新使用的，则必需去除形成的绝缘层。这要求所述电极在每次使用之间必需被清洁或 被抛光。这是不切实际的，且具有引入可测误差（determinateerror)的可能性。
[0015] 使用一次性电极防止表面吸附效果和由于过度清洁造成的损伤，因此极大程度地 提高重现性。所述电极可在装置外制备，且被设置应用于电极抛光和电极涂覆是不切实际 的护理点（pointofcare) (P0C)中。
[0016] 在水溶液中，电极-电解质界面可以使用由附着到所述电极表面的疏水性化合物 /分子/纳米颗粒组成的SAMs进行改性。N-(2-巯基乙基）十八烷酰胺（ME0DA)之前已经 被Ozoemena等人（2010年）和Mathebula等人（2009年）使用，以及11-硫醇癸酸（MEA) 已被Zhang等人（2009年）使用。Ozoemena等人（2010年）使用的Au-MEODA-MA原理包 括将半胱胺附着到金，随后共价连接硬脂酸，并最终通过疏水相互作用结合分枝菌酸。被认 为，这定向了该分枝菌酸垂直于朝下的疏水部分，并且所述分枝菌酸的基序和其他亲水基 团朝向SAM的外表面。这允许与抗分枝菌酸抗体结合，提供了可以使用EIS进行TB诊断所 需的证据。
[0017] 以前的工作已经表明，自组装单层膜（SAMs)阻碍电流的流动。由于金表面覆盖有 长链烷基硫醇，几乎所有的电流被所报道的用丁硫醇情况下的69 Ωcm2的动态电阻阻断，相 比之下硫辛酸在40 Ωcm2具有较低电阻40 Ωcm2,其