一种脂质体包封体积的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种脂质体包封体积的测定方法，具体涉及药物制造领域中脂质体制 剂的包封体积的测定。
【背景技术】
[0002] 脂质体药物已经成为当前药物剂型改造的重要方向，因其具有良好的生物相容 性，以及可改变被包封药物体内分布和提高药物治疗指数而备受关注，利用脂质体进行剂 型改造不仅可以提高药物的溶解性、利用效率、降低药物不良反应，还能进行靶向给药，有 效将药物输送到病灶位置专一性地杀伤肿瘤或病灶细胞，同时避免全身用药对身体造成的 损伤。
[0003] 包封体积是指脂质体内包裹水相的体积占溶液总体积的百分比，当脂质体包封水 溶性药物时，包封体积影响载药量及药物在体内的释放速度、生物分布、药物代谢动力学特 征等，是脂质体药物药效评价的重要指标，也是评价与改造脂质体药物制造工艺的重要依 据。目前，包封体积的测定方法主要有:溶质包封法、电子自旋共振法、电导率法、核磁共振 法等。溶质包封法是将膜非渗透性标记物加入水化介质，使标记物进入脂质体内，通过测定 内外水相标记物信号强度及脂质浓度得包封体积，但非渗透性标记物会存在于整个测定过 程中，影响测定结果；电子自旋共振法，需要分离脂质体与外水相探针或对展宽剂溶液的渗 透压及pH有严格要求，因此适用范围窄；电导率法要求选择标记物必须是电中性、膜不渗透 性且不干扰电导率测定的物质；核磁共振法，温度对结果影响较大，温度越高，膜渗透性增 加，内外水相水德扩散系数逐渐接近，使测定的包封体积值减小；同时上述测定方法有的需 要特殊的仪器设备、有的需要进行脂质体与脂质体外溶液的有效分离，因此，现有方法存在 步骤复杂、限制性强、成本高等缺陷，缺少直接测量脂质体包封体积的快速测定方法。
【发明内容】
[0004] 本发明为解决现有技术中脂质体包封体积测定方法复杂、限制性强的问题，提供 了一种脂质体包封体积的快速测定方法，该测定方法不需要进行离心、透析、凝胶过滤等复 杂操作，直接将特异性荧光探针加入到脂质体溶液中快速测定脂质体包封体积。用荧光探 针代替荧光染料，利用荧光探针的高灵敏性与可开关控制的特性实现脂质体包封体积的快 速测定。
[0005] 为解决脂质体包封体积的快速测定问题，本发明的技术构思是:利用一种不能透 过脂质体的水溶性探针进行脂质体包封体积的测定。根据脂质体与包裹药物特点选择适宜 的离子及其特异性水溶性荧光探针，将离子与脂质体制备过程中的水相混合，这样离子将 在脂质体制备后分散到脂质体内外两侧。取一定量的脂质体溶液，加入荧光探针，由于荧光 探针不能透过脂质体，只能存在于脂质体外部，所以荧光探针只检测脂质体外部的离子。通 过测定荧光强度，根据荧光标准曲线与线性回归方程，可以计算出脂质体外的离子总数。利 用表面活性剂破坏脂质体膜，使脂质体包封的离子释放，再加入荧光探针，测定荧光强度， 根据荧光标准曲线与与线性回归方程，可以计算出脂质体膜破坏后的离子总量，进而可以 通过公式计算脂质体的包封体积。
[0006] 本发明的技术要点是:一种脂质体包封体积的测定方法，在脂质体制备过程中加 入离子溶液，根据离子组成选择荧光探针，将荧光探针加入到脂质体溶液中，根据荧光强度 计算出脂质体外的离子总量T1;破坏脂质体膜使脂质体内所有离子释放，利用荧光探针的 荧光强度可以测得脂质体膜破坏后溶液中离子总量T2;按公式(1)计算脂质体的包封体积：
[0007] 脂质体的包封体积百分数PIN(%) = (T2-T1)/T2 (1)。
[0008] 进一步的，脂质体包封体积的测定方法包括以下步骤:根据脂质体选择适应的离 子及荧光探针，先将离子探针分别与不同浓度范围的离子溶液混合均匀，测定荧光强度，计 算荧光曲线的直线回归方程(2):
[0009] y=Ax+B (2)；
[0010] 再将荧光探针与脂质体溶液混合均匀，测定破坏前荧光强度F1，用表面活性剂破 坏脂质体膜，测定破坏后荧光强度F2,根据公式(3)计算脂质体外的离子总量T1，根据公式 (4)计算脂质体膜破坏后溶液中离子总量T2;V是脂质体溶液的总体积；
[0011] T1 = (F1-B) XV/A (3)
[0012] T2 = (F2-B) XV/A (4)；
[0013] 根据T1和T2的值按照公式(1)计算脂质体的包封体积。
[0014] 进一步的，所述的荧光探针是水溶性的。
[0015] 进一步的，荧光探针所用的离子可以是钙离子、铜离子、锌离子、锰离子、铁离子、 钠离子或钾离子中一种或多种。
[0016] 作为本发明一个优选的实施例，选择铜离子和铜离子荧光探针测定脂质体包封体 积，固定铜离子荧光探针终浓度，检测浓度范围1~20wii 〇l/L铜离子荧光强度，确定铜离子 荧光曲线的直线回归方程。
[0017] 进一步的，铜离子浓度范围1~13ymol/L，直线回归方程y = -17.065Χ+354.23。
[0018] 与现有技术相比，本发明测定方法简便、无需分离、透析、凝胶过滤等复杂操作，耗 时短，能够实现脂质体包封体积的快速测定，该方法测定结果准确性高，设备简单，适用范 围广，可以用于脂质体产品检测与制备工艺优化，为脂质体包封水溶性药物的实际应用起 到关键作用。
【附图说明】
[0019]图 1铜离子焚光探针[Ru(bpy)2(phen-cyc) ] (PF6)2;
[0020]图2荧光强度与铜离子浓度关系曲线；
[0021]图3利用铜离子荧光探针进行脂质体溶液测定的结果。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下述实施例中如无特殊说明，所采用的实验方法均为常规方 法，所用材料、试剂等均可从化学公司购买。
[0023] 实施例1:使用磷脂酰胆碱(D0PC)制备脂质体并测定脂质体包封体积
[0024] 1.1脂质体的制备
[0025] 采用薄膜分散法进行脂质体制备。称取D0PC磷脂0.0063克置于适宜容器中，用5mL 氯仿完全溶解，在旋转蒸发仪上缓慢蒸于并使磷脂均匀分布于容器内表面，放在真空干燥 机中真空干燥5小时以上去除氯仿。将70°C的铜离子溶液加入到干燥后的磷脂薄膜上，用漩 涡震荡仪振荡，然后用超声设备处理制备脂质体。空白对照用去离子水代替铜离子溶液。 [0026] 1