含糖链的目标物质的检测用试剂、检测方法、及为检测含糖链的目标物质使用的载体以及 ...的制作方法
【专利摘要】本发明涉及对于含特定的糖链的糖蛋白质等的检测有用的目标物质的检测方法、目标物质的检测用试剂、载体及所述载体的制造方法。
【专利说明】
含糖链的目标物质的检测用试剂、检测方法、及为检测含糖链 的目标物质使用的载体以及其制造方法【
技术领域
】
[0001]本发明涉及目标物质的检测用试剂。更具体而言，本发明涉及对于含特定的糖链的糖蛋白质等的检测有用的目标物质的检测方法、目标物质的检测用试剂、载体及所述载体的制造方法。【【背景技术】】
[0002]—般而言，糖链是由糖苷键共价键合的多个单糖构成的化合物。所述糖链，例如， 与蛋白质或脂质结合而形成糖蛋白质或糖脂质。
[0003]作为分析含糖链的目标物质等的方法，提议例如，使用与糖链结合的凝集素分析所述糖链或目标物质的方法(参照例如，专利文献1及2)。
[0004]专利文献1中记载的方法是利用显示与糖链相互作用的蛋白质和糖链或复合糖质上的糖链的相互作用解析糖链结构的方法。在专利文献1中记载的方法中，使用作为显示与所述糖链相互作用的蛋白质的凝集素经具有环氧基作为活性基的化合物而固定化到基板的阵列。
[0005]另外，专利文献2中记载的方法是使用作为与作为糖蛋白质的Mac-2结合蛋白质 (Mac-2-binding protein;以下也称为“M2BP”)的糖链结合的凝集素的多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(Wisteria floribunda Agglutinin)(以下也称为 “WFA”)等测定 M2BP的方法。在专利文献2中记载的方法中，作为所述凝集素，使用生物素结合到所述凝集素的生物素化凝集素经链霉亲和素固定化的磁性粒子、固定化了所述凝集素的阵列等。
[0006]在这些专利文献1及2中记载的方法中，为了使凝集素的活性充分地表达而检测糖链，在保持天然的凝集素的亚基结构的状态下将所述凝集素固定化到固相。
[0007]【现有技术文献】
[0008]【专利文献】
[0009]专利文献1:美国专利申请公开第2007/202535号说明书 [〇〇1〇] 专利文献2:美国专利申请公开第2012/172247号说明书
[0011]【发明概述】
[0012]【发明要解决的技术课题】
[0013]但是，凝集素在与糖链的反应时，有必要维持立体结构，但在溶液中经长期间稳定地维持立体结构是困难的，从而难以确保充分的反应性。
[0014]本发明鉴于所述以往技术实情而进行，旨在提供有对目标物质的高的反应性，而且对于保存稳定性优良的目标物质的检测用试剂、为检测目标物质使用的载体及所述载体的制造方法以及能确保高的灵敏度及高的再现性的目标物质的检测方法。
[0015]【解决课题的技术方案】
[0016]本发明之一侧面是用于检测含与WFA结合的糖链的目标物质的试剂，其包括以含有WFA经二聚体化的二聚体WFA被固定化到固相载体上的二聚体WFA固定化载体作为特征的目标物质的检测用试剂。
[0017]本实施方式涉及的目标物质的检测用试剂由于含有二聚体WFA固定化载体，从而维持向糖链、特别是，在末端有N-乙酰-D-半乳糖胺〔IUPAC名:2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-半乳糖〕残基(以下也称为“GalNAc残基”)的糖链的结合能，且有比含有天然存在的WFA(4聚体 WFA)固定化到固相载体上的载体的试剂高的对所述糖链的反应性，而且保存稳定性优良。 从而，通过在含糖链的目标物质的检测中使用本实施方式涉及的目标物质的检测用试剂， 能得到高的灵敏度及高的再现性。[〇〇18]在本实施方式涉及的目标物质的检测用试剂中，优选二聚体WFA经生物素和生物素结合蛋白质而固定化到固相载体。
[0019]另外，在本实施方式涉及的目标物质的检测用试剂中，优选地二聚体WFA是生物素化二聚体WFA，并且生物素结合蛋白质固定化到固相载体上，生物素化二聚体WFA经生物素结合蛋白质而固定化到固相载体。
[0020]本发明的其他侧面包括含与WFA结合的糖链的目标物质的检测方法，其特征在于包括(A)通过使WFA经二聚体化的二聚体WFA被固定化到固相载体上的二聚体WFA固定化载体、含目标物质的样品、与目标物质特异性地结合的标记物质接触，在固相载体上形成含二聚体WFA、目标物质和标记物质的复合物的工序、及(B)通过测定在工序(A)中得到的复合物中的标记物质，检测目标物质的工序。[0021 ]本实施方式涉及的目标物质的检测方法采用通过使二聚体WFA固定化载体和含目标物质的样品接触，在固相载体上形成含二聚体WFA和目标物质的复合物的操作。由于采用所述操作，由本实施方式涉及的目标物质的检测方法能以高的反应性有效结合二聚体WFA 和目标物质的糖链。从而，由本实施方式涉及的目标物质的检测方法能确保高的灵敏度。另外，在二聚体WFA固定化载体中使用的二聚体WFA在保存稳定性上优良。从而，由本实施方式涉及的目标物质的检测方法能确保高的再现性。
[0022]在本实施方式涉及的目标物质的检测方法中，标记物质优选是与目标物质特异性地结合的标记抗体。
[0023]本发明的还其他侧面是用于检测含与WFA结合的糖链的目标物质的载体，其包括以有WFA经二聚体化的二聚体WFA和固相载体，二聚体WFA被固定化到固相载体上作为特征的载体。
[0024]在本实施方式涉及的载体中，二聚体WFA固定化到固相载体上。因此，本实施方式涉及的载体有比天然存在的WFA (4聚体WFA)固定化到固相载体上的载体高的对所述糖链的反应性，保存稳定性优良。从而，通过在含糖链的目标物质的检测中使用本实施方式涉及的 WFA固定化试剂，能得到高的灵敏度及高的再现性。
[0025]本发明的别的侧面包括用于检测含与WFA结合的糖链的目标物质的载体的制造方法，其以包括(I)使WFA经二聚体化而得到二聚体WFA的工序、及(II)将工序(I)中得到的二聚体WFA被固定化到固相载体而得到二聚体WFA固定化载体的工序作为特征。
[0026]本实施方式涉及的载体的制造方法采用使WFA经二聚体化，将得到的二聚体WFA被固定化到固相载体的操作。由于采用所述操作，由本实施方式涉及的载体的制造方法能得到有比固定化了天然存在的WFA(4聚体WFA)的载体高的对所述糖链的反应性，并且对于保存稳定性优良的WFA固定化载体。
[0027]在本实施方式涉及的载体的制造方法中，在工序(I)中，优选将含有含生物素的交联剂的溶液和WFA混合而调制生物素化二聚体WFA。
[0028]另外，在本实施方式涉及的载体的制造方法中，优选地在工序(II)中，作为固相载体，使用固定化了生物素结合蛋白质的载体，通过使载体中的生物素结合蛋白质和生物素化二聚体WFA结合而将二聚体WFA被固定化到固相载体。
[0029]另外，在本实施方式涉及的载体的制造方法中，在工序(I)中，优选通过使含有交联剂的溶液和WFA接触至〔WFA/交联剂〕的摩尔比成1/10以下(但是不包括0)而得到二聚体 WFA〇
[0030]再者，在本实施方式涉及的载体的制造方法中，交联剂优选为与二聚体WFA中的氨基形成交联的交联剂。所述交联剂优选为具有选自N-羟基琥珀酰亚胺酯基、异硫氰基、氯砜基、氯羰基、氧乙烯基、碳原子数1?4的氯烷基、醛基及羧基的至少1种官能团作为对二聚体 WFA中的氨基的反应基。
[0031]另外，生物素和反应基优选经间隔物结合。[〇〇32]【发明效果】
[0033]由本发明能提供有对目标物质的高的反应性，而且保存稳定性优良的目标物质的检测用试剂、为检测目标物质使用的载体及所述载体的制造方法以及能确保高的灵敏度及高的再现性的目标物质的检测方法。【【附图说明】】[〇〇34]【图1】是显示在试验例1中研究WFA和交联剂的混合比和反应产物的预计分子量的关系的结果的坐标图。[〇〇35]【图2】是显示在试验例2中研究将M2BP作为目标物质使用时的WFA致敏浓度和发光强度的关系的结果的坐标图。[〇〇36]【图3】是显示在试验例3中研究将M2BP作为目标物质使用时的二聚体WFA致敏浓度和发光强度的关系的结果的坐标图。[〇〇37]【图4】是显示在试验例4中研究将M2BP作为目标物质使用时的残留活性的经时变化的结果的坐标图。[〇〇38]【图5】是显示在试验例5中研究将Muc-1作为目标物质使用时的残留活性的经时变化的结果的坐标图。[〇〇39]【图6】是显示在试验例6中研究将Muc-1作为目标物质使用时的残留活性的经时变化的结果的坐标图。
[0040]【图7A】是显示在试验例7中使用胆管癌患者的待测样品1研究二聚体WFA致敏浓度和对Muc-1的相对反应性的关系的结果的坐标图。
[0041]【图7B】是显示在试验例7中使用胆管癌患者的待测样品2研究二聚体WFA致敏浓度和对Muc-1的相对反应性的关系的结果的坐标图。[〇〇42]【图7C】是显示在试验例7中使用胆管癌患者的待测样品3研究二聚体WFA致敏浓度和对Muc-1的相对反应性的关系的结果的坐标图。[〇〇43]【发明详述】[〇〇44](目标物质的检测用试剂)
[0045]本实施方式的目标物质的检测用试剂(以下也称为“本实施方式的试剂”)是用于检测含与多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)结合的糖链的目标物质的试剂，其特征在于含有所述WFA经二聚体化的二聚体WFA被固定化到固相载体上的二聚体WFA固定化载体。
[0046]天然存在的多花紫藤(Wisteriafloribunda)的凝集素是由4个的亚基构成的4聚体的蛋白质。在本说明书中，如无特别说明，将4聚体的多花紫藤(Wi s t er i a f I or i bunda)的凝集素简单表示为“WFA”，或者表示为“4聚体WFA”。另外，在本说明书中，将通过使4聚体WFA经二聚体化而得到的产物表示为“二聚体WFA”。
[0047]WFA (4聚体WFA)与在末端有Ga INAc残基的糖链结合〔参照Pi I Ier等，Eur.J.B1chem.、191、461-466(1990)〕。另夕卜，WFA(4聚体WFA)也与末端有半乳糖(Gal)残基的糖链结合。在本实施方式中，优选为将有GalNAc残基的糖链作为目标物质。本发明人发现，使4聚体WFA经二聚体化而得到的二聚体WFA也有如上所述的糖链结合的活性。另外，本发明人发现，使用使所述二聚体WFA固定化的固相载体的试剂显示比使用固定化4聚体WFA的固相载体的试剂高的反应性。再者，本发明人发现，所述试剂的保存稳定性与使用4聚体WFA的试剂的保存稳定性比显著地高。本发明基于这些见解进行。
[0048]如此，本实施方式的试剂由于含有固定化了二聚体WFA的二聚体WFA固定化载体，有对所述糖链的高的反应性，而且保存稳定性优良。从而，通过在含糖链的目标物质的检测中使用本实施方式的目标物质的检测用试剂，能得到高的灵敏度及高的再现性。
[0049]在本说明书中，含与所述WFA结合的糖链的目标物质是含在末端有GalNAc残基或Gal残基的糖链的物质。作为含与所述WFA结合的糖链的目标物质，例如，可举出Μ2ΒΡ、α1酸性糖蛋白质(AGP)、Muc-l、神经细胞粘接分子LI (LlCAM)、KL-6抗原等的糖蛋白质或糖脂质等，但无特别限定。这些目标物质在含在末端有GalNAc残基或Gal残基的糖链，与WFA结合的方面共同。
[0050]M2BP及AGP被作为肝脏的纤维化或肝脏癌的标志物使用。从而，由本实施方式的试剂的M2BP及AGP的检测结果能成为判断受试者的肝脏的纤维化水平的指标。
[0051 ] Muc-1被作为胆管癌的标志物使用。从而，由本实施方式的试剂的Muc-1的检测结果能成为受试者的胆管有胆管癌与否的指标。
[0052]LlCAM作为胆管癌、大肠癌、乳腺癌、神经系统或间皮性的肿瘤等的肿瘤标志物使用。从而，由本实施方式的试剂的LlCAM的检测结果能成为被检者的胆管、大肠、乳房、神经系统、间皮等有肿瘤与否的指标。
[0053]KL-6抗原作为间质性肺炎的标志物使用。从而，由本实施方式的试剂的KL-6抗原的检测结果能成为判断被检者的肺脏的纤维化水平的指标。
[0054]在本实施方式的试剂中使用的固相载体可为粒子、基板、膜等。作为粒子，例如，使用磁性粒子、聚苯乙烯粒子、乳胶粒子等。作为基板，例如，使用玻璃基板、硅基板、聚苯乙烯制的板等。作为膜，例如，使用硝酸纤维素膜、聚氟化亚乙烯膜等。在作为固相载体使用粒子时，所述粒子优选分散到溶剂中。作为溶剂，例如，可例示纯化水、缓冲液等。在所述的固相载体之中，由于固相载体和反应液的分离及溶剂的取代容易而优选使用磁性粒子。
[0055]在作为固相载体使用所述磁性粒子时，所述磁性粒子的平均粒径由于随本实施方式的二聚体WFA固定化载体的用途等不同而优选根据二聚体WFA固定化载体的用途等适宜确定。所述磁性粒子的平均粒径通常是I?3μηι、优选为1.5?2.5μηι、更优选为1.8?2.2μηι。再者，所述平均粒径是通过使用激光衍射式粒度分布测定装置〔(株)岛津制作所制、商品名:SALD系列〕由光散射法测定求出的值。
[0056]所述二聚体WFA优选经生物素和生物素结合蛋白质而固定化到所述固相载体上。生物素结合蛋白质只要有向生物素的结合性，就不特别限定，可例示亲和素、链霉亲和素、Tamavidin(注册商标)等。
[0057]在使用生物素和生物素结合蛋白质时，优选所述二聚体WFA是生物素化二聚体WFA，并且生物素结合蛋白质固定化到所述固相载体上，所述生物素化二聚体WFA经所述生物素结合蛋白质而固定化到所述固相载体上。此时，固定化到固相载体上的生物素结合蛋白质的量由于随二聚体WFA固定化载体的用途等不同，能根据二聚体WFA固定化载体的用途等适宜确定。
[0058]本实施方式的试剂中的二聚体WFA固定化载体的含量由于随本实施方式的试剂的用途等不同而优选根据本实施方式的试剂的用途适宜确定。本实施方式的试剂中的二聚体WFA固定化载体的含量，从结合可能量的观点来看，优选为0.1质量％以上、更优选为0.48质量％以上，从自动分析机的搅拌效率的观点来看，优选为2质量％以下，更优选为I质量％以下。
[0059]本实施方式的试剂也可含标记物质。标记物质含信号发生物质和目标物质结合部。信号发生物质经目标物质结合部与目标物质结合。
[0060]信号发生物质可为发生信号的物质，也可有使信号发生的物质。作为发生信号的物质，具体而言，可举出荧光染料、放射性同位素等。使信号发生的物质是通过催化化学反应使反应液发生发光、荧光、显色等的信号的物质即可。作为发生信号的物质，具体而言，可例示碱性磷酸酶、过氧化物酶等的酶。在使用所述酶时，使底物与酶反应，从反应产物检测到发生的发光、荧光或显色。
[0061]目标物质结合部只要与目标物质特异性地结合，就不特别限定。作为目标物质结合部，适宜地使用与目标物质特异性地结合的抗体。目标物质结合部可由与目标物质特异性地结合的第一物质(例如，抗体等)和与第一物质结合、并且含信号发生物质的物质(例如，标记抗体等)构成。此时，信号发生物质经2种抗体与目标物质结合。再者，虽也能经3种以上的抗体与目标物质结合，但反应工序变多，有必要考虑导致检测灵敏度的降低等的可能性。作为目标物质结合部使用的抗体，例如，能由Current Protocols in Immunology中记载的方法〔John E.Coligan编、John Wiely&Sons公司(John Wiely&Sons，Inc)、1992年发行〕等中记载的惯用的方法，通过使用含糖链的目标物质的全部或一部分、在所述目标物质和WFA的结合部位免疫动物容易地制作。由标记物质的所述抗体的标记可根据标记物质的种类的方法容易地进行。再者，在本实施方式中，也可代替所述抗体而使用通过在纯化所述抗体后由肽酶等处理而得到的抗体片段。
[0062]所述标记物质优选为与所述目标物质特异性地结合的标记抗体。
[0063]另外，本实施方式的试剂也可适宜含有稳定化剂、pH调整剂、鳌合剂、非特异反应抑制剂、防腐剂等。
[0064]二聚体WFA固定化载体及标记物质也能作为各自不同容器中收容的试剂盒提供。在本说明书中，“试剂”也包括试剂盒。另外，试剂盒也可含别的容器中收容的清洗液。在标记物质有酶时，也可还含对所述酶的底物。
[0065]如以上说明，本实施方式的试剂由于有对在末端有GalNAc残基或Gal残基的糖链的高的反应性，而且保存稳定性优良，通过在含在末端有GalNAc残基或Gal残基的糖链的物质的检测中使用，能得到高的灵敏度及高的再现性。从而，本实施方式的试剂对于含糖链的目标物质、特别是，含在末端有GalNAc残基或Gal残基的糖链的目标物质的检测(定性检测或定量检测)有用。
[0066](二聚体WFA固定化载体及其制造方法)
[0067]本实施方式的二聚体WFA固定化载体是用于检测含与WFA结合的糖链的目标物质的载体，其以有二聚体WFA和固相载体，所述二聚体WFA被固定化到所述固相载体上作为特征。
[0068]如此，本实施方式的二聚体WFA固定化载体由于所述二聚体WFA被固定化到所述固相载体上，从而有对于在末端有GalNAc残基或Gal残基的糖链高的反应性，而且保存稳定性优良。通过在所述含糖链的目标物质的检测中使用本实施方式的二聚体WFA固定化试剂，能得到高的灵敏度及高的再现性。
[0069]本实施方式的二聚体WFA固相载体与所述的本实施方式的试剂中所含的二聚体WFA固定化载体同样。
[0070]接下来，说明本实施方式的载体(量体WFA固相载体)的制造方法(以下也称为“本实施方式的制造方法”)。本实施方式的制造方法是用于检测含与WFA结合的糖链的目标物质的二聚体WFA固定化载体的制造方法，其特征在于包括:
[0071 ] (I)使所述WFA经二聚体化而得到二聚体WFA的工序、及
[0072](II)将所述工序(I)中得到的二聚体WFA固定化到固相载体而得到二聚体WFA固定化载体的工序。
[0073]在本实施方式的制造方法中，首先，使WFA经二聚体化而得到二聚体WFA的〔工序
(I)〕。所述工序(I)通过使4聚体WFA进行二聚体化的方法进行。一般而言，蛋白质的亚基的解离多由与蛋白质中的巯基反应的巯基试剂(SH试剂)进行。但是，在本实施方式中，通过使含生物素的交联剂和4聚体WFA接触，能使4聚体WFA有效二聚体化。
[0074]在所述工序(I)中，在使用含生物素的交联剂时，所述交联剂优选为与所述4聚体WFA中的氨基形成交联的交联剂。作为所述交联剂，具体而言，可例示作为对所述4聚体WFA中的氨基的反应基具有选自N-羟基琥珀酰亚胺酯基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、异硫氰基、氯砜基、氯羰基、氧乙烯基、碳原子数I?4的氯烷基、醛基及羧基的至少I种官能团的交联剂。如果使用所述交联剂，能使4聚体WFA有效二聚体化。
[0075]含所述生物素的交联剂，从使与WFA的反应性、制造时的易处理性及目标物质的检测时的反应性升高的观点来看，优选生物素和所述反应基经间隔物结合。作为涉及的间隔物，例如，可举出氨基已酰基(即、氨基己酰基)等，但不特别限定。
[0076]另外，在所述工序(I)中，在使用所述交联剂时，通过使含有交联剂的溶液和所述WFA接触，能得到二聚体WFA。具体而言，在所述工序(I)中，使用所述含生物素的交联剂时，将含有含所述生物素的交联剂的溶液和WFA混合而能调制含生物素的二聚体WFA(例如生物素化二聚体WFA等)JWFA/交联剂〕的摩尔比优选为1/10以下，更优选为1/20以下。一方面，所述〔WFA/交联剂〕的摩尔比的下限值可根据WFA固定化载体的用途等在得到二聚体WFA的范围内适宜确定。所述〔WFA/交联剂〕的摩尔比当考虑交联剂的使用量与生成的二聚体WFA的收率的平衡时，可作为1/100以上。
[0077]接下来，将所述工序(I)中得到的二聚体WFA固定化到固相载体而得到二聚体WFA固定化载体〔工序(II)〕。向固相载体的二聚体WFA的固定化无特别限定，例如，能利用生物素和生物素结合蛋白质的特异性结合、静电相互作用、疏水的的相互作用、氢键、共价键、由变性作用的物理的吸附等。
[0078]在工序(I)中，在将含有含生物素的交联剂的溶液和WFA混合而调制含生物素的二聚体WFA时，在工序(II)中，作为所述固相载体，优选使用固定化了生物素结合蛋白质的载体，通过使所述载体中的生物素结合蛋白质和所述生物素化二聚体WFA结合而将所述二聚体WFA固定化到所述固相载体上。
[0079]如以上说明，本实施方式的二聚体WFA固定化载体与固定化了天然存在的WFA的载体比，有对在末端有GalNAc残基或Ga I残基的糖链的尚的反应性，而且保存稳定性优良。从而，通过在含在末端有GalNAc残基或Gal残基的糖链的物质的检测中使用，能得到尚的灵敏度及高的再现性。从而，本实施方式的二聚体WFA固定化载体对于含糖链的目标物质、特别是，含在末端有GalNAc残基或Gal残基的糖链的目标物质的检测(定性检测或定量检测)有用。
[0080](目标物质的检测方法)
[0081 ]本实施方式的检测方法是检测含与WFA结合的糖链的目标物质的方法(以下也称为“本实施方式的检测方法”)。
[0082]在本实施方式的检测方法中，首先，通过使二聚体WFA固定化载体、含所述目标物质的样品和标记物质接触，在所述固相载体上形成含所述二聚体WFA、所述目标物质和标记物质的复合物〔工序(A)〕。
[0083]在工序(A)中，作为二聚体WFA固定化载体，能使用前述的实施方式的二聚体WFA固定化载体。
[0084]在工序(A)中，作为标记物质，能使用前述的本实施方式的试剂中所含的标记物质。
[0085]在工序(A)中，二聚体WFA固定化载体与含目标物质的样品和标记物质的接触顺序不特别限定。即，所述接触顺序可为下述(a)?(C)之任何:
[0086](a)首先，使二聚体WFA固定化载体和样品接触后，使标记物质接触得到的混合物，
[0087](b)首先，使二聚体WFA固定化载体和标记物质接触后，使样品接触得到的混合物，
[0088](c)首先，使样品和标记物质接触后，使二聚体WFA固定化载体接触得到的混合物。
[0089]在所述工序(A)中，与所述样品接触的所述二聚体WFA固定化载体的量根据所述样品的种类、所述二聚体WFA固定化载体中的二聚体WFA的量、二聚体WFA固定化载体的保存状态(液体保存或冷冻干燥保存)等而不同，从而优选根据所述样品的种类、所述二聚体WFA固定化载体中的二聚体WFA的量、二聚体WFA固定化载体的保存状态(液体保存或冷冻干燥保存)等适宜确定。
[0090]所述样品和所述二聚体WFA固定化载体的接触时的温度是对于维持二聚体WFA的立体结构、并且进行二聚体WFA和糖链的结合反应适宜的温度即可。所述温度通常是4?50°C、优选为15?42°C。
[0091]所述样品和所述二聚体WFA固定化载体的接触后，优选清洗得到的产物而除去未形成复合物的游离的目标物质及游离的二聚体WFA固定化载体。作为所述产物的清洗中使用的清洗剂，例如，可举出缓冲剂、表面活性剂、含牛血清白蛋白(BSA)等的清洗剂、纯化水等，但不特别限定。
[0092]接下来，检测所述工序(A)中得到的复合物中的目标物质〔工序(B)〕。
[0093]在所述工序(B)中，能通过测定从复合物中的标记物质发生的信号检测复合物中的目标物质。当标记物质含荧光染料或放射性同位素时，能测定荧光或放射能等的信号。另夕卜，当标记物质是酶时，使酶的底物与复合物反应，能测定从酶反应的产物发生的发光、荧光、显色等的信号。测定结果由于与目标物质的量相关，能定性或定量检测目标物质。
【实施例】
[0094]以下，由实施例等详细地说明本发明，但本发明不限于这些。再者，接下来，平均粒径是通过使用激光衍射式粒度分布测定装置〔(株)岛津制作所制、商品名:SALD系列〕由光散射法测定求出的值。
[0095]【实施例1】
[0096]向20mM磷酸缓冲液(pH7.5)添加WFA〔 VECTOR Laboratories公司制、商品名:多花紫藤凝集素〕至所述WFA的浓度成2.5mg/mL，得到含有WFA的溶液。
[0097]向得到的含有WFA的溶液添加作为含生物素的交联剂的5-(N_琥珀酰亚胺基氧基羰基)戊基D-生物素酰胺〔(株)同仁化学研究所制、商品名:生物素-AC5-0SU〕至WFA/交联剂(摩尔比)成1/100。通过将得到的溶液于25°C温育90分钟，使所述WFA和所述含生物素的交联剂反应，得到反应产物。
[0098]【实验例2?5】
[0099]在实验例I中，除了代替将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/100而将WFA/交联剂(摩尔比)设为5/100(实验例2)、10/100(实验例3)、25/100(实验例4)或50/100(实验例5)之外，进行与实验例I同样的操作，得到反应产物。
[0100]【试验例I】
[0101]将在实验例I?5中得到的反应产物，由高效液相层析，在以下的条件下分析，求出反应产物的预计分子量。
[0102].溶出溶剂:磷酸缓冲液(ρΗ6.5)
[0103]?分离柱:凝胶过滤柱
[0104]〔Tosoh(株)制、商品名:TSKgel G3000SWXL)
[0?05].分子量标志物:甲状腺球蛋白(分子量669000)
[0106]γ-球蛋白(分子量158000)
[0107]卵清蛋白(分子量44000)
[0108]肌红蛋白(分子量17000)
[0109]维生素12(分子量13000)
[0110]在试验例I中，研究WFA和交联剂的混合比和反应产物的预计分子量的关系的结果示于图1。再者，生物素化的4聚体的WFA(以下也称为“生物素化4聚体WFA” )的分子量的理论值是116000。另外，生物素化的二聚体的WFA(以下也称为“生物素化二聚体WFA” )的分子量的理论值是58000。生物素化的单体的WFA(以下也称为“生物素化单体WFA”)的分子量的理论值是29000。
[0111]如图1所示，在WFA和交联剂的混合比(体积比)是25/100以上时(实验例4及5)、反应产物的预计分子量是122000，由此提示在实验例4及5中得到的反应产物是生物素化4聚体 WFA ο
[0112]另一方面得知，在WFA和交联剂的混合比是不足25/100时(实验例I?3)、所述混合比越减少，反应产物的预计分子量越有减少的倾向。由于WFA和交联剂的混合比是1/100时(实验例I)的反应产物的预计分子量是56000，提示在实验例I中得到的反应产物是生物素化二聚体WFA。另外，由于所述混合比是5/100时(实验例2)的反应产物的预计分子量是64000，提示在实验例2中得到的反应产物几乎是二聚体化WFA。再者，由于所述混合比是10/100时(实验例3)的反应产物的预计分子量是96000，提示在实验例3中得到的反应产物是生物素化二聚体WFA和生物素化4聚体WFA的混合物。
[0113]从而，这些结果提示，在WFA和交联剂的混合比(体积比)是10/100以下时，得到生物素化二聚体WFA。
[0114]【实施例1】
[0115](I)含有WFA的溶液的调制
[0116]向20mM磷酸缓冲液(pH7.5)添加WFA〔 VECTOR Laboratories公司制、商品名:多花紫藤凝集素〕至成2.5mg/mL，得到含有WFA的溶液。
[0117](2)WFA和交联剂的反应
[0118]向实施例1(1)中得到的含有WFA的溶液添加作为含生物素的交联剂作为生物素和反应基经间隔物结合的交联剂的5-(N_琥珀酰亚胺基氧基羰基)戊基D-生物素酰胺〔(株)同仁化学研究所制、商品名:生物素-AC5-0SU〕至WFA/交联剂(摩尔比)成1/100。通过将得到的溶液于25 °C温育90分钟，使所述WFA和所述交联剂反应，得到反应产物。
[0119](3)生物素化二聚体WFA的纯化
[0120]将实施例1(2)中得到的反应产物由高效液相层析，在以下的条件下纯化，得到生物素化二聚体WFA。
[0121].溶出溶剂:磷酸缓冲液(ρΗ6.5)
[0122]?分离柱:凝胶过滤柱
[0123]〔Tosoh(株)制、商品名:TSKgel G3000SWXL)
[0124](4)含有STA结合粒子的液的调制
[0125]将链霉亲和素固定化到磁性粒子(平均粒径2μπι)的表面的复合物(磁性粒子每Ig的链霉亲和素的量:2.9?3.5mg;以下也称为“STA结合磁性粒子”)用0.0lM HEPES缓冲液(pH7.5)清洗3次。向0.0lM HEPES缓冲液(pH7.5)添加清洗后的STA结合磁性粒子至STA浓度成18?22yg/mL(STA结合磁性粒子的浓度是0.48?0.52mg/mL)，得到含有STA结合粒子的液。
[0126](5) 二聚体WFA固定化载体的调制
[0127]向实施例1(4)中得到的含有STA结合粒子的液添加实施例1 (3)中得到的生物素化二聚体WFA至所述生物素化二聚体WFA的浓度(二聚体WFA致敏浓度)成5yg/mL (实验编号1-l)、10yg/mL(实验编号l-2)、20yg/mL(实验编号1-3)或30yg/mL(实验编号1-4)，使STA结合磁性粒子的链霉亲和素和生物素化二聚体WFA的生物素结合。将得到的产物用0.1M MES缓冲液(pH6.5)清洗3次，得到二聚体WFA固定化载体。使得到的二聚体WFA固定化载体悬浮于MES缓冲液、HEPES缓冲液等的Good缓冲液;磷酸缓冲液等，得到含有二聚体WFA固定化载体的液。
[0128]【比较例I】
[0129](I)WFA的还原及生物素化
[0130]将还原剂〔350mM 2_巯基乙基胺、NACALAI TESQUE(株)制、商品名:2_巯基乙基胺盐酸盐〕88yL和WFA〔 VECTOR Laboratories公司制、商品名:多花紫藤凝集素〕2000yg混合，通过于25°C温育90分钟，还原WFA。接下来，将得到的还原WFA由N-生物素基-N’-[2-(N-马来酰亚胺)乙基]哌嗪盐酸盐〔(株)同仁化学研究所制、商品名:生物素-PE-马来酰亚胺〕生物素化，得到反应产物。
[0131](2)预测分子量的算出
[0132]在试验例I中，除了代替使用在实验例I?5中得到的反应产物而使用比较例1(1)中得到的反应产物之外，进行与试验例I同样的操作，求出反应产物的预计分子量。结果，由于比较例I (I)中得到的反应产物的预计分子量是29000，提示比较例I (I)中得到的反应产物是生物素化单体WFA。
[0133](3)生物素化单体WFA的纯化
[0134]在实施例1(3)中，除了代替使用实施例1(2)中得到的反应产物而使用比较例1(1)中得到的反应产物之外，进行与实施例1 (3)同样的操作，得到生物素化单体WFA。
[0135](4)单体WFA固定化载体的调制
[0136]向实施例1(4)中得到的含有STA结合粒子的液添加比较例I (3)中得到的生物素化单体WFA至所述生物素化单体WFA的浓度(单体WFA致敏浓度)成5yg/mL(实验编号2-1)、10μg/mL(实验编号2-2)、20yg/mL(实验编号2-3)或30yg/mL(实验编号2-4)，使STA结合磁性粒子的链霉亲和素和生物素化单体WFA的生物素结合。将得到的产物用0.1M MES缓冲液(pH6.5)清洗3次，得到单体WFA固定化载体。将此单体WFA固定化载体悬浮于0.1M MES缓冲液(pH6.5),0.1M HEPES缓冲液(pH7.5)等，得到含有单体WFA固定化载体的液。
[0137]【比较例2】
[0138]向实施例1(4)中得到的含有STA结合粒子的液添加WFA〔VECT0R Laboratories公司制、商品名:多花紫藤凝集素〕至成5yg/mL(实验编号3-1)、10yg/mL(实验编号3-2)、20ng/mL(实验编号3-3)或30yg/mL(实验编号3-4)，使STA结合磁性粒子的链霉亲和素和生物素化4聚体WFA的生物素结合。将得到的产物用0.1M MES缓冲液(pH6.5)清洗3次，得到4聚体WFA固定化载体。将此4聚体WFA固定化载体悬浮于0.1M MES缓冲液(pH6.5),0.1M HEPES缓冲液(pH7.5)等，得到含有4聚体WFA固定化载体的液。
[0139]【试验例2】
[0140]将0.0IM HEPES缓冲液(pH7.5) 50yL和被检样品〔含有0.1?100yg/mL糖蛋白质M2BP的水溶液〕1yL混合，于42°C温育2分钟。
[0141]向得到的混合物添加在实施例1中得到的含有二聚体WFA固定化载体的液(实验编号1-1?1-4 )、在比较例I中得到的含有单体WFA固定化载体的液(实验编号2-1?2-4)或在比较例2中得到的含有4聚体WFA固定化载体的液(实验编号3-1?3-4)30yL。将其于42°C温育I分钟而使被检样品中的M2BP和二聚体WFA固定化载体、单体WFA固定化载体或4聚体WFA固定化载体反应。
[0142]将得到的反应产物用含清洗液〔20mM Tris(pH7.4)、0.1质量％Tween20、0.1质量％叠氮化钠和0.8质量％氯化钠的水溶液〕100?70(^1^清洗4次。
[0143]清洗后，添加0.lU/mL碱性磷酸酶标记抗M2BP抗体溶液(抗体浓度0.01?10yg/mL) 100yL。将得到的混合物于42°C温育2.5分钟。其后，用所述清洗液100?700yL清洗4次。
[0144]清洗后，添加反应溶液〔含0.1M 2-氨基-2-甲基-1-丙醇(pH9.6)、ImM氯化镁和0.1质量%叠氮化钠的水溶液〕50yL及含有底物的溶液〔Applied B1systems公司制、商品名:(DP-Star with Sapphirine-1I〕100yL。将其于42°C温育5分钟而进行碱性磷酸酶反应。
[0145]其后，使用全自动免疫测定装置〔Sysmex(株)制、商品名:HISCL_2000i〕，测定波长300?650nm中的发光强度。
[0146]在试验例2中，研究将M2BP作为目标物质使用时的WFA致敏浓度和发光强度的关系的结果示于图2。图中，白色三角形显示使用在实施例1中得到的含有二聚体WFA固定化载体的液(实验编号1-1?1-4)时的发光强度、白色四角形显示使用在比较例I中得到的含有单体WFA固定化载体的液(实验编号2-1?2-4)时的发光强度、白色圆点显示使用在比较例2中得到的含有4聚体WFA固定化载体的液(实验编号3-1?3-4)时的发光强度。
[0147]如图2所示，得知在使用二聚体WFA固定化载体时(白色三角形)、只要是致敏浓度lOyg/mL以上，就无关于致敏浓度而得到高的发光强度。与此相比，得知在使用单体WFA固定化载体或4聚体WFA固定化载体时，当致敏浓度10yg/mL以上时显示高的发光强度，但当致敏浓度20yg/mL以上时发光强度大大降低。
[0148]所述发光强度的降低预计是因为由高的致敏浓度而M2BP和凝集素的结合发生某种立体结构上的障碍。即，即使为使灵敏度升高而使用大量的单体WFA或4聚体WFA，相反灵敏度变得降低。另一方面得知，二聚体WFA被认为即使是以高的致敏浓度，也不发生抑制与M2BP的结合的障碍，能为高灵敏度化在固相载体上致敏大量的凝集素。
[0149]【实施例2】
[0150]在实施例1中，除了代替将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/100而将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/10〔实验编号4-l(WFA致敏浓度5yg/mL)、实验编号4-2(WFA致敏浓度10yg/mL)、实验编号4-3(20yg/mL)或实验编号4-4(30yg/mL)〕之外，进行与实施例1同样的操作，得到含有二聚体WFA固定化载体的液。
[0151]【实施例3】
[0152]在实施例1中，除了代替将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/100而将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/20〔实验编号5-l(WFA致敏浓度5yg/mL)、实验编号5-2(WFA致敏浓度10yg/mL)、实验编号5-3(20yg/mL)或实验编号5-4(30yg/mL)〕之外，进行与实施例1同样的操作，得到含有二聚体WFA固定化载体的液。
[0153]【实施例4】
[0154]在实施例1中，除了代替将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/100而将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/40〔实验编号6-l(WFA致敏浓度5yg/mL)、实验编号6-2(WFA致敏浓度10yg/mL)、实验编号6-3(20yg/mL)或实验编号6-4(30yg/mL)〕之外，进行与实施例1同样的操作，得到含有二聚体WFA固定化载体的液。
[0155]【实施例5】
[0156]在实施例1中，除了代替将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/100而将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/60〔实验编号7-l(WFA致敏浓度5yg/mL)、实验编号7-2(WFA致敏浓度10yg/mL)、实验编号7-3(20yg/mL)或实验编号7-4(30yg/mL)〕之外，进行与实施例1同样的操作，得到含有二聚体WFA固定化载体的液。
[0157]【实施例6】
[0158]在实施例1中，除了代替将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/100而将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/80〔实验编号8-l(WFA致敏浓度5yg/mL)、实验编号8-2(WFA致敏浓度10yg/mL)、实验编号8-3(20yg/mL)或实验编号8-4(30yg/mL)〕之外，进行与实施例1同样的操作，得到含有二聚体WFA固定化载体的液。
[0159]【实施例7】
[0160]在实施例1中，除了代替将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/100而将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/120〔实验编号9-l(WFA致敏浓度5μg/mL)、实验编号9-2(WFA致敏浓度10μg/mL)、实验编号9-3(20yg/mL)或实验编号9-4(30yg/mL)〕之外，进行与实施例1同样的操作，得到含有二聚体WFA固定化载体的液。
[0161]【实施例8】
[0162]在实施例1中，除了代替将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/100而将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/160〔实验编号10-l(WFA致敏浓度5μg/mL)、实验编号10-2(WFA致敏浓度10μg/mL)、实验编号10-3(20yg/mL)或实验编号10-4(30yg/mL)〕之外，进行与实施例1同样的操作，得到含有二聚体WFA固定化载体的液。
[0163]【实施例9】
[0164]在实施例1中，除了代替将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/100而将WFA/交联剂(摩尔比)设为1/200〔实验编号ll-l(WFA致敏浓度5μg/mL)、实验编号ll-2(WFA致敏浓度10μg/mL)、实验编号ll-3(20yg/mL)或实验编号ll-4(30yg/mL)〕之外，进行与实施例1同样的操作，得到含有二聚体WFA固定化载体的液。
[0165]【试验例3】
[0166]在试验例2中，除了使用在实施例1?9中得到的含有二聚体WFA固定化载体的液之夕卜，进行与试验例2同样的操作，测定发光强度。
[0167]在试验例3中，研究将M2BP作为目标物质使用时的WFA致敏浓度和发光强度的关系的结果示于图3。图中，白色菱形显示使用WFA/交联剂(摩尔比)是1/10的含有二聚体WFA固定化载体的液(实验编号4-1?4-4)时的发光强度、白色四角形显示使用WFA/交联剂(摩尔比)是1/20的含有二聚体WFA固定化载体的液(实验编号5-1?5-4)时的发光强度、白色三角形显示使用WFA/交联剂(摩尔比)是1/40的含有二聚体WFA固定化载体的液(实验编号6-1?6-4)时的发光强度、叉号显示使用WFA/交联剂(摩尔比)是1/60的含有二聚体WFA固定化载体的液(实验编号7-1?7-4)时的发光强度、白色圆点显示使用WFA/交联剂(摩尔比)是1/80的含有二聚体WFA固定化载体的液(实验编号8-1?8-4)时的发光强度、黑色菱形显示使用WFA/交联剂(摩尔比)是1/100的含有二聚体WFA固定化载体的液(实验编号1-1?1-4)时的发光强度、黑色四角形显示使用WFA/交联剂(摩尔比)是1/120的含有二聚体WFA固定化载体的液(实验编号9-1?9-4)时的发光强度、黑色三角形显示使用WFA/交联剂(摩尔比)是I/160的含有二聚体WFA固定化载体的液(实验编号10-1?10-4)时的发光强度、及黑色圆点显示使用WFA/交联剂(摩尔比)是1/200的含有二聚体WFA固定化载体的液(实验编号11-1?11-4)时的发光强度。
[0168]如图3所示，得知使用含有二聚体WFA固定化载体的液时的发光强度的由WFA/交联剂(摩尔比)的变动比较小。
[0169]【试验例4】
[0170]将在实施例1中得到的含有二聚体WFA固定化载体的液〔WFA致敏浓度:20yg/mL(实验编号1-3)〕于37°C温育14天，继时性地采集。使用采集的含有二聚体WFA固定化载体的液，进行与试验例2同样的操作，测定发光强度。
[0171]接下来，求出相对温育前的使用含有二聚体WFA固定化载体的液时的发光强度(对照的发光强度)的经过指定时间后的使用含有二聚体WFA固定化载体的液时的发光强度的相对值(二聚体WFA固定化载体的残留活性)，通过研究残留活性的经时变化，评价二聚体WFA固定化载体的保存稳定性。
[0172]另外，在上述中，除了代替使用在实施例1中得到的含有二聚体WFA固定化载体的液而使用在比较例2中得到的含有4聚体WFA固定化载体的液〔WFA致敏浓度:1yg/mL(实验编号1-2)〕之外，进行与上述同样的操作，评价4聚体WFA固定化载体的保存稳定性。
[0173]将在经过时间O天时间点的与M2BP的结合活性作为100时的残留活性示于图4。图中，黑色四角形表示含有二聚体WFA固定化载体的液的残留活性、黑色菱形表示含有4聚体WFA固定化载体的液的残留活性。
[0174]另外得知，如图4所示，二聚体WFA固定化载体，对于与M2BP的结合活性，在从温育开始起14天经过后，有高的残留活性。从图4所示的结果得知，二聚体WFA固定化载体的残留活性比关于4聚体WFA固定化载体的结合活性的残留活性高。从而得知，二聚体WFA固定化载体，与4聚体WFA固定化载体比，在保存稳定性上优良。
[0175]【试验例5】
[0176](I)二聚体WFA固定化载体的储存
[0177]将在实施例1中得到的含有二聚体WFA固定化载体的液在保持于2?8°C的冰箱内储存。在从储存开始起经过O个月时、经过I个月时、经过3个月时、经过6个月时及经过7个月时采集含有二聚体WFA固定化载体的液的一部分。
[0178](2)基于与Muc-1的反应性的二聚体WFA固定化载体的保存稳定性评价
[0179]使0.0lM HEPES缓冲液(pH7.5)50yL和作为被检样品胆管癌患者血清待测样品〔PR0MMDDX公司制、商品名:胆管癌〕1yL混合。将此混合物于42 °C温育2分钟。
[0180]其后，添加在试验例5(1)中采集的含有二聚体WFA固定化载体的液30yL。通过将其于42 °C温育I分钟，使被检样品中的Muc-1和二聚体WFA固定化载体反应。
[0181]将此反应产物用清洗液〔含20mM Tris(pH7.4)、0.1质量％Tween20、0.1质量％叠氮化钠和0.8质量％氯化钠的水溶液〕100?70(^1^清洗4次。
[0182]清洗后，添加0.1U/mL碱性磷酸酶标记抗Muc-1抗体溶液lOOyL。将其于42°C温育2.5分钟。其后，用所述清洗液100?700yL清洗4次。
[0183]向清洗后的反应产物添加反应溶液〔含0.1M 2-氨基-2-甲基-1-丙醇(pH9.6)、lmM氯化镁和0.1质量％叠氮化钠的水溶液〕50yL及含有底物的溶液〔Applied B1systems公司制、商品名:⑶P-Star with Sapphirine-1I〕lOOyL。将其于42°C温育5分钟而进行碱性磷酸酶反应。
[0184]其后，对于得到的反应产物，使用全自动免疫测定装置〔Sysmex(株)制、商品名:HISCL-2000i〕，测定波长300?650nm中的发光强度。
[0185]接下来，求出相对温育前的使用含有二聚体WFA固定化载体的液时的发光强度(对照的发光强度)的经过指定时间后的使用含有二聚体WFA固定化载体的液时的发光强度的相对值(二聚体WFA固定化载体的残留活性)，通过研究残留活性的经时变化，评价二聚体WFA固定化载体的保存稳定性。
[0186]将经过时间O个月时间点的与Muc-1的结合活性作为100时的残留活性示于图5。
[0187]如图5所示，二聚体WFA固定化载体在从储存开始起经过7个月后，有高的残留活性。从而得知，二聚体WFA固定化载体在保存稳定性上优良。
[0188]【试验例6】
[0189]除了代替将在实施例1中得到的含有二聚体WFA固定化载体的液在保持于2?8°C的冰箱内储存而于37°C温育，代替从储存开始起经过O个月时、经过I个月时、经过3个月时、经过6个月时及经过7个月时采集含有二聚体WFA固定化载体的液的一部分而在从温育开始起经过O天后，经过I天时、经过3天时、经过7天时及经过14天时采集含有二聚体WFA固定化载体的液的一部分之外，进行与试验例5同样的操作，评价二聚体WFA固定化载体的保存稳定性。
[0190]将在经过时间O天时间点的与Muc-1的结合活性设为100时的残留活性示于图6。
[0191]如图6所示，得知二聚体WFA固定化载体即使从温育开始起经过14天也维持高的残留活性。从而得知，二聚体WFA固定化载体在保存稳定性上优良。
[0192]【试验例7】
[0193]将0.0IM HEPES缓冲液(pH7.5)50yL和被检样品1yL混合，将得到的混合物于42°C温育2分钟。作为被检样品，使用胆管癌患者待测样品I?3〔PR0MMDDX供给、商品名:胆管癌〕O
[0194]其后，添加在实施例1中得到的含有二聚体WFA固定化载体的液(实验编号1-1?Ι-Α )、 在比较例 I 中得到的含有单体WFA固定化载体的液(实验编号2-1?2-4)或在比较例2中得到的含有4聚体WFA固定化载体的液(实验编号3-1?3-4)30yL。将这些于42°C温育I分钟而使被检样品中的Muc-1和二聚体WFA固定化载体反应。
[0195]将得到的反应产物用清洗液〔含20mM Tris(pH7.4)、0.I质量％Tween20、0.I质量％叠氮化钠和0.8质量％氯化钠的水溶液〕100?70(^1^清洗4次。
[0196]清洗后，添加0.1U/mL碱性磷酸酶标记抗Muc-1抗体溶液lOOyL。将其于42°C温育2.5分钟。其后，用所述清洗液100?700yL清洗4次。
[0197]向清洗后的反应产物添加反应溶液〔含0.1M 2-氨基-2-甲基-1-丙醇(pH9.6)、lmM氯化镁和0.1质量％叠氮化钠的水溶液〕50yL及含有底物的溶液〔Applied B1systems公司制、商品名:⑶P-Star with Sapphirine-1I〕100yL。将其于42°C温育5分钟而进行碱性磷酸酶反应。
[0198]其后，使用全自动免疫测定装置〔Sysmex(株)制、商品名:HISCL_2000i〕，测定波长300?650nm中的发光强度。接下来，求出将使用WFA致敏浓度是5yg/mL的含有二聚体WFA固定化载体的液实验编号1-1)时的发光强度作为10时的相对反应性。
[0199]在试验例7中，研究将Muc-1作为目标物质使用时的WFA致敏浓度和发光强度的关系的结果示于图7A?C。图中，白色圆点显示使用在实施例1中得到的含有二聚体WFA固定化载体的液(实验编号1-1?1-4)时的发光强度、白色四角形显示使用在比较例I中得到的含有单体WFA固定化载体的液(实验编号2-1?2-4)时的发光强度、白色三角形显示使用在比较例2中得到的含有4聚体WFA固定化载体的液(实验编号3-1?3-4)时的发光强度。另外，图7A显示使用胆管癌患者的待测样品I时的二聚体WFA致敏浓度和相对反应性的关系、图7B显示使用胆管癌患者的待测样品2时的二聚体WFA致敏浓度和相对反应性的关系、图7C显示使用胆管癌患者的待测样品3时的二聚体WFA致敏浓度和相对反应性的关系。
[0200]如图7A?C所示，使用二聚体WFA固定化载体时的相对反应性(白色圆点)，无论是在使用待测样品I?3之任何待测样品时，均无关于WFA致敏浓度，比使用单体WFA固定化载体(白色四角形)或4聚体WFA固定化载体(白色三角形)时的相对反应性高。从而得知，由二聚体WFA固定化载体，则无关于WFA致敏浓度，如待测样品中所含的Muc-1等一样，对于含与WFA结合的糖链的目标物质，显示高的反应性。
[0201 ] 从以上的结果得知，二聚体WFA固定化载体有比4聚体WFA固定化载体及单体WFA固定化载体高的对所述糖链的反应性。而且得知，二聚体WFA固定化载体在保存稳定性上优良。
[0202] 本申请关于各自在2014年2月27日及2015年I月9日申请的日本专利申请特愿2014-036777号及特愿2015-002865号，这些的专利权利要求、说明书、附图及摘要的全部作为参照并入本说明书中。
【主权项】
1.用于检测含与多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)结合的糖链的目标 物质的试剂，其含有所述WFA经二聚体化的二聚体WFA被固定化到固相载体上的二聚体WFA 固定化载体。2.权利要求1所述的试剂，其中所述二聚体WFA经生物素和生物素结合蛋白质而固定化 到所述固相载体上。3.权利要求2所述的试剂，其中所述二聚体WFA是生物素化二聚体WFA，并且生物素结合蛋白质被固定化到所述固相载 体上，且所述生物素化二聚体WFA经所述生物素结合蛋白质而固定化到所述固相载体上。4.含与多花紫藤(Wisteria floribunda)的凝集素(WFA)结合的糖链的目标物质的检 测方法，其包括(A)通过使下列物质接触:所述WFA经二聚体化的二聚体WFA被固定化到固相载体上的二聚体WFA固定化载体、含所述目标物质的样品、和与所述目标物质特异性地结合的标记物质，由此在所述固相载体上形成含所述二聚体WFA、所述目标物质和所述标记物质的复合 物的工序、及(B)通过测定所述工序(A)中得到的复合物中的标记物质，检测所述目标物质的工序。5.权利要求4所述的方法，其中所述标记物质是与所述目标物质特异性地结合的标记 抗体。6.用于检测含与多花紫藤(Wisteria €1〇1~;[131111(1&)的凝集素(￥?4)结合的糖链的目标 物质的载体，其中所述WFA有二聚体化的二聚体WFA和固相载体，且所述二聚体WFA被固定化到所述固相载体上。7.用于检测含与多花紫藤(Wisteria €1〇1~;[131111(1&)的凝集素(￥?4)结合的糖链的目标 物质的载体的制造方法，其包括(I)使所述WFA经二聚体化而得到二聚体WFA的工序、及(II)将所述工序(I)中得到的二聚体WFA固定化到固相载体而得到二聚体WFA固定化载 体的工序。8.权利要求7所述的方法，其中在所述工序(I)中，将含有含生物素的交联剂的溶液和 WFA混合而调制生物素化二聚体WFA。9.权利要求8所述的方法，其中在所述工序(II)中，作为所述固相载体，使用固定化了 生物素结合蛋白质的载体，通过使所述载体中的生物素结合蛋白质和所述生物素化二聚体 WFA结合而将所述二聚体WFA固定化到所述固相载体上。10.权利要求8所述的方法，其中在所述工序(I)中，通过使所述含有交联剂的溶液和所 述WFA接触至〔WFA/交联剂〕的摩尔比成1/10以下(但是不含0)，得到所述二聚体WFA。11.权利要求8所述的方法，其中所述交联剂是与所述二聚体WFA中的氨基形成交联的 交联剂。12.权利要求8所述的方法，其中所述交联剂具有选自N-羟基琥珀酰亚胺酯基、异硫氰基、氯砜基、氯羰基、氧乙烯基、碳原子数1?4的氯烷基、醛基及羧基的至少1种官能团作为 对所述二聚体WFA中的氨基的反应基。13.权利要求12所述的方法，其中所述生物素和所述反应基经间隔物结合。
【文档编号】G01N33/543GK106030305SQ201580010658
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2015年1月30日
【发明人】鹤野亲是, 永井慎也, 寺尾美菜子, 水田知佳, 京藤拓也
【申请人】希森美康株式会社