基于流式细胞检测技术的破囊壶菌快速测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于流式细胞检测技术的破囊壶菌快速测定方法，包括如下步骤：(1)取样和样品前处理：将样品用除菌液稀释或固定，待测样品用吖啶黄溶液避光染色；同时，配制荧光微球悬液作为内参；(2)流式细胞检测：使用配备488nm激光器的流式细胞仪测试样品；(3)内参荧光微球计数：用纯水稀释荧光微球悬液，涡旋振荡混匀后过滤到黑色聚碳酸酯膜上，制作玻片，用荧光显微镜对内参荧光微球进行绝对计数；(4)破囊壶菌丰度计算：使用FlowJo或CellQuest软件分析流式数据，主要包括破囊壶菌的圈门和计数。本发明的方法具有较高的自动化和流程化程度，可以减少人为操作带来的误差，因而拥有更好的精密度和稳定性。
【专利说明】
基于流式细胞检测技术的破囊壶菌快速测定方法
技术领域
[0001] 本发明属于海洋生物资源的开发利用及产业化技术领域和海洋环境要素监测技 术领域，特别涉及对一类重要海洋微生物(破囊壶菌)在天然或人工环境中的快速定量检测 技术。
【背景技术】
[0002] 破囊壶菌(Thraustochytrids)是一类单细胞异养的类真菌原生生物。其最主要的 细胞特征是具有外质网，并且细胞壁含有蛋白质和硫酸酯化的多聚糖，细胞尺寸约为2_20μ m。这是一类重要的海洋微生物，它们广泛分布于海洋及河口栖息地，对于海域生态存在显 著的调节作用。此外，破囊壶菌还是多不饱和脂肪酸、多糖、类胡萝卜素以及多种胞外水解酶 等活性物质的重要来源，可作为此类物质工业化生产的天然来源。总之，有关破囊壶菌的研 究具有非常重要的科学意义和潜在的商业价值。而涉及破囊壶菌的研究，无论是旨在探索 破囊壶菌生态功能的海洋调查活动和基础研究，还是旨在开发利用破囊壶菌生物资源的研 发活动和应用型研究，都需要快速、准确地测定天然或人工环境中破囊壶菌的丰度。
[0003]传统上对破囊壶菌丰度的测定通常使用最大可能计数法或吖啶黄染色-荧光显微 镜直接观察法。前者是基于选择性培养基平板培养的方法，观测周期较长，并且只能估计可 培养破囊壶菌的丰度，但是海水中绝大部分微生物在人工条件下都是不可培养的，因此这 种方法会严重低估海洋中破囊壶菌的实际丰度。后者是基于吖啶黄对破囊壶菌特异性染色 的原理提出的。破囊壶菌经吖啶黄染色后，在蓝紫光的激发下，其含有硫化多糖的细胞壁会 发射红光，细胞质则会发射黄绿光，结合已知的破囊壶菌形态特点，通过显微镜观察可以判 断破囊壶菌的存在并加以计数。吖啶黄对破囊壶菌的染色具有很强的特异性。经吖啶黄染 色后，在蓝紫光的激发下，光合微生物会发射很强的红色荧光，其它的异养真核微生物则会 发射较强的绿色焚光，只有破囊壶菌会同时发射较强的黄绿光和红光。相比于最大可能计 数法，吖啶黄染色-荧光显微镜直接观察法可以更加准确地定量环境中可培养及不可培养 的全部破囊壶菌的实际丰度，还可以用于测定人工培养条件(如高密度发酵)下的破囊壶菌 细胞丰度，为发酵试验提供关键的基础信息，但该方法费时费力，效率很低，且严重依赖操 作者的主观判断，稳定性欠佳。特别是海水样品成分复杂，存在各种各样的杂质干扰，而且 环境中的破囊壶菌本身也存在一定的多样性，容易造成误判，要求观察者十分熟悉不同种 属的破囊壶菌的形态特点。人工培养样品也存在培养基和代谢产物等杂质的干扰。而开展 涉及破囊壶菌的大规模海洋生态调查活动或大规模培养发酵试验时，往往需要在短时间内 分析大批成分复杂的样品，这种方法便在时间、人力和稳定性方面表现出明显的局限性，甚 至难以胜任。
[0004]流式细胞检测技术可以快速获取液体样品中成千上万个独立细胞的多元参数信 息。它的基本原理是当液流以高达每秒几千个颗粒的速度通过一个或多个光柱时，单个颗 粒会被特定波长的激光所激发，其发射的荧光信号和散射光信号则被多通道的检测器实时 记录和解析。常见的流式细胞仪的检测通道主要包括前向散射(Forward Scatter，FSC)信 号通道、侧向散射(Side Scatter，SSC)信号通道和多波段荧光(Fluorescence，FL)信号通 道等。其中前向散射信号主要反映颗粒的大小;侧向散射信号主要反映颗粒的粒度，即颗粒 内部结构的复杂程度;多波段荧光主要包括绿色荧光、黄色荧光、红色荧光等，如本发明所 使用的仪器型号FACS Cailibur中，FLl代表绿色荧光，FL2代表黄色荧光，FL3代表红色荧 光，有的仪器配备更丰富的荧光信号通道。
[0005] 目前，流式细胞检测技术已经应用于水生微生物学领域的研究，包括微生物群落 水平和单细胞水平的分析。同时，对微生物的快速检测和计数已经成为海洋生物学家的重 要目标之一。作为微型浮游细胞计数的有力工具，流式细胞检测技术已经成功应用于海洋 样品中浮游植物、浮游细菌和原生生物的测定。借助流式细胞仪，异养微型原生生物也被成 功检测和计数。但是利用流式细胞仪测定破囊壶菌的尝试未见报道。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于流式细胞检测技术的破囊 壶菌快速测定方法，克服现有技术中破囊壶菌测定准确性差、效率低下的问题。
[0007] 本发明采用的技术方案是:本发明的基于流式细胞检测技术的破囊壶菌快速测定 方法，包括如下步骤：
[0008] (1)取样和样品前处理
[0009] 将样品用除菌液稀释或固定，待测样品用吖啶黄溶液避光染色；同时，配制荧光微 球悬液作为内参;具体操作如下:对于人工培养样品，取适量摇匀的菌液，用除菌的TE缓冲 液稀释500-1000倍，使样品满足流式细胞检测的要求。对于天然海水样品，由于破囊壶菌丰 度较低，不需要稀释。但天然海水样品通常无法在采样当天立即完成检测，因此可用除菌的 戊二醛固定现场采集的水样，经液氮速冻后超低温贮存直至检测，检测前将水样室温融化 即可。待测样品用最终反应浓度约为0.2-0.4μg/ml的吖啶黄溶液避光染色30min以上。对于 人工培养样品，以除菌的TE缓冲液作为空白对照;对于天然海水样品，用除菌的天然海水作 为空白对照。空白对照用同样的方法染色分析。同时，配制适当浓度的荧光微球(Beads)悬 液作为内参，2-8 °C避光保存。
[0010] ⑵流式细胞检测
[0011]使用配备488nm激光器的流式细胞仪测试样品。吸取固定体积的荧光微球悬液，加 到经吖啶黄染色的待测样品中，涡旋振荡混匀后上样。每个样品以快速进样模式运行3-5min〇
[0012] ⑶内参荧光微球计数
[0013] 用纯水以适当的比例稀释荧光微球悬液，涡旋振荡混匀后过滤到黑色聚碳酸酯膜 上，制作玻片，用荧光显微镜对内参荧光微球进行绝对计数。
[0014] (4)破囊壶菌丰度计算
[0015]使用FlowJo或Cel IQuest等软件分析流式数据，主要包括破囊壶菌的圈门和计数。 对于人工培养样品，可以直接在FLl-SSC(绿色荧光信号-侧向散射信号，下同）图或FL3-FL1 图（红色荧光信号-侧向散射信号，下同）中圈出各自集聚的内参荧光微球(Beads)和破囊壶 菌(Thraustochytrids)，分别统计两个门内的颗粒数(图1、图2)，然后结合内参荧光微球的 显微镜计数结果和菌液稀释倍数等，计算出每个样品中破囊壶菌的表观丰度，再减去空白， 即得破囊壶菌在菌液中的实际丰度。对于天然海水中的破囊壶菌，在综合考察和参考人工 培养的破囊壶菌的流式信号特点的基础上，按照以下步骤圈门（图3):第一步，在FL3-FSC (红色荧光信号-前向散射信号，下同）图中，根据较高的叶绿素荧光信号，圈出光合真核微 生物(Phototrophs);第二步，在FLl-SSC图中，根据较高的侧向散射信号和较低的绿色荧光 信号，圈出碎肩颗粒(Detritus);第三步，在FL3-FL1图中，圈出内参荧光微球(Beads);第四 步，在移除光合真核微生物和碎肩颗粒后的FLl-FSC(绿色荧光信号-前向散射信号）图中， 根据内参荧光微球及参考菌株的FSC信号范围，圈出大于2μπι的异养原生生物 (Heterotrophs);第五步，在第四步所圈出的大于2μηι的异养原生生物的基础上，参考可培 养破囊壶菌在FL3-FL1图中的荧光信号特点，将海水样品中的破囊壶菌与其它异养微型浮 游原生生物相区分，圈出破囊壶菌(Thraustochytrids )。根据圈门的位置，分别统计每个样 品(包括空白样）内参荧光微球和破囊壶菌门内的数量。结合内参荧光微球的显微镜计数结 果和样品稀释倍数等，计算出每个样品中破囊壶菌的表观丰度，再减去空白，即得破囊壶菌 的实际丰度。
[0016] 本发明的有益效果是：
[0017] ⑴方法验证
[0018]用流式细胞仪对所圈门内的细胞进行分选，然后过滤到黑色聚碳酸纤维酯膜上， 在荧光显微镜下观察分选得到的细胞形态（图4)。经判断，分选得到的细胞确实是破囊壶 菌，从而验证了圈门的可靠性。分别运用本发明所介绍的方法和传统的吖啶黄染色-荧光显 微镜直接观察法对比分析同批样品，结果显示两者具有较好的可比性（图5)。
[0019] ⑵效果评价
[0020] 本发明所介绍的方法与传统的吖啶黄染色-荧光显微镜直接观察法相比较，具有 较高的自动化和流程化程度，可以减少人为操作带来的误差，因而拥有更好的精密度和稳 定性。此外，本发明的推广应用将大大提高天然和人工环境中破囊壶菌丰度的检测效率，节 省相关研究和研发活动的时间、人力和经济成本，有利于促进破囊壶菌生态功能、生理生化 及其生物资源开发利用等方面的研究及相关成果的转化，并使涉及破囊壶菌的大规模海洋 生态调查和常规监测成为可能。
[0021 ]本发明在吖啶黄对破囊壶菌特异性染色的原理基础上，结合流式细胞仪的技术特 点，开发了一套基于流式细胞检测技术的破囊壶菌快速测定方法，实现对天然海水或人工 培养环境中破囊壶菌的快速检测和计数，从而大大提高相关研究和研发活动的效率。
【附图说明】
[0022]图1为5株人工培养的破囊壶菌及其等体积混合样品的流式细胞检测图像：其中 SW7(Aurantiochytrium limacinum)、Mn16(Thraustochytriidae sp.)、Mn4 (Schizochytrium limacinum)、SW8(Thraustochytriidae sp·)、MnlI(Aurantiochytrium sp.)为5株不同属的破囊壶菌菌株的纯培养样品，Mix是以上5株破囊壶菌纯培养样品的等 体积混合样品；
[0023]图2为不同培养时期的混合培养样品的流式细胞检测图像：其中Mix-12h、Mix_ 24h、Mix-72h分别为5株破囊壶菌混合培养12小时、24小时和72小时取样的样品，MIX为以上 不同培养时期取样样品的等体积混合样品；
[0024] 图3为天然海水样品的破囊壶菌圈门步骤；
[0025] 图4为流式细胞仪分选得到的破囊壶菌细胞在荧光显微镜下的照片；
[0026]图5为流式细胞检测法与荧光显微镜直接观察法对破囊壶菌计数结果的比较。
【具体实施方式】
[0027]下面结合附图对本发明进行详细描述。
[0028] 1.人工培养样品中的破囊壶菌的快速测定
[0029] 本发明为破囊壶菌高密度发酵试验及生产过程中的破囊壶菌数量实时监测提供 了关键的技术支持。
[0030] 以下为利用本发明快速测定高密度发酵(人工培养环境）中的破囊壶菌数量的最 佳实施步骤。
[0031] (1)取样和前处理
[0032] 取适当体积摇匀的菌液，用经0.22μπι过滤的TE缓冲液稀释1000倍，取Iml加到无菌 的流式上样管中，加入1〇μ1经0.22μπι过滤的吖啶黄溶液(0.02mg/ml)，短暂涡旋混匀后，在 室温下避光染色30min。同时，以经0.22μπι过滤的TE缓冲液为空白样，按照同样的方法染色。 [0033] 配制荧光微球悬液(Molecular Probes?)作为内参，避光保存。
[0034] (2)流式细胞检测
[0035] 使用配备488nm激光器的FACS Calibur流式细胞仪(BD-Bioscience)检测样品，通 过CellQuest软件实时获取和记录检测数据。仪器有关参数设置如下(不同仪器可能需要微 调）：
[0037] 仪器稳定后，吸取20μ1涡旋混匀的荧光微球悬液，加到经吖啶黄染色的待测样品 中，涡旋混匀后上样。每个样品以快速进样模式运行3min。
[0038] (3)内参荧光微球计数
[0039] 取20μ1涡旋混匀的荧光微球悬液，加到Iml纯水中，涡旋混匀后过滤到黑色聚碳酸 酯膜(Isopore?)上，制作玻片，用荧光显微镜对内参荧光微球进行绝对计数。
[0040] (4)破囊壶菌丰度计算
[00411利用Flowjo软件分析流式数据，在FLl-SSC图或FL3-FL1图中圈出内参荧光微球 (Beads)和破囊壶菌(Thraustochytrids)，分别统计两个门内的颗粒数（图1、图2)。然后结 合内参荧光微球的显微镜计数结果和菌液稀释倍数等，计算出每个样品中破囊壶菌的表观 丰度，再减去空白，即得破囊壶菌在菌液中的实际丰度。
[0042] 2.天然海水样品中的破囊壶菌的快速测定
[0043]本发明为涉及破囊壶菌的大规模海洋生态调查提供了关键的技术支持。为研究破 囊壶菌在中国近海的时空分布特点及其与环境的关系，进而了解破囊壶菌在近海生态系统 中的功能，发明人所在的课题组在建立基于流式细胞检测技术的高效、准确的破囊壶菌丰 度测定方法的基础之上，分别于2014年3月、5月、7月、10月在深圳湾、珠江口南部和大亚湾 水域固定站位采集水样;于2014年4月、5月、6月、7月、8月、9月、11月以及2015年4月、7月在 秦皇岛邻近海域固定站位采样;于2014年7月、10月在秦皇岛、唐山沿岸海水养殖区固定站 位采样。共采集3000多份海水样品。采样现场测定温度、盐度、pH、溶解氧等多项水质指标， 用戊二醛固定并超低温冻存水样以便后续通过流式细胞仪测定破囊壶菌和细菌的丰度，上 岸后立即分析营养盐、叶绿素、COD等多项环境因子。获得有关数据后综合分析破囊壶菌的 丰度、多样性及其与环境因素之间的关系，发现有的海域破囊壶菌的生物量可超过细菌，表 明破囊壶菌对海洋有机碳库具有显著贡献，同时破囊壶菌的丰度主要受细菌丰度和COD含 量的影响，暗示破囊壶菌可能与细菌协同降解COD，与2011年Raghukumar等提出的破囊壶菌 采用"left-over scavenger"生存策略的假设相符。相关结果已撰写成文，准备发表。此研 究将促进人们对近海破囊壶菌生态功能和海洋微生物营养循环的理解。值得一提的是，测 定如此大规模样品的破囊壶菌丰度，离不开本发明所介绍的方法;若以传统的荧光显微镜 直接观察法来测定，其工作量之巨是难以想象的，人力、时间和经济成本也是难以负担的。
[0044]以下为利用本发明快速测定天然海水中破囊壶菌的最佳实施步骤。
[0045] (1)环境样品采集：
[0046] 现场采集4ml海水于无菌的冻存管中，并用经0.22μπι过滤除菌的戊二醛(终浓度为 2%)固定，4°C培育3h后置于液氮中快速冷冻，然后在-80°C下贮存直至分析。
[0047] (2)参考菌株培养：
[0048] 检测天然海水中的破囊壶菌需要以不同种属、不同培养时期的破囊壶菌样品的散 射光及荧光信号特征作为圈门的重要参考依据。因此，首次分析环境样品前需培养若干参 考菌株，并在不同时期取样分析，综合考察其信号特征。
[0049] 本发明挑选从中国近海分离得到的5株不同属的破囊壶菌菌株作为参考菌株，在 添加0.075 %链霉素和0.05 %氨苄西林的M4培养基（2 %葡萄糖、0.025 %磷酸二氢钾、 0.15 %蛋白胨、0.1 %酵母提取粉、pH=7)中以30 °C、150rpm条件摇床培养。
[0050] (3)样品前处理：
[00511取2 m 1样品至无菌的流式上样管，加入2 0 μ 1经0.2 2 μ m过滤除菌的吖啶黄溶液 (0.02mg/ml)，短暂涡旋混匀后，在室温下避光染色30min。同时，以经高温高压灭菌及0.22μ m过滤的海水为空白样，按照同样的方法染色。首次检测还需用经高温高压灭菌及0.22μπι过 滤的海水对不同种属、不同培养时期的破囊壶菌菌液进行稀释和等比例混合，并按上述方 法染色，为后续辅助圈门提供参考。
[0052] 配制荧光微球悬液(Molecular Probes?)作为内参，避光保存。
[0053] (4)流式细胞检测：
[0054]使用的仪器、软件及有关参数与"人工培养样品中的破囊壶菌的快速测定方法"相 同。仪器稳定后，吸取40μ1涡旋混匀的荧光微球悬液，加到经吖啶黄染色的待测样品中，涡 旋混匀后上样。每个样品以快速进样模式运行5min。
[0055] (5)内参荧光微球计数：
[0056] 取20μ1涡旋混匀的荧光微球悬液，加到Iml纯水中，涡旋混匀后过滤到黑色聚碳酸 酯膜(Isopore?)上，制作玻片，用荧光显微镜对内参荧光微球进行绝对计数。
[0057] (6)破囊壶菌丰度计算：
[0058]使用Flowjo软件分析流式数据，主要包括破囊壶菌的圈门和计数。天然海水中的 破囊壶菌按照以下步骤圈门（图3):第一步，在FL3-FSC(红色荧光信号-前向散射信号）图 中，根据较高的叶绿素荧光信号，圈出光合真核微生物(Phototrophs);第二步，在FLl-SSC (绿色荧光信号-侧向散射信号）图中，根据较高的侧向散射信号和较低的绿色荧光信号，圈 出碎肩颗粒(Detritus);第三步，在FL3-FL1(红色荧光信号-绿色荧光信号）图中，圈出内参 荧光微球(Beads);第四步，在移除光合真核微生物和碎肩颗粒后的FLl-FSC(绿色荧光信 号-前向散射信号）图中，根据内参荧光微球及参考菌株的FSC信号范围，圈出大于2μπι的异 养原生生物(Heterotrophs);第五步，在第四步已圈出的大于2μηι的异养原生生物的基础 上，参考可培养破囊壶菌在FL3-FL1 (红色荧光信号-绿色荧光信号）图中的荧光信号特点， 将海水样品中的破囊壶菌与其它异养微型浮游原生生物相区分，圈出破囊壶菌 (Thraustochytrids)。根据圈门的位置，分别统计每个样品（包括空白样）内参荧光微球和 破囊壶菌门内的数量。结合内参荧光微球的显微镜计数结果和样品稀释倍数等，计算出每 个样品中破囊壶菌的表观丰度，再减去空白，即得破囊壶菌的实际丰度。
[0059]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种基于流式细胞检测技术的破囊壶菌快速测定方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 取样和样品前处理： 将样品用除菌液稀释或固定，待测样品用吖啶黄溶液避光染色；同时，配制荧光微球悬 液作为内参； (2) 流式细胞检测： 使用配备488nm激光器的流式细胞仪测试样品； (3) 内参荧光微球计数： 用纯水稀释荧光微球悬液，涡旋振荡混匀后过滤到黑色聚碳酸酯膜上，制作玻片，用荧 光显微镜对内参荧光微球进行绝对计数； (4) 破囊壶菌丰度计算： 使用FlowJo或Cel IQuest软件分析流式数据，主要包括破囊壶菌的圈门和计数。2. 根据权利要求1所述基于流式细胞检测技术的破囊壶菌快速测定方法，其特征在于， 所述步骤（1)中吖啶黄在样品染色体系中的适宜浓度约为〇. 2-0.4μg/ml，染色时间为30min 以上。3. 根据权利要求1所述基于流式细胞检测技术的破囊壶菌快速测定方法，其特征在于， 所述步骤(2)测试样品方法为:吸取固定体积的荧光微球悬液，加到经吖啶黄染色的待测样 品中，涡旋振荡混匀后上样，每个样品以快速进样模式运行3_5min。4. 根据权利要求1所述基于流式细胞检测技术的破囊壶菌快速测定方法，其特征在于， 所述步骤(4)破囊壶菌丰度计算，当样品为人工培养样品，直接在FLl-SSC(绿色荧光信号-侦响散射信号）图或FL3-FL1(红色荧光信号-绿色荧光信号）图中圈出各自集聚的内参荧光 微球和破囊壶菌，分别统计两个门内的颗粒数，然后结合内参荧光微球的显微镜计数结果 和菌液稀释倍数，计算出每个样品中破囊壶菌的表观丰度，再减去空白，即得破囊壶菌在菌 液中的实际丰度。5. 根据权利要求1所述基于流式细胞检测技术的破囊壶菌快速测定方法，其特征在于， 所述步骤(4)破囊壶菌丰度计算，当样品为天然海水，在综合考察和参考人工培养的破囊壶 菌的流式信号特点的基础上，按照以下步骤圈门： 第一步，在FL3-FSC图中，根据较高的叶绿素荧光信号，圈出光合真核微生物； 第二步，在FLI-SSC图中，根据较高的侧向散射信号和较低的绿色荧光信号，圈出碎肩 颗粒； 第三步，在FL3-FL1图中，圈出内参荧光微球； 第四步，在移除光合真核微生物和碎肩颗粒后的FLl-FSC图中，根据内参荧光微球及参 考菌株的FSC信号范围，圈出大于2μπι的异养原生生物； 第五步，在第四步已圈出的大于2μπι的异养原生生物的基础上，参考可培养破囊壶菌在 FL3-FL1图中的荧光信号特点，将海水样品中的破囊壶菌与其它异养微型浮游原生生物相 区分，圈出破囊壶菌。6. 根据权利要求5所述基于流式细胞检测技术的破囊壶菌快速测定方法，其特征在于， 根据圈门的位置，分别统计每个样品内参荧光微球和破囊壶菌门内的数量;结合内参荧光 微球的显微镜计数结果和样品稀释倍数，计算出每个样品中破囊壶菌的表观丰度，再减去 空白，即得破囊壶菌的实际丰度。
【文档编号】G01N15/14GK105891091SQ201610409690
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】谢宁栋, 段瑛博, 马文猛, 陈子熙, 汪光义
【申请人】天津大学