036] (1)被测样品的预处理
[0037]将待测原料配置成水匀浆;对于水果、蔬菜的生鲜原料，取25g供试样品，加入75~ 150mL蒸馏水，采用搅碎机打浆1~2min，并用高速匀浆机进一步将物料打成成匀浆，备用； 对于固体功能食品、保健品、普通食品或干燥的食品原材料，采用粉碎机粉碎成细粉，取5g 粉末，加入100~200mL蒸馏水调成匀浆，备用;对于口服液类保健食品，无需要进行预处理； [0038] (2)样品的多酶联合处理提取
[0039] a、样品的胃蛋白酶处理
[0040]在250mL三角中，加入上述果蔬、功能食品或食品原料样品预处理匀浆或保健口服 液100mL，用0 · 1M-1M的HC1调节pH至0 · 5~2 · 0，取5~30mg胃蛋白酶用5mL 0 · 01M HC1溶解后 加入，用锡箱纸包裹避光，并向三解瓶中不断通入氮气，于37 °C水浴摇床里反应0.5~2h，离 心(3000g，4°C) 5min，分离出上清液A和残渣；
[0041] b、样品的胰蛋白酶处理
[0042] 经胃蛋白酶处理并离心分离后的残渣，加入80-120mL蒸馏水，用0.1M NaHC03调节 pH至6.5~8。然后取5-25mg胰蛋白酶，溶于5mL 0.1M Na2C03/NaHC03缓冲液后加入。采用锡 箱纸包裹避光，且在氮气流下在37°C的恒温水浴摇床里反应1~6h。反应结束，离心分离 (3000g，4°C) 5min，倒出并收集上清液，记为上清液B，底部残渣待进一步处理。
[0043] c、样品的链霉蛋白酶E处理
[0044] 经胰蛋白酶处理并离心后所得残渣再加入80-120mL蒸馏水，采用0.1M NaOH调节 pH为 7·0-9·0，加入0·5-5mg链霉蛋白酶E，在37°C下酶解0·5-2h，离心（3000g，4°C)5min，取 上清液C。
[0045] d、样品的植物复合水解酶Viscozyme L处理
[0046] 将上述反应物离心后所得残渣，加入80-120mL蒸馏水，采用0.5M HC1调节pH至 3.0-4.5，加入20 - 100yL诺维信复合植物水解酶(Viscozyme L)，在37°C的恒温水浴摇床里 反应作用时间为8-18h。酶解结束是，离心分离(3000g，4°C)5min，倒出并收集上清液;底部 残渣加入100mL蒸馏水，搅拌3min，离心，取上清液后，残渣再1次用水提一次。合并3次离心 上清液，为上清液D。
[0047] e、提取液的还原糖的去除
[0048]分别将上清液A、B、C和D合并，在40 °C水浴下真空浓缩，浓缩到体积为50mL，加入1 -3倍体积的4°C冷乙酸乙酯萃取，离心取乙酸乙酯层;余下水相再萃取2次，合并3次萃取液， 真空浓缩挥干乙酸乙酯后加入蒸馏水定容至10mL，用样品管分装于-80°C冰箱冻存待测。 [0049] (3)抗氧化物质含量及活性分析
[0050] 8、总多酸含量的测定参照卩〇1;[11-0;[00&]^611比色法（3;[叫161:011，01'1:1101^1'，& Lamuela-Raventos，1999)。以没食子酸为标准品，采用分光光度法对总酸类物质的含量进 行测定。
[0051] b、总黄酮含量的测定采用美国康奈尔大学刘瑞海教授建立的硼氢化钠/氯醌 (38〇比色法0丨&即」丨11他&1?!11^11，2〇〇8)。以儿茶素为标准品，通过一系列反应将所有的 黄酮类化合物都转换成花青素的结构，再与香草醛发生显色反应在490nm波长下进行比色 测定。总黄酮含量用儿茶素当量来表示。
[0052] c、CAA 测定
[0053] 测定方法完全按照美国康奈尔大学刘瑞海教授(Kelly L.Wolfe和Rui Hai Liu) 建立的CAA(cellular antioxidant activity)进行抗氧化活性的测定。焚光染料DCFH-DA 进入细胞后被细胞内酯酶水解成DCFH，DCFH很容易被自由基引发剂AAPH产生的自由基 R00 ·氧化成荧光化合物DCF(dichlorofluorescein)，抗氧化剂的存在可以和DCFH竞争自 由基，从而减少荧光物质的形成，最后通过荧光的降低程度来衡量抗氧化能力。
[0054] 相对于现有技术，本发明具有如下优点和效果：
[0055] 1)本发明在抗氧化活性物质的提取方法上采用与人体消化过程相近的多酶联合 酶解提取方法，这样提取得到的抗氧化活性成分就与食品或保健品在人体中真实消化吸收 过程较为相近;而且，在抗氧化活性的测定方法上也采用目前较先进的CAA法，与传统的化 学法相比，其结果与人体更相近。因此，本发明将这两者有机结合起来，就能使食品及功能 食品的抗氧化活性评价更为合理可信。
[0056] 2)传统溶剂萃取法是先用冷的80%丙酮-水进行提取自由酚，提取三次后合并提 取液浓缩回收溶剂定容得到测定自由酚的分析小样;然后残渣采用氢氧化钠在氮气保护下 消化1小时后再用乙酸乙酯萃取三次，回收溶剂后定容得结合酚的有效成分分析小样。表1 为本发明方法与溶剂萃取法的最后抗氧化活性测定结果的比较，表中本发明的数据来自实 施例的总结;表1可见，本发明将多酶联合酶解提取法与传统的溶剂萃取法得到的测定结果 进行对比，发现本发明采用的多酶联合酶解法的效果显著好于溶剂提取法。
[0057] 表1本发明方法与溶剂萃取法的最后抗氧化活性测定结果的比较
【具体实施方式】
[0059] 下面结合实施例对本发明作进一步的描述，需要说明的是，实施例不构成对本发 明要求保护范围的限定。
[0060] 下列实施例中抗氧化物质含量及活性分析
[0061 ] 8、总多酸含量的测定参照卩〇1;[11-0;[00&]^611比色法（3;[叫161:011，01'1:1101^1'，& Lamuela-Raventos，1999)。以没食子酸为标准品，采用分光光度法对总酸类物质的含量进 行测定。
[0062] b、总黄酮含量的测定采用美国康奈尔大学刘瑞海教授建立的硼氢化钠/氯醌 (38〇比色法0丨&即」丨11他&1?!11^11，2〇〇8)。以儿茶素为标准品，通过一系列反应将所有的 黄酮类化合物都转换成花青素的结构，再与香草醛发生显色反应在490nm波长下进行比色 测定。总黄酮含量用儿茶素当量来表示。
[0063] c、CAA 测定
[0064] 测定方法完全按照美国康奈尔大学刘瑞海教授(Kelly L.Wolfe和Rui Hai Liu) 建立的CAA(cellular antioxidant activity)进行抗氧化活性的测定。焚光染料DCFH-DA 进入细胞后被细胞内酯酶水解成DCFH，DCFH很容易被自由基引发剂AAPH产生的自由基 R00 ·氧化成荧光化合物DCF(dichlorofluorescein)，抗氧化剂的存在可以和DCFH竞争自 由基，从而减少荧光物质的形成，最后通过荧光的降低程度来衡量抗氧化能力。
[0065] 实施例1
[0066]取藏青25青稞10g，采用家用小型打粉机将其打成粉末，取5g粉末，加入100mL蒸馏 水调成匀浆，先采用〇 . 1M的HC1调节pH至2.0，然后加入20mg的胃蛋白酶，在37 °C下酶解 1 · 5h。离心（3000g，4°C )5min，倒出上清液A，残渣加入100mL蒸馏水，用0 · 1M NaHC〇3调节 pH7 · 5，加入15mg胰蛋白酶，在37°C下搅拌酶解5h，然后离心（3000g，4°C )5min，取上清液B; 残渣再加入lOOmL蒸馏水，采用0.1M NaOH调节pH8,并加入2mg链霉蛋白酶E并在37°C下酶解 lh，离心，取上清液C，残渣加入100mL蒸馏水后调节pH4，并加入50yL诺维信复合植物水解酶 (Viscozyme L)并在37°C下搅拌酶解15h，离心，取上清液D。收集上清液A、B、C和D，浓缩至 50mL，加入50mL乙酸乙酯萃取，吸取乙酸乙酯层后，水相再加入50mL乙酸乙酯萃取，取上层， 再重复萃取一次，合并三次萃取液，在45°C下采用旋转真空浓缩回收乙酸乙酯后，往蒸馏烧 瓶中加入8mL蒸馏水，并在超声浴中振荡3min，最后倒出并采用10mL容量瓶定容至10mL，采 用lmL样品管分装冷冻于-80°C冰箱中备用。分别进行总多酚和总黄酮含量以及CAA的测定， 结果如表2所示。
[0067]传统溶剂萃取法是先用冷的80%丙酮-水进行提取自由酚，提取三次后合并提取 液;然后残渣采用氢氧化钠在氮气保护下消化1小时后再用乙酸乙酯萃取三次，回收完溶剂 后将上述自由酚提取液加入，再进一步浓缩定容10mL后分装冷藏或马上分析总酚、总黄酮 及CAA测定，以下实施例有关溶剂提取法同实施例1。
[0068]表2藏青25的抗氧化活性测定结果并与溶剂提取法比较
[0071] 实施例2
[0072]取云南长黑青稞10g，采用家用小型打粉机将其打成粉末，取5g粉