一种菌类中β-葡聚糖的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于一种检测方法，特别是一种应用于菌类产品尤其是姬松茸产品中以β-葡聚糖的检测为核心技术的质量控制的标准及方法。
【背景技术】
[0002] 姬松茸（又名巴西蘑菇），原产巴西、秘鲁。它是一种夏秋生长的腐生菌，生活在高 温、多湿、通风的环境中，具杏仁香味，口感脆嫩。姬松茸菌盖嫩，菌柄脆，口感极好;蛋白质 组成中包括18种氨基酸，人体的8种必需氨基酸齐全，还含有多种维生素和麦角留醇。它对 抑制肿瘤(尤其是腹水癌）、医疗痔痿、增强精力、防止心脑血管疾病等都有疗效。
[0003] 因此随着姬松茸市场扩大，原料供不应求，市场上以假乱真、以次充好的现象日益 增多，对其质量控制提出了更高的要求。目前行业内"姬松茸"同类产品都是以"粗多糖"作 为含量测定指标，所采用的检测方法分为"硫酸-蒽酮UV法"和"苯酚-硫酸UV法"，以测定粗 多糖含量为质量指标，检测原理相似，硫酸-蒽酮和苯酚-硫酸溶液都可以与多种糖类进行 显色反应，常用于总糖的测定，一般常用于样品中糖的类型未知或结构多样、只能以葡萄糖 折合计算结果，该方法测定结果粗糙，无法分辨各种不同种类来源的糖类，专属性不强，而 测定过程中不可避免的受到其他辅料、添加剂中糖类的干扰，比如淀粉、糊精等多糖及甜味 剂糖精，这些都会对粗多糖含量的测定有很大的干扰。
[0004] 另外检测方法中，粗多糖的检测是使用紫外分光光度计测定，精密度低，检测限高 故而灵敏度低，而且易受环境干扰。
[0005] 因此对于姬松茸质量的检测，要想真正达到判定真伪优劣的目的，需要选用专属 性更强的指标、最好这个指标能够与姬松茸的生物营养活性相关，如能找到具有专属性的 姬松茸中活性营养成分的定量检测方法及指标当然最好，如不能找到专属性强的定量指 标，则就需要选择与活性营养成分高度相关的特征成分的定量方法及指标，同时采用一种 定性方法强化该定量方法的专属性，同时对其进行定性和定量的检测，方能实现既定真伪 且判优劣的目标，另外考虑到实际应用中的切实可行、通用方便，上述定性定量方法的检测 限要更低，而精密度要高。
[0006] β-葡聚糖是在微生物和植物中广泛存在的一种多糖，是组成高等植物、酵母菌和 真菌细胞壁的结构大分子之一，也是姬松茸中一种重要的特征指标，葡聚糖作为姬松茸 所含有的抗肿瘤及增强免疫功能成分，葡聚糖含量与功效成正比关系，因此选择该项指 标对产品的功效评价具有现实意义。因此成为了申请人在研究姬松茸及其相关产品质量控 制中一项重要的检测指标。
[0007] 但是，仅仅以β-葡聚糖HPLC含量测定方法，因目前该类方法的局限性，仍无法完全 排除其他糖类的干扰，不能确定所测定葡聚糖含量是否真为葡聚糖的含量，从而也就 无法对产品是否含有菌类，特别是是否含有姬松茸作出判断，从真伪上就首先不能作出判 断，则含量值对优劣的评价也就失去了意义。
[0008] 为此，我们经过广泛大量的技术调研与实验摸索，寻找发明出对含有菌类特别是 姬松茸的产品进行红外光谱特征指纹图谱扫描的方法，发现定性结果将对产品是否为姬松 茸制品具有鉴别价值，而且在红外光谱指纹扫描图谱定性试验中，我们确定该指纹图谱检 测可以不受糊精等糖类辅料的干扰，依然显示其特征吸收峰。因此采取红外光谱指纹图谱 扫描定性方法与β-葡聚糖HPLC定量方法同步应用于姬松茸产品质量控制分析，可以成功地 弥补定量测试结果在真伪判断上的不足之处，增强其专属性，定性与定量方法相配合形成 的检测评价体系，可以保证整体测定方法的客观性及可靠性。从而实现了以检测β-葡聚糖 为手段，进而评价姬松茸相关产品品质的质量真伪优劣同步评价方法，从而真正建立起了 能够反映菌类产品、特别是姬松茸类产品内在质量的指控方法和标准体系。
【发明内容】
[0009]本发明提供了一种菌类中β-葡聚糖的检测方法，所述检测方法由菌类中β-葡聚糖 的红外光谱定性方法和菌类葡聚糖的高效液相色谱定量方法组成，其中，所述红外光谱 定性方法包括如下步骤：1)将所述菌类样品与KBr按照1:10-50的质量比例混合研磨至均 匀，置于样品杯中，压成透明薄片；2)以仪器内置背景为参比，扫描波长范围4000-450(3!!^， 扫描累积次数16-32次，分辨率4CHT 1，得到所述样品的红外光谱;所述定量方法包括如下步 骤a)准确称取0.4g样品至20ml的带螺帽的试管中，加入6.0ml的盐酸（37%)，拧紧螺帽并 震荡，得到均一的悬浮液;b)将试管放入30 °C水浴45min，每15min震荡混合1次，将悬浮物转 移到200ml杜氏瓶中，用100-120ml的水分几次洗涤试管，洗涤液并入杜氏瓶中；c)将杜氏瓶 放入高压灭菌锅，121°C，60min，取出冷却后，用氢氧化钠溶液将溶液pH调至6-7，最后定容 到250ml，过滤，取续滤液作为供试品溶液;d)取供试品溶液5-20ul，注入液相色谱仪，仪器 条件:高效液相色谱仪Agilentl260,蒸发光散射检测器Agilent 1260 Infinity ELSD，色 谱柱6.5mmX300mm waters sugar pak_l，柱温70_90°C，流动相为 100%水，流速为0.5-lml/min，蒸发光散射检测器检测条件Evaporator Temp:70_90°C，Nebulizer Temp:70-90 °C，Gas Flow Rate:0.8-1.0SLM，得到所述样品的高效液相色谱。
[0010]申请人采用了红外光谱定性测定方法和高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)定量联合方式进行了姬松茸的检测。
[0011] 首先建立IR红外光谱法分析测定姬松茸产品中β-葡聚糖的定性方法，首先选定了 葡聚糖的标准品（SIGMA)适量和含有已知辅料配比的样品适量，将菌类样品与KBr以质量 比1:10-50分别配制一系列样品，置于样品杯中，使用压片机压成透明薄片；以仪器SHIMADZ 岛津红外光谱仪（配有光纤探头测样附件）中的内置背景为参比，扫描波长范围4000-450〇1^，扫描累积次数16-32次，分辨率4CHT 1，得到所述样品的红外光谱。
[0012] 结果发现：
[0013]含有β-葡聚糖标准品的试样在750-lOOOcnf1，分辨率为4CHT 1，波长范围中有特征 吸收峰，即标准品也在选定波长中所出现的特定吸收峰，且在指纹区SSgtlOcnf1的位置有 较强的特征吸收峰。
[0014] 因此本发明提供了一种方法，所述方法中包含有判断该菌类样品中含有β-葡聚糖 的标准为：
[0015] 1、观察在750-1000cm-S分辨率为4cm-S波长范围中有特征吸收峰。
[0016] 2、观察指纹区指纹区889±10cnf1的位置是有较强的特征吸收峰。
[0017]满足以上特征才能判定样本中含有β-葡聚糖。
[0018] 即，本发明提供了一种菌类中β-葡聚糖的检测方法，所述检测方法由菌类中β-葡 聚糖的红外光谱定性方法和菌类葡聚糖的高效液相色谱定量方法组成，该红外光谱定性 方法包括：
[0019] 1)将所述菌类样品与KBr按照1:10-50的质量比例混合研磨至均勾，置于样品杯 中，压成透明薄片；
[0020] 2)以仪器内置背景为参比，扫描波长范围4000-450(3!!^，扫描累积次数16-32次，分 辨率4CHT 1，得到所述样品的红外光谱；
[0021] 3)判断该菌类样品中是否含有β-葡聚糖;其中，判断该菌类样品中是否含有β-葡 聚糖的标准为:Α、在750-lOOOcnf 1，分辨率为4CHT1，波长范围中有特征吸收峰;Β、指纹区889 ±10〇!^的位置有特征吸收峰;满足以上A和B特征即判断为该菌类样品中含有β-葡聚糖； [0022]所述定量方法包括：
[0023] a)准确称取0.4g样品至20ml的带螺帽的试管中，加入6.0ml的37%的盐酸（质量百 分比），拧紧螺帽并震荡，得到均一的悬浮液；
[0024] b)将试管放入30°C水浴45min，每15min震荡混合1次，将悬浮物转移到200ml杜氏 瓶中，用100-120ml的水分几次洗涤试管，洗涤液并入杜氏瓶中；
[0025] c)将杜氏瓶放入高压灭菌锅，121°C，60min，取出冷却后，用氢氧化钠溶液将溶液 pH调至6-7，最后定容到250ml，过滤，取滤液作为供试品溶液；
[0026] d )取供试品溶液5 - 2 0 μ 1，注入液相色谱仪，仪器条件：高效液相色谱仪 Agilentl260,蒸发光散射检测器Agilent 1260 Infinity ELSD，色谱柱6.5mmX300mm waters sugar pak-1，柱温70-90°C，流动相为100%水，流速为0.5-lml/min，蒸发光散射检 测器检测条件Evaporator Temp:7〇-9CTC，Nebulize;r Temp:7〇-9CTC，Gas Flow Rate:0