末，加入120mL蒸 馏水调成匀浆，先采用0.1M的HC1调节pH至1.5,然后加入25mg的胃蛋白酶，在37°C下酶解 2h。离心（3000g，4°C )5min，倒出上清液A，残渣加入120mL蒸馏水，用0.1M NaHC〇3调节 pH7 · 0，加入20mg胰蛋白酶，在37°C下搅拌酶解6h，然后离心（3000g，4°C )5min，取上清液B; 残渣再加入100mL蒸馏水，采用0.1M NaOH调节pH8.6，并加入3mg链霉蛋白酶E并在37°C下酶 解1.5h，离心，取上清液C，残渣加入120mL蒸馏水后调节pH4.5，并加入40yL诺维信复合植物 水解酶(Viscozyme L)并在37°C下搅拌酶解12h，离心，取上清液D。收集上清液A、B、C和D，浓 缩至50mL，加入50mL乙酸乙酯萃取，吸取乙酸乙酯层后，水相再加入50mL乙酸乙酯萃取，取 上层，再重复萃取一次，合并三次萃取液，在45°C下采用旋转真空浓缩回收乙酸乙酯后，往 蒸馏烧瓶中加入8mL蒸馏水，并在超声浴中振荡3min，最后倒出并采用10mL容量瓶定容至 10mL，采用lmL样品管分装冷冻于-80°C冰箱中备用。分别进行总多酚和总黄酮含量以及CAA 的测定，结果如表3所示。
[0073]表3云南长黑青稞抗氧化活性测定结果并与溶剂提取法比较
[0075] 实施例3
[0076] 取25g梨，加入125mL蒸馏水，采用搅碎机打浆2min，并用高速匀浆机进一步将物料 打成成匀浆，采用0.1M的HC1调节pH至1.0,然后加入15mg的胃蛋白酶，在37°C下酶解lh。离 心（3000g，4°C)5min，倒出上清液A，残渣加入100mL蒸馏水，用0· 1M NaHC〇3调节pH8·0，加入 l〇mg胰蛋白酶，在37 °C下搅拌酶解4.5h，然后离心（3000g，4 °C) 5min，取上清液B;残渣再加 入100mL蒸馏水，采用0.1M NaOH调节pH8.0，并加入4mg链霉蛋白酶E并在37°C下酶解2h，离 心，取上清液C，残渣加入120mL蒸馏水后调节pH3.5,并加入70yL诺维信复合植物水解酶 (Viscozyme L)并在37°C下搅拌酶解18h，离心，取上清液D。收集A、B、C和D，浓缩至50mL，加 入50mL乙酸乙酯萃取，吸取乙酸乙酯层后，水相再加入50mL乙酸乙酯萃取，取上层，再重复 萃取一次，合并三次萃取液，在45 °C下采用旋转真空浓缩回收乙酸乙酯后，往蒸馏烧瓶中加 入8mL蒸馏水，并在超声浴中振荡3min，最后倒出并采用10mL容量瓶定容至10mL，采用lmL样 品管分装冷冻于_80°C冰箱中备用。分别进行总多酚和总黄酮含量以及CAA的测定，结果如 表4所示。
[0077] 表4梨的抗氧化活性测定结果并与溶剂提取法比较
[0079]传统溶剂萃取法是先用冷的80%丙酮-水进行提取自由酚，提取三次后合并提取 液浓缩回收溶剂定容得到测定自由酚的分析小样;然后残渣采用氢氧化钠在氮气保护下消 化1小时后再用乙酸乙酯萃取三次，回收溶剂后定容得结合酚的有效成分分析小样。表2-4 三个实施例的结果表明，本发明所采用的方法测得的抗氧化活性的CAA值都要明显高于传 统的溶剂提取法，而且多酚和总黄酮的含量也有相似的规律，显然采用传统方法会使抗氧 化活性的测定结果虚低，而本发明方法则可以获得较为可靠的结果。
【主权项】
1. 一种果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 被测样品的预处理:将待测原料配置成水匀浆或直接取口服液类保健食品； (2) 样品的多酶联合处理提取： a、 样品的胃蛋白酶处理 将预处理水匀浆或保健口服液用HC1调节pH至0.5~2.0，取胃蛋白酶用HC1水溶液溶解 后加入，用锡箱纸包裹避光，不断通入氮气，于37°C水浴摇床里反应0.5~2h，离心，分离出 上清液A和残渣;每100毫升预处理水匀浆或保健口服液加入5~30mg胃蛋白酶； b、 样品的胰蛋白酶处理 经胃蛋白酶处理并离心分离后的残渣，加入蒸馏水，用NaHC03水溶液调节pH至6.5~8; 然后取胰蛋白酶，溶于Na2C03/NaHC03缓冲液后加入;锡箱纸包裹避光，不断通入氮气，在37 °C的恒温水浴摇床里反应1~6h;反应结束，离心，分离出上清液B和残渣;每100毫升预处理 水匀浆或保健口服液胃蛋白酶处理得到的残渣加入80 -120mL蒸馏水;每mL缓冲液加入胰蛋 白酶l-5mg; c、 样品的链霉蛋白酶E处理 经胰蛋白酶处理并离心后所得残渣再加入蒸馏水，采用0.1M的NaOH水溶液调节pH为 7.0 - 9.0，加入链霉蛋白酶E，在37 °C下酶解0.5 - 2h，离心，分离出上清液C和残渣;每100毫升 预处理水匀浆或保健口服液胃蛋白酶和胰蛋白酶处理得到的残渣加入80 -120mL蒸馏水和 0.5-5mg链霉蛋白酶E; d、 样品的植物复合水解酶Viscozyme L处理 将步骤c反应物离心后所得残渣，加入蒸馏水，采用0.5M的HC1水溶液调节pH至3.0 -4.5，加入诺维信复合植物水解酶(Viscozyme L)，在37°C的恒温水浴摇床里反应作用时间 为8- 18h;酶解结束，离心分离，倒出并收集上清液;底部残渣加入蒸馏水，搅拌，离心，取上 清液后，残渣再1次用水提一次;合并3次离心上清液，为上清液D;每100毫升预处理水匀浆 或保健口服液经步骤a-c处理得到的残渣加入80-120mL蒸馏水和20-100yL诺维信复合植物 水解酶(Viscozyme L); e、 提取液的还原糖的去除 分别将上清液A、B、C和D合并，在40°C水浴下真空浓缩，浓缩到体积为50mL，加入1 - 3倍 体积的冷乙酸乙酯萃取，离心取乙酸乙酯层;余下水相再萃取2次，合并3次萃取液，真空浓 缩挥干乙酸乙酯后加入蒸馏水定容至10mL，用样品管分装于-80°C冰箱冻存待测； (3) 抗氧化物质含量及活性分析 a、 总多酚含量的测定参照Folin-Ciocalten比色法，以没食子酸为标准品，采用分光光 度法对总酚类物质的含量进行测定； b、 总黄酮含量的测定采用SBC比色法，以儿茶素为标准品，通过一系列反应将所有的黄 酮类化合物都转换成花青素的结构，再与香草醛发生显色反应在490nm波长下进行比色测 定;总黄酮含量用儿茶素当量来表示； c、 CAA测定 按照CAA进行抗氧化活性的测定；荧光染料DCFH-DA进入细胞后被细胞内酯酶水解成 DCFH，DCFH被自由基引发剂AAPH产生的自由基R00 ·氧化成荧光化合物DCF，通过荧光的降 低程度来衡量抗氧化能力。2. 根据权利要求1所述的果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于， 所述将待测原料配置成水匀浆是将水果、蔬菜的生鲜原料加入蒸馏水，采用搅碎机打浆;或 者是将固体功能食品、保健品、普通食品或干燥的食品原材料，采用粉碎机粉碎成细粉，加 入蒸馏水调成匀浆。3. 根据权利要求2所述的果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于， 每克水果、蔬菜的生鲜原料加入3_6mL蒸馏水;每克固体功能食品、保健品、普通食品和干燥 的食品原材料粉末加入20 - 40mL蒸馏水。4. 根据权利要求1所述的果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于， 所述，步骤a_d的离心条件为3000g，4°C，5min。5. 根据权利要求1所述的果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于， 所述胃蛋白酶用HC1水溶液溶解的HC1水溶液的浓度为0.01M;所述预处理水匀浆或保健口 服液用HC1水溶液调节pH至0.5~2.0的HC1水溶液的浓度为0.1 - 1M。6. 根据权利要求1所述的果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于， 所述NaHC03水溶液的浓度为0.1M。7. 根据权利要求1所述的果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于， 所述Na2C03/NaHC0 3缓冲液的浓度为0.1M。8. 根据权利要求1所述的果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于， 所述冷乙酸乙酯的温度为4°C。
【专利摘要】本发明公开了一种果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法。该方法先将被测样品的预处理：将待测原料配置成水匀浆或直接取口服液类保健食品；然后对样品进行多酶联合处理提取，依次包括样品的胃蛋白酶处理、胰蛋白酶处理、链霉蛋白酶E处理和植物复合水解酶Viscozyme？L处理，再利用冷乙酸乙酯萃取的方式进行提取液的还原糖的去除，最后用现有方法进行抗氧化物质含量及活性分析，本发明通过对被测样品的抗氧化活性物质的提取中采用模拟人体消化过程的多酶联合酶解方法，再结合细胞水平的抗氧化活性分析方法，从而建立一种生物相关性更强，更接近动物试验水平的抗氧化活性评价方法。
【IPC分类】G01N1/28, G01N21/78, G01N21/31
【公开号】CN105572125
【申请号】CN201511035020
【发明人】郑必胜, 何陵玲, 朱勇, 扶雄, 刘瑞海
【申请人】华南理工大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月31日