一种果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗氧化活性的评价方法，特别是涉及一种果蔬食品及功能保健品 抗氧化活性的评价方法，该方法可以应用于生物医药、食品、保健品等行业领域。
【背景技术】
[0002] 现代医学研究表明，包括心血管类疾病、癌症、糖尿病等多种慢性疾病都与自由基 密切相关。在正常情况下，人体内自由基的产生与消除处于平衡状态。随着年龄的增长，抗 氧化酶类活性下降，使体内清除自由基的能力下降，体内过量的自由基对生物大分子(如蛋 白质、脂质、DNA)具有损伤作用，进而导致疾病和衰老。同时，外界因素如污染的空气、食物， 不良生活方式、情绪因素等也会造成体内自由基的过量产生。多食富含有天然抗氧化剂的 果蔬、服用含有天然抗氧化剂的保健食品是减轻机体氧化最有效的方法。
[0003] 目前评价抗氧化活性的方法有体内和体外两类。体内方法即动物或人体试验，这 种方法的优点是准确性高，但时间长、成本高、费用高，因此一般不作为大量初筛和前期评 价工作，只作为功能食品的最终评价方法。
[0004] 体外方法分为化学法（如01^^3(：、0??!^8了3、？1^?等）和基于细胞水平的方法 (Cellular Antioxidant Activity Assay，简称CAA)。化学法在生理条件和环境、吸收和生 物利用率、代谢等方面无法达到或接近体内的真实环境，因此不能如实反映抗氧化物质在 体内的真实状况。而细胞抗氧化活性分析CAA方法，由于它考虑了生物环境及吸收等，因此 其生物相关性很高，能较真实地反映出抗氧化物质在体内的抗氧化活性大小。利用CAA评价 方法来筛选评价比化学法所得的结果更准确可靠。相对而言，CAA方法是抗氧化活性评价的 较好的方法。
[0005] 由于抗氧化活性成分的多样性，它们在各种果蔬菜或功能食品中存在的方式是多 样的，如多酚类物质，它既有游离状态的自由酚，也有与纤维素、蛋白质、多糖等结合在一起 的结合酚;而且，不论是自由的还是结合状态的多酚，在人体内经过消化时结构也会发生变 化，而在体内最终起抗氧化作用的是消化之后的结构状态。但是，目前不论是化学法还是细 胞CAA法，在抗氧化活性物质的提取过程中都是采用溶剂提取法，虽然考虑到了游离态和结 合态的问题，但没有考虑到人体中的消化过程及结构的转变问题；因此，溶剂提取法存在缺 陷，有待进一步改进。
【发明内容】
[0006] 针对目前体外抗氧化活性分析和评价方法中直接采用溶剂对样品的抗氧化剂物 质进行提取存在的与人体消化吸收真实体系差异性较大的问题，本发明建立一种基于细胞 水平的新的抗氧化活性评价方法，通过对被测样品的抗氧化活性物质的提取中采用模拟人 体消化过程的多酶联合酶解方法，再结合细胞水平的抗氧化活性分析方法，从而建立一种 生物相关性更强，更接近动物试验水平的抗氧化活性评价方法。
[0007] 本发明通过在体外模仿人体消化过程，以提取出样品中的不同状态的抗氧化活性 物质，结合化学及细胞水平的抗氧化活性评价方法，对果蔬菜、功能食品、保健品及普通食 品的抗氧化活性进行全面系统评价。具体而言，本发明在样品抗氧化活性物质的提取过程 中采用模拟人体消化的多酶联合酶解提法代替传统的溶剂萃取法，并与抗氧化活性的CAA 方法有机结合起来对抗氧化活性进行综合评价，可以最大限度使测定结果接近人体和动物 试验，因此更为准确可靠。
[0008] 本发明首次提出在细胞抗氧化活性评价方法的基础上，建立一种新的抗氧化活性 评价方法。该发明的要点是针对目前CAA方法及其它化学评价方法中对抗氧化活性物质的 提取中直接溶剂提取与真实人体消化吸收体系存在很大偏差的问题，先对样品进行近似于 人体消化过程的多酶联合酶解过程，然后采用乙酸乙酯对酶解产物进行萃取，再利用细胞 水平抗氧化评价方法CAA法对抗氧化活性进行分析，从而建立一种评价抗氧化活性的新方 法。由于酶解过程会产生蛋白降解的氨基酸、多糖降解后产生的还原糖，而目前研究中都没 有考虑这些因素可能对CAA测定的影响，本发明考虑到还原糖也具有还原性，采用乙酸乙酸 对提取物进行萃取，有效消除还原糖及氨基酸的影响，克服了还原糖及氨基酸等对分析测 定过程的影响。
[0009] 本发明目的通过如下技术方案实现：
[0010] -种果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，包括如下步骤：
[0011] (1)被测样品的预处理:将待测原料配置成水匀浆或直接取口服液类保健食品；
[0012] (2)样品的多酶联合处理提取：
[0013] a、样品的胃蛋白酶处理
[0014] 将预处理水匀浆或保健口服液用HC1调节pH至0.5~2.0，取胃蛋白酶用HC1水溶液 溶解后加入，用锡箱纸包裹避光，不断通入氮气，于37 °C水浴摇床里反应0.5~2h，离心，分 离出上清液A和残渣;每100毫升预处理水匀浆或保健口服液加入5~30mg胃蛋白酶；
[0015] b、样品的胰蛋白酶处理
[0016] 经胃蛋白酶处理并离心分离后的残渣，加入蒸馏水，用NaHC〇3水溶液调节pH至6.5 ~8;然后取胰蛋白酶，溶于Na 2C03/NaHC03缓冲液后加入;锡箱纸包裹避光，不断通入氮气， 在37 °C的恒温水浴摇床里反应1~6h;反应结束，离心，分离出上清液B和残渣;每100毫升预 处理水匀浆或保健口服液胃蛋白酶处理得到的残渣加入80 -120mL蒸馏水;每mL缓冲液加入 胰蛋白酶l_5mg;
[0017] c、样品的链霉蛋白酶E处理
[0018] 经胰蛋白酶处理并离心后所得残渣再加入蒸馏水，采用0.1M的NaOH水溶液调节pH 为7.0 - 9.0，加入链霉蛋白酶E，在37 °C下酶解0.5 - 2h，离心，分离出上清液C和残渣;每100毫 升预处理水匀浆或保健口服液胃蛋白酶和胰蛋白酶处理得到的残渣加入80-120mL蒸馏水 和0.5-5mg链霉蛋白酶E;
[0019] d、样品的植物复合水解酶Viscozyme L处理
[0020]将步骤C反应物离心后所得残渣，加入蒸馏水，采用0.5M的HC1水溶液调节pH至 3.0-4.5，加入诺维信复合植物水解酶(Viscozyme L)，在37°C的恒温水浴摇床里反应作用 时间为8- 18h;酶解结束，离心分离，倒出并收集上清液;底部残渣加入蒸馏水，搅拌，离心， 取上清液后，残渣再1次用水提一次;合并3次离心上清液，为上清液D;每100毫升预处理水 匀浆或保健口服液经步骤a-c处理得到的残渣加入80-120mL蒸馏水和20-100yL诺维信复合 植物水解酶(Viscozyme L);
[0021] e、提取液的还原糖的去除
[0022]分别将上清液A、B、C和D合并，在40 °C水浴下真空浓缩，浓缩到体积为50mL，加入1 -3倍体积的冷乙酸乙酯萃取，离心取乙酸乙酯层;余下水相再萃取2次，合并3次萃取液，真空 浓缩挥干乙酸乙酯后加入蒸馏水定容至10mL，用样品管分装于-80°C冰箱冻存待测；
[0023] (3)抗氧化物质含量及活性分析
[0024] a、总多酚含量的测定参照Folin-Ciocalten比色法，以没食子酸为标准品，采用分 光光度法对总酚类物质的含量进行测定；
[0025] b、总黄酮含量的测定采用SBC比色法，以儿茶素为标准品，通过一系列反应将所有 的黄酮类化合物都转换成花青素的结构，再与香草醛发生显色反应在490nm波长下进行比 色测定;总黄酮含量用儿茶素当量来表示；
[0026] c、CAA 测定
[0027]按照CAA进行抗氧化活性的测定;荧光染料DCFH-DA进入细胞后被细胞内酯酶水解 成DCFH，DCFH被自由基引发剂AAPH产生的自由基R00 ·氧化成荧光化合物DCF，通过荧光的 降低程度来衡量抗氧化能力。
[0028]为进一步实现本发明目的，优选地，所述将待测原料配置成水匀浆是将水果、蔬菜 的生鲜原料加入蒸馏水，采用搅碎机打浆;或者是将固体功能食品、保健品、普通食品或干 燥的食品原材料，采用粉碎机粉碎成细粉，加入蒸馏水调成匀浆。
[0029]优选地，每克水果、蔬菜的生鲜原料加入3 - 6mL蒸馏水;每克固体功能食品、保健 品、普通食品和干燥的食品原材料粉末加入20 - 40mL蒸馏水。
[0030] 优选地，所述步骤a-d的离心条件为3000g，4°C，5min。
[0031] 优选地，所述胃蛋白酶用HC1水溶液溶解的HC1水溶液的浓度为0.01M;所述预处理 水匀浆或保健口服液用HC1水溶液调节pH至0.5~2.0的HC1水溶液的浓度为0.1 - 1M。
[0032] 优选地，所述NaHC03水溶液的浓度为0.1M。
[0033] 优选地，所述Na2C03/NaHC03缓冲液的浓度为0.1M。
[0034] 优选地，所述冷乙酸乙酯的温度为4°C。
[0035]更优选地，本发明采取如下具体方法。一种果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的 评价方法，包括如下步骤：
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