应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法
【专利摘要】应用线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，本发明涉及一种农药滴丁酯的检测方法，它为了解决现有农药滴丁酯的检测方法的检出限较低的问题。鉴定方法：一、配置培养液；二、加入待测液体；三、再接入秀丽隐杆线虫进行培养；四、配置浸泡液；五、冻融后的线虫置于浸泡液中；六、配置反应试剂；七、反应试剂中加入Hsp12.2蛋白抗体和线虫，孵育处理；八、加入荧光标记的二抗染色；九、进行荧光强度检测，完成滴丁酯的检测。本发明通过线虫Hsp12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯，可检测出浓度为0.002％的滴丁酯，实现了对可疑农药的高效检测。
【专利说明】
应用线虫HsP12.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种农药滴丁酯的检测方法。
【背景技术】
[0002]滴丁酯是一种在我国广泛应用的除草剂，主要防除水稻等禾本科作物田中双子叶杂草，莎草及某些恶性杂草。现有农药常用检测方法包括高效液相色谱法、色谱-质谱联用法、化学分析法等。应用分子生物学方法进行化学品的靶位标识，可提高待测物质的检出限与精确度。线虫对滴丁酯农药反映敏感，应激蛋白Hspl2.2受滴丁酯诱导表达显著。荧光免疫定位化学法(Immunostaining)可选择相应抗体，使用焚光标识，根据焚光表达量换算出蛋白表达量。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是要解决现有农药滴丁酯的检测方法的检出限较低的问题，而提供应用线虫Hspl2.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法。
[0004]本发明应用线虫Hspl2.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法按下列步骤实现:
[0005]一、将0.3g KH2P04、0.6g Na2HPO4和0.4?0.6g NaCl溶于10mL去离子水中，得到培养液；
[0006]二、将步骤一得到的1mL培养液置于培养皿中，然后加入待测液体，得到待测培养液体；
[0007]三、向待测培养液体中接入100?120条秀丽隐杆线虫进行培养，得到接有秀丽隐杆线虫的待测培养液；
[0008]四、将0.88恥(:1、0.028KCU0.18gNa2HP04.2出0和0.0lgKH2PO4混合，用蒸馏水定容至10mL，调节体系的pH=7.0?7.5，再加入1g牛血清蛋白，得到浸泡液；
[0009]五、取出步骤三中的秀丽隐杆线虫置于液氮中反复冻融多次，然后放入步骤四的浸泡液中，得到浸泡处理的秀丽隐杆线虫；
[0010]六、将2.48的1'1^-1^186、8.88的他(]1和0.51111^的1￥6611 20混合，然后用去离子水定容至I OOOmL，得到反应试剂；
[0011]七、将0.1g Hspl2.2蛋白抗体加入5mL步骤六的反应试剂中，然后加入浸泡处理的秀丽隐杆线虫，在摇床上摇动孵育处理，得到孵育处理的秀丽隐杆线虫；
[0012]八、通过浸泡液清洗孵育处理的秀丽隐杆线虫，然后加入0.1g荧光标记的二抗染色处理，得到染色后的秀丽隐杆线虫；
[0013]九、在荧光显微镜下进行荧光强度检测，通过显微分析量化Hspl2.2蛋白表达量，检测待测液体中是否含有农药滴丁酯。
[0014]本发明通过线虫Hspl2.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯，弥补了常规化学分析中检出限较低的不足，本发明对目标检测物特异性高，可检测出浓度为0.002%的滴丁酯，实现了对可疑农药的高效检测。
【附图说明】
[0015]图1为实施例不同滴丁酯浓度诱导下线虫Hspl2.2蛋白表达相对量的柱状图。
【具体实施方式】
[0016]【具体实施方式】一:本实施方式应用线虫Hspl2.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法按下列步骤实施:
[0017]一、将0.3g KH2P04、0.6g Na2HPO4和0.4?0.6g NaCl溶于10mL去离子水中，得到培养液；
[0018]二、将步骤一得到的1mL培养液置于培养皿中，然后加入待测液体，得到待测培养液体；
[0019]三、向待测培养液体中接入100?120条秀丽隐杆线虫进行培养，得到接有秀丽隐杆线虫的待测培养液；
[0020]四、将0.88恥(:1、0.028KCU0.18gNa2HP04.2H20和0.0lgKH2PO4混合，用蒸馏水定容至10mL，调节体系的pH=7.0?7.5，再加入1g牛血清蛋白，得到浸泡液；
[0021]五、取出步骤三中的秀丽隐杆线虫置于液氮中反复冻融多次，然后放入步骤四的浸泡液中，得到浸泡处理的秀丽隐杆线虫；
[0022]六、将2.48的1'1^3-1^186、8.88的他(]1和0.51111^的1￥6611 20混合，然后用去离子水定容至I OOOmL，得到反应试剂；
[0023]七、将0.1g Hspl2.2蛋白抗体加入5mL步骤六的反应试剂中，然后加入浸泡处理的秀丽隐杆线虫，在摇床上摇动孵育处理，得到孵育处理的秀丽隐杆线虫；
[0024]八、通过浸泡液清洗孵育处理的秀丽隐杆线虫，然后加入0.1g荧光标记的二抗染色处理，得到染色后的秀丽隐杆线虫；
[0025]九、在荧光显微镜下进行荧光强度检测，通过显微分析量化Hspl2.2蛋白表达量，检测待测液体中是否含有农药滴丁酯。
[0026]本实施方式步骤八是将孵育处理的线虫置于浸泡液中进行清洗。步骤九通过Hspl2.2蛋白表达量来鉴定待测液体是否含有农药滴丁酯，当蛋白表达量高于正常值15%即表明待测液体中含有滴丁酯，其中正常值是指步骤二的待测液体为纯水时的蛋白表达量。
[0027]本实施方式中所使用的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)编号为N2，取自美国线虫遗传中心(Caenorhabditis Genetics Center，CGC)。通过线虫Hspl2.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯特异性高，可检测出浓度为0.002%的滴丁酯，通过荧光免疫定位化学法表征线虫Hspl2.2蛋白表达量可实现食品安全与环境保护要求下农药滴丁酯的尚效检测。
[0028]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是步骤三中所述培养的时间为3.5?4.5h。其它步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0029]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一或二不同的是步骤五放入浸泡液中浸泡I?2小时。其它步骤及参数与【具体实施方式】一或二相同。
[0030]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一至三之一不同的是步骤五取出步骤三中的线虫置于液氮中反复冻融3?5次。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至三之一相同。
[0031]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一至四之一不同的是步骤七在摇床上摇动孵育处理I小时。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至四之一相同。
[0032]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】一至五之一不同的是步骤八通过浸泡液反复清洗孵育处理的线虫3?5次。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至五之一相同。
[0033]【具体实施方式】七:本实施方式与【具体实施方式】一至六之一不同的是步骤八加入
0.1g荧光标记的二抗染色处理I小时。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至六之一相同。
[0034]【具体实施方式】八:本实施方式与【具体实施方式】一至七之一不同的是当步骤二所述的待测液体为纯水时，步骤九通过显微分析得到量化Hspl2.2蛋白表达量设为正常值。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至七之一相同。
[0035]【具体实施方式】九:本实施方式与【具体实施方式】八不同的是步骤九当通过显微分析量化Hspl2.2蛋白表达量高于正常值时，则鉴定结果为待测培养液体中含有农药滴丁酯。其它步骤及参数与【具体实施方式】八相同。
[0036]【具体实施方式】十:本实施方式与【具体实施方式】九不同的是步骤九当通过显微分析量化Hspl2.2蛋白表达量高于正常值15%时，则鉴定结果为待测培养液体中含有农药滴丁酯。其它步骤及参数与【具体实施方式】九相同。
[0037]实施例一:本实施例应用线虫Hspl2.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法按下列步骤实现:
[0038]一、将 0.3g KH2P04、0.6g Na2HPO4 和 0.5g NaCl 溶于 10mL 去离子水中，得到培养液；
[0039]二、将步骤一得到的1mL培养液置于培养皿中，然后加入10yL含0.002%滴丁酯液体，得到待测培养液体；
[0040]三、向待测培养液体中接入100条秀丽隐杆线虫进行培养4h，得到接有秀丽隐杆线虫的待测培养液；
[0041 ]四、将0.88恥(:1、0.028 KCU0.18gNa2HP04.2H20和0.0lgKH2PO4混合，用蒸馏水定容至10mL，调节体系的pH=7.4，再加入1g牛血清蛋白，得到浸泡液；
[0042]五、取出步骤三中的秀丽隐杆线虫置于液氮中反复冻融3次，然后放入步骤四的浸泡液中I小时，得到浸泡处理的秀丽隐杆线虫；
[0043]六、将2.48的1'1^3-1^186、8.88的他(]1和0.51111^的1￥6611 20混合，然后用去离子水定容至I OOOmL，得到反应试剂；
[0044]七、将0.1g Hspl2.2蛋白抗体加入5mL步骤六的反应试剂中，然后加入浸泡处理的秀丽隐杆线虫，在摇床上摇动孵育处理I小时，得到孵育处理的秀丽隐杆线虫；
[0045]八、通过浸泡液反复清洗孵育处理的秀丽隐杆线虫3次，然后加入0.1g荧光标记的二抗染色处理I小时，得到染色后的秀丽隐杆线虫；
[0046]九、在ze i SS焚光显微镜(Axi ο Observer Al)下进行焚光强度检测，利用Ax1Vis1n LE图像软件显微分析系统量化Hspl2.2蛋白表达量，蛋白表达量高于正常值15%，完成农药滴丁酯的鉴定。
[0047]本实施例步骤二所述的含0.002%滴丁酯液体是指质量浓度为0.002%滴丁酯的水溶液。
[0048]实施例二:本实施例与实施例一不同的是步骤二加入10yL含0.01 %滴丁酯液体。
[0049]本实施例步骤九利用Ax1Vis1nLE图像软件显微分析系统量化Hspl2.2蛋白表达量，蛋白表达量高于正常值30 %。
[0050]实施例三:本实施例与实施例一不同的是步骤二加入10yL含0.05%滴丁酯液体。[0051 ]本实施例步骤九利用Ax1Vis1n LE图像软件显微分析系统量化Hspl2.2蛋白表达量，蛋白表达量高于正常值50 %。
[0052]实施例四:本实施例与实施例一不同的是步骤二加入10yL含0.1%滴丁酯液体。
[0053]本实施例步骤九利用Ax1Vis1nLE图像软件显微分析系统量化Hspl2.2蛋白表达量，蛋白表达量高于正常值70 %。
[0054]实施例中所述的正常值是当步骤二中加入10yL纯水，得到的Hspl2.2蛋白表达量。
[0055]实施例一至四不同浓度下滴丁酯诱导下线虫Hspl2.2蛋白表达相对量的柱状图如图1所示，图1显示出通过荧光免疫定位化学法表征线虫Hspl2.2的蛋白表达量，实现了对农药滴丁酯的尚效检测。
【主权项】
1.应用线虫Hspl2.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，其特征在于是按下列步骤实现: 一、将0.3gKH2P04、0.6g Na2HPO4和0.4?0.6g NaCl溶于10mL去离子水中，得到培养液； 二、将步骤一得到的1mL培养液置于培养皿中，然后加入待测液体，得到待测培养液体； 三、向待测培养液体中接入100?120条秀丽隐杆线虫进行培养，得到接有秀丽隐杆线虫的待测培养液； 0J#0.8gNaCl、0.02g KCU0.18gNa2HP04.2H20和0.0lgKH2PO4混合，用蒸馏水定容至10mL，调节体系的pH=7.0?7.5，再加入1g牛血清蛋白，得到浸泡液； 五、取出步骤三中的秀丽隐杆线虫置于液氮中反复冻融多次，然后放入步骤四的浸泡液中，得到浸泡处理的秀丽隐杆线虫； 六、将2.4g的Tris-Base、8.8g的NaCl和0.SmlJtlTween20混合，然后用去离子水定容至100mL，得到反应试剂； 七、将0.1g Hspl2.2蛋白抗体加入5mL步骤六的反应试剂中，然后加入浸泡处理的秀丽隐杆线虫，在摇床上摇动孵育处理，得到孵育处理的秀丽隐杆线虫； 八、通过浸泡液清洗孵育处理的秀丽隐杆线虫，然后加入0.1g荧光标记的二抗染色处理，得到染色后的秀丽隐杆线虫； 九、在荧光显微镜下进行荧光强度检测，通过显微分析量化Hspl2.2蛋白表达量，检测待测液体中是否含有农药滴丁酯。2.根据权利要求1所述的应用线虫Hspl2.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，其特征在于步骤三中所述培养的时间为3.5?4.5h。3.根据权利要求1所述的应用线虫Hspl2.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，其特征在于步骤五放入浸泡液中浸泡I?2小时。4.根据权利要求1所述的应用线虫Hspl2.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，其特征在于步骤五取出步骤三中的线虫置于液氮中反复冻融3?5次。5.根据权利要求1所述的应用线虫Hspl2.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，其特征在于步骤七在摇床上摇动孵育处理I小时。6.根据权利要求1所述的应用线虫Hspl2.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，其特征在于步骤八通过浸泡液反复清洗孵育处理的线虫3?5次。7.根据权利要求1所述的应用线虫Hspl2.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，其特征在于步骤八加入0.1g荧光标记的二抗染色处理I小时。8.根据权利要求1所述的应用线虫Hspl2.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，其特征在于当步骤二所述的待测液体为纯水时，步骤九通过显微分析得到量化Hspl2.2蛋白表达量设为正常值。9.根据权利要求8所述的应用线虫Hspl2.2蛋白表达量作为标识物鉴定农药滴丁酯的方法，其特征在于步骤九当通过显微分析量化Hspl2.2蛋白表达量高于正常值15%时，则鉴定结果为待测培养液体中含有农药滴丁酯。
【文档编号】G01N33/68GK105911290SQ201610236084
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月15日
【发明人】王云彪
【申请人】中国科学院东北地理与农业生态研究所