Gi蛋白磷酸化作为脊柱侧凸和脊柱侧凸进展的标记物，增加脊柱侧凸受试者中的GiPCR信 ...的制作方法
【专利说明】Gi蛋白磷酸化作为脊柱侧凸和脊柱侧凸进展的标记物，增 加脊柱侧凸受试者中的GiPCR信号传导的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请是2014年6月16日提交并且根据PCT条约第21条⑵款以英文公布的 PCT申请序列号PCT/CA2014/*，本申请要求2013年6月17日提交的美国临时申请序列号 61/835,839的权益。以上所有文件以引用的方式整体并入本文。 发明领域
[0003] 本发明涉及脊柱侧凸和脊柱侧凸进展的标记物。更具体地说，本发明涉及Gi蛋白 磷酸化作为脊柱侧凸和脊柱侧凸进展的标记物、增加脊柱侧凸受试者中的GiPCR信号传导 的方法以及其用于分层脊柱侧凸患者和预测发展脊柱侧凸的风险的用途以及增加脊柱侧 凸受试者中的GiPCR信号传导的方法。
[0004] 对序列表的引用
[0005]根据 37C.F.R. 1. 821 (c)，序列表特此作为命名为 14033_122_ST25.txt的ASCII兼 容文本文件提交，它是在2014年6月16日创建并且具有57千字节的大小。上述文件的内 容特此以引用的方式整体并入。
[0006] 发明背景
[0007] 特发性脊柱侧凸是不明原因的脊柱畸形，其通常被定义为伴有脊椎旋转的大于10 度的侧弯^青少年特发性脊柱侧凸（AIS)是全世界最频繁的幼年期畸形之一，其特征在于 不明原因的3D脊柱畸形，并且既代表直接的医学挑战，又代表终生影响个体的慢性病状。 它是青少年中最常见的需要外科手术的矫形病状，并且影响4%的此群体。所述病状最常见 地在9至13岁的年龄之间被诊断 2'3'4。所述诊断主要是排除并且仅在排除脊柱畸形如椎骨 畸形、神经肌肉病症或综合征病症的其他原因之后进行。传统地，躯干不对称在身体检查期 间通过亚当斯前屈测试揭示并且用脊柱侧凸测量计测量 5。然后可以使用科布方法通过弯 曲的影像学观察和角度测量来确认所述诊断6。
[0008] -旦诊断，医师在管理脊柱侧凸儿童方面的主要关注是弯曲是否将进展。确实，弯 曲进展经常是不可预测的并且在女孩之中比在男孩中更频繁地观察到 7。如果未经治疗，弯 曲可能急剧进展，从而产生显著身体畸形且甚至心肺问题。当弯曲超过70度时，这些表现 形式变得威胁生命 8'9。用于预防或终止弯曲进展的当前治疗选择包括装矫正架和外科手 术。一般来说，对于在25与40度之间的弯曲推荐装矫正架，而对大于45度的弯曲或对装矫 正架无反应的弯曲保留外科手术。当前在美国，大约一百万的10与16岁之间的儿童具有 某种程度的IS。大约10%的被诊断具有特发性脊柱侧凸的儿童具有需要矫形外科手术的 弯曲进展 ' 每年在北美进行约29, 000例脊柱侧凸外科手术，从而导致显著的心理和生理 发病率。（GoldbergMS,MayoNE，PoitrasB等TheSte-JustineAdolescentIdiopathic ScoliosisCohortStudy.PartI:Descriptionofthestudy.Spine1994 ； 19:1551-61 ； PoitrasB,MayoNE,GoldbergMS等TheSte-JustineAdolescentIdiopathicScoliosis CohortStudy.PartIV:Surgicalcorrectionandbackpain.Spinel994 ; 19:1582-8)〇
[0009] 当前，没有可靠的方法或测试可供用于鉴定处于发展IS的风险的受试者以预测 哪些受影响的个体需要治疗来预防或终止所述疾病的进展，以使得可以尽早提供适当治疗 并且预防外科手术并发症以及心脏和/或呼吸问题。（WeinsteinSL，DolanLA,ChengJC 等Adolescentidiopathicscoliosis.Lancet2008;371:1527-37)。
[0010] 因此，当前治疗如装矫正架或外科手术矫正的应用被延迟直到检测到显著畸形或 直到清楚地展示显著进展，从而导致延迟的、不太理想的治疗并且通常导致严重的心理后 遗症（SocietySR.Morbidity&MortalityCommitteeannualReport1997) 〇
[0011] 当前，为了检测畸形，使诊断的儿童在几年内经受多次射线照相，通常直到他们达 到骨骼成熟。据估计，患有脊柱侧凸的典型患者将在3年时期内具有大约22次放射学检查 n。多次射线照相检查存在潜在风险。也是由于这一原因，能够允许进行特发性脊柱侧凸的 预后的替代方法是强烈合乎需要的。
[0012] 在开发能够有助于患者的治疗选择的诊断测试方面的主要限制是AIS的异质性 质。在临床水平，AIS的异质性通过弯曲形态的变化性、定位和弯曲幅度、甚至在具有多个 受影响的成员的家庭清楚地显示。
[0013] 在不存在可靠的AIS表型的情况下，需要更好地了解与疾病发作和脊柱畸形进展 相关的分子变化。疾病的分子定义正在迅速替代传统的基于病理学的疾病描述，这是部分 由于其在鉴定针对患者的最佳治疗方案中的效用。
[0014] 为此目的，在AIS患者之中报道了差别褪黑激素信号传导功能障碍的存在，从而 导致他们分层为三种功能组或生物内在表型（Moreau等，2004) ;(Azeddine等，2007); (Letellier等，2008)以及Moreau的W02003/073102。更具体地说，AIS患者被分层为代 表不同生物内在表型的三个功能组（FG1、FG2和FG3)。使用这种方法，当与健康对照受试 者相比时，脊柱侧凸患者和处于更高发展脊柱侧凸风险的儿童对Gi蛋白刺激的反应较小， 并且所述分类是基于相对于对照组的减少程度的百分比。分类范围对于FG3被固定在10% 与40%之间，对于FG2被固定在40%与60%之间且对于FG1被固定在60%与90%之间。
[0015] 最近，使用细胞介电谱（CDS)技术（其是用于G蛋白以及偶联至所述蛋白的内源 性受体的功能评价的无标记方法（Verdonk等，2006))，据发现，在通过褪黑激素刺激退黑 激素受体之后的细胞反应在正常成骨细胞中主要是Gi依赖性的并且在来源于AIS患者的 成骨细胞中减少至不同程度（Akoume等，2010)。大约33%的被诊断具有缺陷型Gi蛋白功 能的无症状儿童已在许多年之后发展脊柱侧凸（Akoume等，2010)。
[0016] 脊柱侧凸的早期检测/预后不仅是对于成功的和侵入性更小的临床结果来说关 键的，而且扩大临床医师的治疗选择范围。确实，改进患者分层和疾病分期代表在患者的脊 柱畸形太晚期之前选择用于微创外科手术的AIS患者的关键步骤。
[0017] 本说明书参考多个文献，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文。
[0018] 发明概述
[0019] 本发明提供以下临床证据：Giα亚基的差别破坏出现在AIS中，并且证明这种受 损是由不同Gi同种型的丝氨酸磷酸化引起的，从而导致将AIS患者分类成表示可遗传性状 的三种生物内在表型。在检测受脊柱侧凸影响的所有家族成员中的同一内在表型的情况下 清楚地证明遗传性。根据AIS患者的生物内在表型评价AIS患者的临床结果揭示，在两个 不同组（加拿大人和意大利人）中分类在FG2内在表型中的AIS患者更易于发展严重脊柱 侧凸，而分类在FG1内在表型中的AIS患者呈现低得多的疾病进展风险。
[0020] 在机制体外研究中，进一步观察到出现在AIS中的Gi蛋白的功能减退导致（a)差 异地扰乱不同细胞类型中的所有Gi偶联受体的系统性和广泛信号传导缺陷，（b)Gs偶联 受体信号传导的增强，而Gq偶联受体信号转导未受损，以及（c)选定激酶的药理学抑制拯 救或改进细胞水平下的Gi信号传导损伤并且这种反应在每种生物内在表型的功能方面变 化。所述信号传导缺陷是由于涉及不同激酶的各组中的Gia亚基同种型的选择性磷酸化 所致，即：FG3具有无磷酸化丝氨酸的Giα1和丝氨酸磷酸化的Giα2和Gia3 ;FG2具有无 磷酸化丝氨酸的Giα3和丝氨酸磷酸化的Giα1和Giα2 ;并且FG1具有丝氨酸磷酸化的 Gial、Giα2 和Giα3〇
[0021] 这些发现提供以下证据：Gi信号传导的差别破坏突出AIS发病机制，并且代表开 发创新型诊断工具和药理学疗法的理性基础。
[0022] 更具体地说，根据本发明，提供一种分层患有青少年特发性脊柱侧凸（AIS)的受 试者的方法，所述方法包括：（i)提供从所述受试者分离的细胞样品；和（ii) (a)测定所述 细胞样品中的Giα1的丝氨酸磷酸化；(b)测定所述细胞样品中的Giα3的丝氨酸磷酸化； (c)测定所述细胞样品中对Gia和Gsa蛋白刺激的反应之间的差异（Δ);或（d) (a)至 (c)的任何组合；由此检测步骤的结果使能够将患有AIS的受试者分层为属于AIS亚类。
[0023] 根据本发明的另一方面，提供一种预测受试者中发展严重脊柱侧凸的风险的方 法，所述方法包括：（i)提供从所述受试者分离的细胞样品；（ii) (a)测定所述细胞样品中 的Giα3蛋白的丝氨酸磷酸化；(b)测定所述细胞样品中对Giα和Gsα蛋白刺激的反应 之间的差异（Α);和/或（c)测定所述细胞样品中对激动剂的GiPCR反应，其中（a)Gia3 蛋白的丝氨酸磷酸化的不存在；(b)测定Gia/Gsα比率在约〇. 5与1. 5之间；和/或（c) 所述细胞样品中的GiPCR反应比对照样品中的GiPCR反应低约40%至60 %指示所述受试 者处于发展严重脊柱侧凸的风险。
[0024] 在一个具体实施方案中，所述受试者是被诊断患有脊柱侧凸的受试者。
[0025] 在一个具体实施方案中，所述受试者可能发展脊柱侧凸。在另一个具体实施方案 中，所述脊柱侧凸是青少年特发性脊柱侧凸。在另一个具体实施方案中，方法是在体外。 在另一个具体实施方案中，所述细胞样品包含成骨细胞、成肌细胞和/或外周血单核细胞 (PBMC)。在另一个具体实施方案中，所述细胞样品包含PBMC。在另一个具体实施方案中，所 述细胞包含淋巴细胞。
[0026] 根据本发明的另一方面，提供一种增加有需要的受试者（例如，被诊断患有脊柱 侧凸或可能发展脊柱侧凸）的细胞中的GiPCR信号传导的方法，所述方法包括向所述受试 者施用有效量的：（i)PKA的抑制剂；或（ii) (a)PKC的抑制剂；(b)CaMKl或4的抑制剂；（c) CK的抑制剂；或（d) (a)至（c)中的至少两者的任何组合，如果所述受试者的细胞具有丝氨 酸磷酸化的Gail、Gai2和Gai3蛋白；（iii)CaMK2的抑制剂，如果所述受试者的细胞不 存在Gai3上的丝氨酸磷酸化；或（iv)CK的抑制剂，如果所述受试者的细胞不存在Gail 上的丝氨酸磷酸化，由此所述GiPCR信号传导在所述受试者的细胞中增加。
[0027] 根据本发明的另一方面，提供以下各项的用途：（i)PKA的抑制剂；或（ii) (a)PKC 的抑制剂；(b)CaMKl或4的抑制剂；（c)CK的抑制剂；或（d) (a)至（c)中的至少两者的任 何组合；如果所述受试者的细胞具有丝氨酸磷酸化的Gail、Gai2和Gai3蛋白；（iii) CaMK2的抑制剂，如果所述受试者的细胞不存在Gai3上的丝氨酸磷酸化；或（iv)CK的抑 制剂，如果所述受试者的细胞不存在Gail上的丝氨酸磷酸化，其用于增加有需要的受试 者（例如，被诊断患有脊柱侧凸或可能发展脊柱侧凸）的细胞中的GiPCR信号传导或用于 制造用以增加有需要的受试者（例如，被诊断患有脊柱侧凸或可能发展脊柱侧凸）的细胞 中的GiPCR信号传导的药剂。
[0028] 根据本发明的另一方面，提供一种用于增加有需要的受试者（例如，被诊断患有 脊柱侧凸或可能发展脊柱侧凸）的细胞中的GiPCR信号传导的组合物，所述组合物包含： (i) PKA的抑制剂；或（ii) (a)PKC的抑制剂；(b)CaMKl或4的抑制剂；(c)CK的抑制剂； 或（d) (a)至（c)中的至少两者的任何组合；如果所述受试者的细胞具有丝氨酸磷酸化的 Gail、Gai2和Gai3蛋白；（iii)CaMK2的抑制剂，如果所述受试者的细胞不存在Gai3上 的丝氨酸磷酸化；或（iv)CK的抑制剂，如果所述受试者的细胞不存在GaΠ上的丝氨酸磷 酸化。
[0029] 根据本发明的另一方面，提供一种包含以下各项的组合物：（i)PKA的抑制剂；或 (ii) (a)PKC的抑制剂；(b)CaMKl或4的抑制剂；(c)CK的抑制剂；或（d) (a)至（c)中的至少 两者的任何组合；如果所述受试者的细胞具有丝氨酸磷酸化的Gail、Gai2和Gai3蛋白； (iii)CaMK2的抑制剂，如果所述受试者的细胞不存在Gai3上的丝氨酸磷酸化；或（iv)CK 的抑制剂，如果所述受试者的细胞不存在Gail上的丝氨酸磷酸化。在本发明的具体实施 方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
[0030] 根据本发明的另一方面，提供一种用于分层患有青少年特发性脊柱侧凸（AIS)的 受试者的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)用于检测所述细胞样品中Gia1上不存在丝氨酸磷 酸化的配体；(b)用于检测所述细胞样品中Gia3上不存在丝氨酸磷酸化的配体；（c)用于 检测Gia和Gsa的配体；或（d) (a)至（c)的任何组合。
[0031] 根据本发明的另一方面，提供一种用于预测受试者中发展严重脊柱侧凸的风险的 试剂盒，所述试剂盒包括：（a)用于检测Giα3上不存在丝氨酸磷酸化的配体；(b)用于检 测Giα和Gsα的配体；或（c) (a)与（b)的组合。
[0032] 根据本发明的另一方面，提供一种用于增加有需要的受试者的细胞中的GiPCR信 号传导的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)PKA的抑制剂；(b)PKC的抑制剂；（c)CaMKl或4的抑 制剂；（d)CK的抑制剂；（e)CaMK2的抑制剂；或（f) (a)和（e)中的至少两者的任何组合。
[0033] 在本发明的具体实施方案中，PKA的抑制剂是PKA-γ2的抑制剂。在另一个具体 实施方案中，ΡΚΑ的抑制剂是Η89。在另一个具体实施方案中，PKC的抑制剂是PKC-n或 PKC-ε的抑制剂。在一个具体实施方案中，PKC的抑制剂是G06983。在一个具体实施方 案中，CaMKl的抑制剂是CaMklδ。在一个具体实施方案中，CaMKl或CaMK4的抑制剂是 ST0609。在一个具体实施方案中，CK的抑制剂是CK2的抑制剂。在一个具体实施方案中， CK的抑制剂是D4476。在一个具体实施方案中，CaMK2的抑制剂是ST0609或KN93。在一个 具体实施方案中，有需要的受试者是被诊断患有脊柱侧凸的受试者。在一个具体实施方案 中，有需要的受试者可能发展脊柱侧凸。在一个具体实施方案中，所述脊柱侧凸是青少年特 发性脊柱侧凸。在一个具体实施方案中，所述方法是在体外。
[0034] 根据本发明的另一方面，提供一种选择作为减轻或预防脊柱侧凸的潜在候选物的 药剂的方法，所述方法包括使候选药剂与表达（a)PKA、（b)PKC、（c)CaMKl、（d)CaMK4、（e)CK、 (f)CaMK2的细胞相接触，其中当（a)至（f)中的任一者的表达或活性降低时，选择所述候选 药剂。
[0035] 在本发明的具体实施方案中，PKA是ΡΚΑ-γ2。在本发明的其他具体实施方案中， PKC是PKC-η或PKC-ε。在本发明的其他具体实施方案中，CaMKl是CaMKlδ。在本发明 的其他具体实施方案中，CK是CK2。
[0036] 在一些方面，本发明涉及一种分层患有青少年特发性脊柱侧凸（AIS)或处于发展 青少年特发性脊柱侧凸的风险的受试者的方法，所述方法包括：（i)提供从所述受试者分 离的细胞样品；（ii)从所述细胞样品检测或测定所述受试者的Gia蛋白丝氨酸磷酸化概 况和/或对Gia和Gsa蛋白刺激的反应的不均衡程度；以及（iii)基于所述受试者的 Gia蛋白丝氨酸磷酸化概况和/或对Gia和Gsa蛋白刺激的反应的不均衡程度将所述受 试者分层为临床上有用的AIS亚类。
[0037] 在一些实施方案中，以上提及的方法包括：（a)检测或测定所述细胞样品中的 Giα1的丝氨酸磷酸化；(b)检测或测定所述细胞样品中的Giα3的丝氨酸磷酸化；（c)检 测或测定所述细胞样品中对Gia蛋白刺激的反应与对Gsa蛋白刺激的反应之间的比率 (Gia/Gsa反应比率）或差异（Δ);或（d) (a)至（c)的任何组合。
[0038] 在一些实施方案中，以上提及的方法还包括：将所述受试者分层为属于：（1)第一 AIS亚类，其特征在于：(a)丝氨酸磷酸化的Giα1和Giα3蛋白的水平相较于对应于对照 的丝氨酸磷酸化的Giα1和Giα3蛋白的水平升高；和/或（b)在约0. 5以下的Gia/Gsα 反应比率；（2)第二AIS亚类，其特征在于：(a)丝氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平相较于 对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平升高，而丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水 平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平未升高；和/或（b)介于约0. 5 与1. 5之间的Gia/Gsα反应比率；或⑶第三AIS亚类，其特征在于：（a)丝氨酸磷酸化 的Giα3蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平升高，而丝氨 酸磷酸化的Giα1蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平未升 高；和/或（b)在约1. 5以上的Gia/Gsα反应比率。
[0039] 在一些实施方案中，以上提及的方法还包括检测或测定所述细胞样品中的Giα2 蛋白的丝氨酸磷酸化，其中相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Giα2蛋白的水平，检测 到丝氨酸磷酸化的Giα2蛋白的水平升高。
[0040] 在以上提及的方法的一些实施方案中，（1)属于第一AIS亚类的受试者具有低的 严重AIS进展风险；（2)属于第二AIS亚类的受试者具有高的严重AIS进展风险；并且（3) 属于第三AIS亚类的受试者具有中等严重AIS进展风险。
[0041] 在一些方面，本发明涉及一种预测患有脊柱侧凸或处于发展脊柱侧凸的风险的受 试者中发展严重脊柱侧凸的风险的方法，所述方法包括：（i)提供从所述受试者分离的细 胞样品；（ii)检测或测定：(a)所述细胞样品中Giα3蛋白的丝氨酸磷酸化；(b)所述细胞 样品中对Giα和Gsα蛋白刺激的反应；和/或（c)所述细胞样品中对激动剂的GiPCR反 应；（iii)当：(a)所述细胞样品中的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白未被检测到或相较于对应 于对照的丝氨酸磷酸化的Giα3蛋白的水平未升高；(b)所述细胞样品中对Giα蛋白刺激 的反应与对Gsα蛋白刺激的反应的比率（Gia/Gsα反应比率）介于约〇. 5与1. 5之间； 和/或（c)检测到所述细胞样品中的GiPCR反应比对照样品中的GiPCR反应低约40 %至 60 %时，确定所述受试者处于发展严重脊柱侧凸的风险。
[0042] 在以上提及的方法的一些实施方案中，步骤（ii)还包括检测或测定所述细胞样 品中的Gia1和/或Gia2蛋白的丝氨酸磷酸化，其中当所述受试者的丝氨酸磷酸化的Gia1或Gia2蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化的Gia1或Gia2蛋白的水 平升高时，所述受试者处于发展严重脊柱侧凸的风险。
[0043] 在一些方面，本发明涉及一种预测患有脊柱侧凸的受试者对装矫正架治疗的反应 性的方法，所述方法包括：α)提供从所述受试者分离的细胞样品；以及αυ检测或测定： (a)所述细胞样品中的Gia1的丝氨酸磷酸化；(b)所述细胞样品中的Gia3的丝氨酸磷 酸化；（c)所述细胞样品中对Gia和Gsa蛋白刺激的反应；或（d) (a)至（c)的任何组合； (iii)当：(a)检测到丝氨酸磷酸化的Gia3蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨酸磷酸化 的Giα3蛋白的水平升高，而丝氨酸磷酸化的Giα1蛋白的水平相较于对应于对照的丝氨 酸磷酸化的Giα1蛋白的水平未升高；和/或（b)所述细胞样品中对Giα蛋白刺激的反应 与对Gsα蛋白刺激的反应的比率（Gia/Gsα反应比率）在约1. 5以上时，确定所述受试 者可能对装矫正架治疗有反应。
[0044] 在一些实施方案中，以上提及的受试者是被诊断患有脊柱侧凸的受试者。在一些 实施方案中，所述脊柱侧凸是青少年特发性脊柱侧凸（AIS)。
[0045] 在一些实施方案中，以上提及的方法是在体外。
[0046] 在一些实施方案中，以上提及的细胞样品包含成骨细胞、成肌细胞和/或外周血 单核细胞（PBMC)。在一些实施方案中，以上提及的细胞样品包含PBMC。在一些实施方案中， 以上提及的PBMC包含淋巴细胞。
[0047] 在一些实施方案中，以上提及的检测或测定细胞样品中的Giα1和/或Giα3蛋 白的丝氨酸磷酸化包括从所述细胞样品分离Giα1和/或Giα3蛋白以及使所述分离的 Giα1和/或Giα3蛋白与抗磷酸丝氨酸抗体相接触。
[0048] 在一些方面，本发明涉及一种增加患有脊柱侧凸或处于发展脊柱侧凸的风险的受 试者的细胞中的GiPCR信号传导的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的：（i)PKA的抑制剂；（ii) (a)PKC的抑制剂；(b)CaMKl或4的抑制剂；（c)CK的抑制剂；或（d) (a) 至（c)中的至少两者的任何组合；如果所述受试者的