一种利用细胞血素c自组装过氧化物酶测定表面活性剂临界胶束浓度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于表面活性剂临界胶束浓度测定技术领域，具体涉及一种利用细胞血素 C自组装过氧化物酶测定表面活性剂临界胶束浓度的方法。
【背景技术】
[0002] 表面活性剂是由极性头部和非极性尾部组成的双亲极性分子，它既可以与极性官 能团，又可以与非极性官能团相互作用。在极性溶剂中，当表面活性剂浓度逐渐增大到一定 浓度时，许多表面活性剂分子会自发聚焦成胶束，通常将表面活性剂形成胶束所需的最低 浓度定义为该表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)。
[0003] 临界胶束浓度CMC可以表征表面活性剂的表面活性，也是溶液性质发生变化的临 界点，其理化性质在形成胶束前后发生显著变化。因此CMC值对表面活性剂的研究极其重 要，是其具有重要参考价值的数据。
[0004] 现有的研究报道中大多是借助理化性质的变化来表征表面活性剂的CMC，如:表面 张力法、电导法、染料法、光散射法、增容作用法等。使用不同的理化性质方法对表面活性剂 CMC测定时，由于灵敏度以及所测量的表面活性的响应范围不同等因素的影响，往往造成测 定的CMC值有较大差异。此外，现有的测定方法常需要使用操作较为复杂、价格昂贵的仪器， 不利于推广。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种利用细胞血素 C自组装过氧化物酶 测定表面活性剂临界胶束浓度的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种利用细胞血素 C自组装过氧化物酶测定表面活性剂临界胶束浓度的方法，其包括 如下步骤： 1)取不同质量的表面活性剂分别溶于磷酸盐缓冲液中，获得一系列具有一定浓度梯度 的表面活性剂溶液； 2 )向步骤1)所得各溶液中加入细胞色素 C; 3) 向步骤2)所得各溶液中加入愈创木酚； 4) 向步骤3)所得各溶液中加入双氧水，于25 - 50°C开始酶促反应，同时记录愈创木酚 氧化初始速度； 5) 以表面活性剂浓度为横坐标，以愈创木酚氧化初始速度为纵坐标，在excel中进行作 图，添加移动平均趋势线幂趋势线和移动平均趋势线，通过改变移动平均趋势线中的移动 平均周期使移动平均趋势线与幂趋势线相切，切点对应的表面活性剂浓度即为临界胶束浓 度。
[0007] 具体的，酶促反应中（即以添加双氧水后所获得的体系为基准，来计量体系中表面 活性剂、细胞色素 C、愈创木酚以及H2〇2的浓度），细胞色素 C的浓度为2 -16 ymol/L;愈创木 酸的初始浓度为1.5 mmol/L;双氧水以H2O2计，H2O2的初始浓度为0.5 mmol/L。
[0008] 优选的，步骤4)中所述表面活性剂可以为十二烷基磺酸钠（SDS)、十烷基硫酸钠 (SDeS)、十二烷基肌氨酸钠（SLS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基三甲基氯化铵 (DTAC)或十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)等。
[0009] 当加入h2〇2后，酶促反应开始进行，愈创木酚氧化初始速度可通过测量四邻甲氧基 连HKTetraguaiacol，470nm处摩尔吸光系数为26.6 mirVirf1)的形成速率来获得（如下式 所示）： .:4::愈:创本齡:·:十:2 .?? ~一·、、、、+:懷部甲:氧塞连酸::...:十 4 ..Ha.Q. 〇
[0010] 具体的，步骤4)中所述愈创木酸氧化初始速度通过下述公式计算获得：
式中，v为愈创木酚氧化初始速度； 八2、六1分别为七2、1：1时四邻甲氧基连酸47〇111]1处的吸光值山、1：1单位5(^2、1：1取值均不大 于20秒）； b为比色皿光程，lcm; ε为四邻甲氧基连酚470nm处的摩尔吸光系数。
[0011] 细胞色素 C是含有血红素的一类蛋白质，分子直径为3 nm左右。细胞色素 C中心铁 离子与卟啉环产生四个配位键，另外分别与甲硫氨酸(met-80)和组氨酸(his-18)产生配 位，使细胞色素 C具有电子传递作用。天然细胞色素 C过氧化物酶活性极低，但具有非常好的 稳定性，可耐受宽范围的pH环境(pH 2~11)及120 °C以上的高温环境。表面活性剂如:十二 烷基磺酸钠 (Sodium dodecyl sulfate, SDS)，具有极性头部和非极性尾部结构，当其浓度 达到临界胶束浓度时在极性溶液中可自发形成胶团结构。因此，本发明提出利用细胞血素 C 与表面活性剂自组装形成胶团结前后过氧化物酶活性不同的原理（原理示意图如图1所 示），通过测量细胞色素 C与不同浓度表面活性剂组装时所具有的过氧化物酶活性，获得成 胶团前后拐点，同时并采用一种新数据处理方法，获得表面活性剂的CMC。
[0012] 和现有技术相比，本发明方法的有益效果： 利用细胞血素 C与表面活性剂自组装形成胶团结前后过氧化物酶活性不同的原理，通 过测量细胞色素 C与不同浓度表面活性剂组装时所具有的过氧化物酶活性，经数据处理，能 够获得表面活性剂的CMC。本发明方法适用于测量离子型表面活性剂的CMC，具有工作pH、温 度范围广，操作简便，灵敏度高，重复性好等优点。
【附图说明】
[0013] 图1为本发明测定方法的原理示意图； 图2为本发明测定方法中CMC的获取过程示意图； 图3为细胞色素 C浓度对CMC测定的影响； 图4为磷酸盐缓冲液pH值对CMC测定的影响； 图5为酶促反应温度对CMC测定的影响。
【具体实施方式】
[0014] 以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围 并不局限于此。
[0015] 下述以十二烷基磺酸钠(SDS)为表面活性剂，进行其CMC的测定。
[0016]原理及方法 1.1试剂： 磷酸盐缓冲液(Na2HP〇4-NaH2P〇4)、天然细胞色素 C(Cyt c，MW=886.9，上海宝蔓生物制 品有限公司）、愈创木酚溶液(Guaiaco 1，Sigma公司）、过氧化氢(30% H2〇2)、双蒸水(H20)。待 测表面活性剂(十二烷基磺酸钠，SDS)。
[0017] 1.2试剂配制。
[0018] ①磷酸盐缓冲液(Na2HP〇4_NaH2P〇4)的配制： 取89.5g Na2HP〇4和39.0g NaH2P〇4分别用双蒸水定溶于500ml容量瓶，摩尔浓度为 500mmol/L。实验所需缓冲液浓度为50mmol/L，分别将Na2HP〇4和NaH2P〇4母液稀释10倍后，将 二者按不同体积比分别调制所需pH值。配制好后，4°C低温储存。
[0019] ②天然细胞色素 C(Cyt c)溶液的配制： 取0.62g粉末状马心细胞色素 C，50ml双蒸水溶解，摩尔浓度为lmmol/L。配制好后，-20 °C冷冻储存。
[0020] ③愈创木酚(Gua iaco 1)溶液的配制： 取0.5ml浓度为9mol/L的愈创木酚溶液，加入99ml温热(<60°C)双蒸水中，摇晃，使愈创 木酚充分溶解于双蒸水中，稀释后的摩尔浓度为45mmol/L。配制好后，避光常温储存。
[0021] ④典型过氧化氢(h2〇2)溶液的配制： 取13.5μ1浓度为1 Omo VL的H2〇2溶液，加入27ml磷酸盐