光子重组的非线性超分辨显微方法及装置的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于共聚焦显微领域，特别涉及一种光子重组的非线性超分辨显微方法及 装置。
【背景技术】
[0002] -直以来，传统的远场焚光显微技术由于衍射极限的存在，因此在纳米技术、材 料、生物以及医学领域等的应用受到很大的限制。为了解决这一问题，自从上个世纪90年代 开始，人们提出了很多超分辨显微方法。在这些所提出的方法中，荧光差分显微技术(FED) 成为新近提出的方法中可以在不使用荧光标记的情况下分析生物样品。荧光差分显微术基 于的是共聚焦显微成像技术，它是利用两个通过特定激发的光斑扫描得到的两张图像之差 来获得分辨率的提高的。即待分析的样品是分别被一个实心光斑接着被一个空心光斑照 明，将两者以不同的比重进行相减运算即可重构出超分辨图像。实验结果显示，荧光差分显 微在远场可以获取小于四分之波长的分辨率并且具有较高的信噪比。
[0003] 然而，这种荧光差分显微术存在图像变形以及信息丢失的问题。在之前的系统中， 空心光斑是通过采用一个〇到2π的涡旋位相板调制一个与之同向的圆偏光实现的。由于空 心照明光斑的轮廓比实心光斑的要大得多，两者相减后将导致获得的有效点扩散函数出现 负值旁瓣，而某些正值的强度可以通过负值强度来补偿，因此在图像重构的过程中，去除的 负值强度将导致信息的丢失。这个问题的关键解决方法便是找到某种方法使产生的实心和 空心光斑具有大致相等的尺寸。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种光子重组的非线性超分辨显微方法和装置，相对于其他超分辨 成像显微镜，该装置是基于共聚焦显微镜，其结构简单，成像速度快，为生命科学和纳米技 术提供了良好的研究手段。
[0005] 本发明通过光子重组以消除图像变形而实现超分辨成像的方法，这种方法被称为 饱和光照明虚拟荧光差分超分辨显微术(svFED)。本显微术通过高功率激光照明以达到荧 光的非线性效应，采用针孔探测器阵列取代传统共焦显微成像中放置于像面上的单个针孔 探测器，利用光子重组技术，结合类似于荧光差分显微术(FED)的方法，仅仅扫描所获取的 空心光斑而无需获取实心光斑，从而大大简化了实验装置并进一步提高了成像速度；同时 由于不存在负值旁瓣，使系统消除了成像变形这一困扰。仿真结果显示光子重组的非线性 超分辨率显微术相对于传统共聚焦显微术可提高至少39%。
[0006] 本发明的具体技术方案如下：
[0007] 本发明提供了一种光子重组的非线性超分辨显微方法，针对荧光样品包括以下步 骤：
[0008] (1)激光器发出高功率照明光束，经第一透镜准直和扩束后得到准直扩束光束;所 述准直扩束后的照明光束经第一偏振片后，得到线偏振光；
[0009] (2)所述线偏振光经第一反射镜反射后进入0~231涡旋位相板调制入射光的相位； 所述被调制位相后的线偏光经第一四分之一波片后补偿了后面的二色镜和第二反射镜造 成的位相差，使其在经第二反射镜反射后的出射光为准确的线偏光;所述位相差得到补偿 的偏振光经半波片后得到改变了线偏振方向的出射光;所述出射光经二色镜反射后进入第 二反射镜;所述经第二反射镜反射的反射光再经过第二四分之一波片后变成位相受到调制 的圆偏振光;所述位相受到调制的圆偏光经过物镜后聚焦到位于所述物镜焦面处样品平面 上形成空心光斑照明荧光样品；
[0010] (3)所述荧光样品被高功率的空心光斑照明后，在非线性的作用下，产生饱和效 应，激发出饱和荧光;所述达到饱和效应的荧光被所述物镜收集，经所述第二四分之一波片 后由所述第二反射镜反射后进入所述二色镜;所述荧光经所述二色镜透射后进入滤光片滤 光后进入第二透镜;所述经滤光片滤光后的荧光由第二透镜会聚到由多个光电探测器组成 的探测器阵列上参与成像；
[0011] (4)所述探测器阵列将光信号转换为电信号并传送给计算机;所述计算机将每个 探测器探测到的空心光斑做相应的平移后叠加，得到实心光斑的图像，完成了对样品一个 点的信息读入和处理；
[0012] (5)所述荧光样品放置于纳米移动平台上;所述样品平台与所述计算机相连，通过 所述计算机的控制软件实现纳米移动平台的在二维平面的移动完成对所述荧光样品的二 维扫描。
[0013] 本发明还提供了一种光子重组的非线性超分辨显微装置，针对荧光样品包括：
[0014] (1)高功率激光器，用于发出短波长高功率激光，实现对荧光样品的照明，利用荧 光的非线性效应，以使其达到饱和从而激发饱和荧光；
[0015] (2)第一透镜，用于对激光器发出的激光进行准直和扩束；
[0016] (3)偏振片，用于使准直并扩束后的激光变成线偏振光；
[0017] (4)第一反射镜、第二反射镜，用于反射光路，使光路变得紧凑；
[0018] (5)0~2π涡旋位相板，用于调制入射光的相位，从而使所述激光在样品面聚焦时 形成空心光斑；
[0019] (6)第一四分之一波片，用于补偿入射光经后面的二色镜和第二反射镜后带来的 位相差，使其在经第二反射镜反射后为准确的线偏光；
[0020] (7)二分之一波片，用于调整入射光的线偏振方向；
[0021] (8)二色镜，用于使激光反射同时使被激发的荧光透射；
[0022] (9)第二四分之一波片，用于使相位受到调制的入射光变成圆偏振光；
[0023] (10)物镜，用于将相位受到0~2π调制的圆偏振光会聚到样品面上，收集荧光样品 被激发后所发出的荧光；
[0024] (11)滤光片，用于滤除经所述样品面反射回来的激光，而仅使荧光样品发出的荧 光通过参与成像；
[0025] (12)第二透镜，用于将所述荧光样品发出的荧光会聚到所述探测器阵列上；
[0026] (13)探测器阵列，由15x15个带有针孔的光电探测器所组成的阵列，如图3所示的 矩形阵列，用于将探测到的光信号转换为电信号并传送至计算机；
[0027] (14)纳米平移台，通过控制纳米位移平台完成对样品的二维平面扫描；
[0028] (15)计算机，用于处理探测器传送过来的信号，同时控制纳米移动平台的平动使 其完成对样品的二维平面扫描。
[0029] 本发明的原理如下：
[0030] 本发明在传统共聚焦显微镜装置(如图1所示）的基础上，首先经准直扩束后的高 功率激光光束入射到一偏振片后变成线偏光，线偏光再经过0~231涡旋位相板调制后经过 物镜前的四分之一波片后形成位相受到调制的圆偏振光，再由物镜聚焦到位于其焦面上的 样品平面后形成高强度空心光斑，激发光照明荧光样品后使其激发产生荧光。当激发光强 度较小时，所激发的荧光强度与激发光强成正比，当激发光强I超过某一临界值Is后，如果 持续增加光强，荧光将产生非线性效应，即荧光的发射强度将保持恒定，产生荧光饱和现 象。这是由于较强的激发光造成荧光分子的吸收截面减小，从而降低了分子实际捕获激发 光光子的能力，BP
[0031] 〇'cs = ocs(l+I/Is)
[0032]其中，〇'。3为荧光分子的实际吸收截面，ocs = 23t(A/2jt)2( yr/ Γ tC)t)为荧光分子的 吸收截面，Γ tclt，γ 4Ρλ分别为吸收总频率宽、自发辐射荧光率和激发光波长。此时的点扩 散函数将产生变形，其峰值将被削平，如图5所示。这种变形后的点扩散函数在空间频域内 包含更多的高频分量，从而可以探测物体更多的高频信息。物镜将收集到的饱和荧光经成 像光路后，最终成像在探测器阵列上，则探测器阵列上所记录的光强为：
[0033]
[0034] 其中，？代表样品上被扫描的位置矢量，？'代表物空间上的物的位置矢量，J代表 探测器所在的位置矢量，〇表示荧光样品发出的光强;有效点扩散函数为：
[0035]
[0036] 式中：ΜΚ?')代表激发点扩散函数，分')代表探测点扩散函数，共辄焦点处 的针孔探测器单元所对应的有效点扩散函数如图6所示。
[0037] 当探测器单元不是处在共辄焦点上时，该探测器单元所探测到的探测点扩散函数 将发生平移，从而使有效点扩散函数的峰值产生平移，如图7(a)中的点虚线和线虚线所示 分别表示距离共辄点探测器±〇.25λ处所对应的有效点扩散函数。故假如直接将每个探测 器单元所获得的有效点扩散函数加起来，则所获得的有效点扩散函数将产生较大的轮廓， 从而与未采用针孔探测器的共焦显微一样降低了分辨率。所以，在已知探测器阵列中每个 探测单元的实际位置时，将每个探测器单元所对应的有效点扩散函数作一定的平移，如图7 (b)点虚线和线虚线所示，然后再相加，这一过程被称为光子重组，用公式表示即：
[0038]
[0039] 其中q称为平移因子，采用卷积的形式写出该光强即为：
[0040]
[0041]
[0042]
[0043] 由于探测器阵列中的每个探测单元所获得的有效点扩散函数的空心暗斑位置都 与共辄焦点处探测器单元所得到的暗斑位置重合，当对探测器阵列中的每个探测单元所对 应的有效点扩散函数作光子重组后，中心暗斑位置处将被光子填充，从而使作光子重组后 的有效点扩散函数变成一个中心较周围强度稍低的实心光斑，其有效点扩散函数如图8所 不。
[0044]那么利用与荧光差分(FED)-样的原理，将光子重组所获得的实心光斑对应的有 效点扩散函数减去一定比例的处于荧光样品共辄点处探测单元所得到的空心光斑对应的 有效点扩散函数即可获得一个光斑更小的实心光斑，所对应的有效点扩散函数如图9所示。 对于处于共辄点的探测单元所得到空心光斑的光强分布为：
[0045]
[0046]
[0047]
[0048]则重构图像后的光强为：
[0049]
[0050] 其中，p为减数因子。采用卷积形式可以写成：
[0051]
[0052]
[0053]
[0054]适当选择平移因子q和减数因子p可以获得一个半高全宽很小的重构点扩散函数。 如此便完成了对单个物点的图像读入和处