一种体外检测菊花胚胎败育过程中Caspase活性的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及菊花杂交育种与蛋白质组学领域，涉及菊花远缘杂交后胚胎在不同发育时期利用荧光分光光度法进行体外检测胚胎败育过程中五种Caspase酶活性的方法，具体地说涉及一种体外检测菊花胚胎败育过程中Caspase活性的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]菊花原产中国，是我国十大名花和世界四大切花之一，产量居首，在花卉生产中占有十分重要的地位。目前，国内菊花品种高达数千个，按栽培方式可以分为盆栽菊、地被菊、切花菊、造型菊四大类。地被菊多用于园林绿化，栽培管理较粗放，因此就需要有更高的适应性和抗性，但多数观赏性状优良的品种对栽培条件要求较高，生物和非生物抗性较差，严重限制了其应用的范围和美化的效果，因此对菊花品种的改良一直是育种工作者研究的重点。目前，运用种间，甚至属间杂交的办法，将菊属及其近缘种属中的优良性状导入栽培菊中是获得菊花新性状，提高菊花抗性的最有效途径之一。
[0003]然而，已有研究表明，菊花远缘杂交中经常遇到受精前和受精后障碍，导致菊花远缘杂交结实率低，其中受精后障碍更为普遍，即人工杂交后能够完成受精作用过程，但胚胎发育过程中遇到障碍，导致细胞降解、凋亡或死亡，胚胎发育停止，即胚胎败育，最终引起杂交失败。
[0004]目前对于菊花胚胎败育的研究主要集中在形态结构、组织化学等方面，如胚胎败育发生的时期和胚胎败育的组织结构特征等，很少从细胞衰亡的深层次原因方面开展研究。从形态结构和组织变化方面能明显观察到胚胎细胞从正常到败育是一个细胞凋亡的过程，在这个过程中，细胞器数量减少、结构异常并呈退化状态，细胞质逐渐收缩，细胞壁结构加厚等现象。对菊花的转录组学和蛋白质组学的研究也表明，在菊花败育胚胎中，参与细胞衰老、细胞程序性死亡的基因和蛋白都显著上调和增多，尽管有许多信号可以诱导细胞程序死亡，但它们也有共同的特征，其中凋亡时一系列细胞内蛋白水解酶——Caspase酶的活化就是之一。因此，通过检测菊花胚胎败育过程中Caspase酶的活性，不仅能增加对胚胎败育过程中导致细胞死亡的原因的认识，更利于从基因和蛋白水平挖掘出控制胚胎败育的关键基因和蛋白。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种体外检测菊花胚胎败育过程中Caspase活性的方法及其应用。探索菊花胚胎发育从正常到败育过程中不同Caspase酶活性的方法，为挖掘控制胚胎败育的关键基因和蛋白提供了基础。
[0006]本发明的目的通过以下技术方案实现的:
[0007]—种体外检测菊花胚胎败育过程中Caspase活性的方法，包括以下步骤:
[0008]I)菊花远缘杂交后不同发育时期胚珠的获得
[0009]选择在人工授粉后会出现胚胎败育现象的杂交组合进行远缘杂交，人工授粉后12天，取形态饱满、发育正常的正常胚珠;人工授粉后18天，部分胚胎开始败育，分别取形态饱满、发育正常的胚珠和不饱满、发育异常的胚珠;一般情况下，取样后立即在液氮中预处理l_2h，然后于_80°C贮存；
[0010]2)采用TCA/丙酮沉淀法分别提取步骤I)中所取得的3个胚珠样品的蛋白质，得到授粉后12天发育正常的胚珠蛋白质、授粉后18天发育正常和发育异常的胚珠蛋白质；提取的蛋白质于_80°C保存；
[0011]3)将步骤2)中的蛋白质预处理后分别用Bradford法进行蛋白质定量，并分别用Caspase缓冲液调整蛋白浓度至lyg/μ? ；
[0012]4)设空白对照和待测样品，向空白对照孔中加入荧光底物和Caspase缓冲液，向待测样品孔中荧光底物、Caspase缓冲液和蛋白质样品，加样后检测AMC释放量，分析荧光强度，确定蛋白质样品中Caspase的酶活性，采用五种荧光底物分别测定蛋白质样品中对应的五种Caspase的酶活性。使用多功能酶标仪检测AMC释放量。
[0013]步骤I)中所述的杂交组合中以栽培菊作为母本，野菊作为父本。所述的栽培菊花为‘雨花落英，，所述野菊为菊花脑，该杂交组合在人工授粉后会出现胚胎败育的现象。
[0014]步骤3)中蛋白质预处理的过程为:向每个蛋白质样品中加Caspase缓冲液并混合均匀，于冰上置放后离心取上清液;优选的，于冰上置放30分钟，离心的条件为:16000g，4°C离心20min。
[0015]所述的五种荧光底物分别为:Ac-YVAD-AMC、Ac-DEVD-AMC、Ac-LEVD-AMC、Ac-VEID-AMC和Ac-LEHD-AMC。
[0016]优选的，步骤4)中向空白对照孔加入195μ1Caspase缓冲液，5μ1荧光底物；向待测样品孔中加入175μ1 Caspase缓冲液，5μ1荧光底物，混匀后再加入20μ1步骤3)中所得的蛋白质样品。
[0017]上述的Caspase缓冲液的配方为:50mM醋酸钠，1mM L-半胱氨酸，10% (vol/vol)甘油，0.I % (wt/vol，g/ml，100ml Caspase缓冲液中含0.Ig CHAPS)CHAPS，以NaOH或HCl调pH值至6.0 ο配好后于4°C保存。
[0018]步骤4)中分析荧光强度时的激发光波长380nm，发射光波长为460nm，检测AMC释放量时的检测温度为27°C。
[0019]上述的方法在筛选菊花胚胎败育过程中控制胚胎败育的关键Caspase酶中的应用。
[0020]上述的应用，其在于分析正常胚珠和异常胚珠中各种Capsase酶的活化情况，筛选出活化程度异常的Capsase酶即为控制胚胎败育的关键Caspase酶。
[0021]步骤2)中用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质的过程为:取样品在液氮预冷的研钵中迅速研磨至粉末状，加入提取液制成混合液，将混合液装入离心管中，放在冰上并在摇床上振荡后，在15，000g，4°C下离心15min，取上清液，向上清液中加入洗涤液I，充分震荡混匀，-20°C静置0.5-1.5h;然后在15，000g，4°C下离心15min，弃上清，向沉淀中加洗涤液Π洗涤，-20°C静置30min以上，重复用洗涤液Π洗涤I _2次后冷冻干燥沉淀，于_80°C保存。
[0022]上述的提取液为:8M尿素、2%硫脲(g/ml，100ml提取液中含2g硫脲)、1%(ν/ν)Trit1n X_100、50mM NaCl、20mM Tris，pH = 8.0 ;所述的洗涤液I为:_20°C预冷丙酮加0.07%01'1'(8/1111，1001111洗涤液1中含0.078 DTT)和 10%TCA(g/ml，10ml洗涤液I 中含1gTCA);所述的洗涤液Π为:_20°C预冷丙酮加0.07%DTT(g/ml，10ml洗涤液Π中含0.07gDTT) ο
[0023]步骤3)中运用Bradford法进行蛋白质定量主要包括以下步骤:配制一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml ,0.02mg/ml，0mg/ml的牛血清蛋白(BSA)溶液，测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。
[0024]步骤4)中的五种不同荧光底物分别是:N-Acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp_AMC(Ac-YVAD-AMC),N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-AMC(Ac-DEVD-AMC),Ac-Leu-Glu-Val-Asp-AMC(Ac-LEVD-AMC)，Ac-Val-Glu-1le-Asp-AMC(Ac-VEID-AMC)，AC-LEU-GLU-HIS-ASP-AMC(Ac-LEHD-AMC) ο
[0025]本发明的有益效果:
[0026]本发明针对菊花远缘杂交后胚胎败育的细胞衰老和凋亡现象，提供了一种快速、准确鉴定菊花胚胎败育过程中诱导细胞死亡的关键Caspase酶，探索菊花胚胎发育从正常到败育过程中不同Caspase酶活性的方法，为研究菊花胚胎败育的分子机理，挖掘调控胚胎败育的关键基因和蛋白提供了研究基础。
【附图说明】
[0027]图1为正常和败育胚胎中Caspase-1 ike活性。
[0028]其中，NE12:12天正常胚胎;NE18:18天正常胚胎;AE18:18天败育胚胎。五种不同的荧光底物分别为:Ac-YVAD-AMC(YVADase) ,Ac-DEVD-AMC(DEVDase) ,Ac-LEVD-AMC(LEVDase) ,Ac-VEID-AMC(VEIDase) ,Ac-LEHD-AMC(LEHDase)。以LEHDase活性的百分比作为相对荧光单位进行计算。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0030]本发明所提供的利用酶标仪体外检测菊花胚胎败育过程中不同Caspase活性荧光的方法，其具体实施示例如下:
[0031]1.远缘杂交及取样
[0032]1.1远缘杂交
[0033]以栽培小菊‘雨花落英’(2n= 6x = 54)作母本，选取发育良好的花蕾，在舌状花刚露色时去雄，即把内轮两性管状小花全部去除，同时剪去舌状花花瓣直到可见柱头(不伤及柱头)，并严格进行套袋。待母本柱头伸出并开叉呈现锐角和分泌黏液时(去雄后3-5d)，于晴天10-15时收集已套袋的父本菊花脑(2n = 2x= 18)的新鲜花粉，用毛笔对母本进行授粉，授粉后立刻对母本雌蕊继续套袋隔离。
[0034]1.2胚胎取样
[0035]授粉后12d时，剪下一部分已授粉的花序，用尖头镊子取下每一朵小花，并取出每一朵小花的胚珠，并去除少部分发育不良的不饱满胚珠，最后将发育正常饱满的胚珠用锡箔纸包好立即在液氮中预处理l_2h，然后在_80°C条件下贮存。
[0036]授粉后18d时，剪下已授粉花序，取下每一朵小花，在体视显微镜下能观察到子房的饱满程度有差异，并将发育正常饱满的和发育异常不饱满的子房分开，取出胚珠，分别用锡箔纸包好立即在液氮中预处理l_2h，然后在-80°C条件下贮存。
[0037]2.蛋白质提取
[0038]用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质。具体步骤如下:
[0039]2.1溶液配制
[0040]本方法提蛋白所需的三种溶液分别为:
[0041](I)提取液:8M尿素、2%(g/ml)硫脲、l%(v/v)Trit1n X_100、50mM NaCl、20mMTris，pH=8.0 ；
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