利用鱼的ACP活性监测CO₂酸化水体的方法

利用鱼的ACP活性监测CO₂酸化水体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用鱼的酸性磷酸酶(ACP)监测二氧化碳(CO2)酸化水体的方法，用鱼作为监测水体污染的生物样本，鱼的ACP作为监测CO2酸化水体的敏感生物标记物；本发明的优点在于：本发明可以获知待测水域中CO2酸化水体的pH值大小，以及获知待测水域目前的危害程度；同时也能从生物的角度敏感地监测CO2酸化程度和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。
【专利说明】
利用鱼的ACP活性监测C〇2酸化水体的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及利用生物敏感标志物检测水体酸化，更具体地说，本发明涉及一种利 用鱼的ACP活性检测水体酸化程度和危害程度的方法。
【背景技术】
[0002] 自工业革命以来，由于人类活动和工农业发展，大气中的二氧化碳(C02)水平正以 前所未有的速度上升，导致海洋和其他水体吸收C0 2的量不断增加，水体pH值下降，导致水 体酸化。
[0003] C〇2酸化如海水酸化，不同于一般意义上的酸化如盐酸(HC1)酸化，C〇2酸化对鱼类 的影响显著大于HC1酸化的影响。例如同是pH=6.2，C〇2酸化对真鲷(Pagrus major)的卵和 幼体产生的毒性(死亡率60-100% )远高于HC1酸化产生的毒性(死亡率1-4% )。由于⑶2分 子比H+更易穿透生物膜，与水反应生成HK〇3,后者在碳酸酐酶的作用下，迅速分解成H+和 HC0 3-;在相同H+浓度下(pH=6.16)，C〇2衍生出的分子种类(HC03-、C03 2-)是HC1的150倍。HC1 酸化只是H+浓度升高；而C02进入生物体内后可以直接破坏体液的酸碱平衡，加之C0 2酸化还 会使机体新陈代谢率及蛋白合成下降，携氧能力下降，抑制机体正常生理活动，乃至死亡。 因此，由C〇2酸化升高导致的pH降低对水生动物产生的影响比单一 H+浓度增加而产生的影响 更为严重。
[0004] 海水酸化是C02酸化，是全球环境变化的重大问题之一。海水酸化可直接和间接影 响鱼及其他水生生物的代谢、抗氧化、免疫防御、离子和酸碱平衡等，致其伤亡。海水酸化不 仅威胁某些物种，还可使整个海洋生态系统退化。海水酸化是亟待研究和积极应对的全球 性重大环境问题。
[0005] 目前有关海水酸化(C02酸化水体）的研究刚起步，海水酸化对水生生物影响的研 究还少，对鱼类影响的研究更少，海水酸化的生物效应相对难以预测，并且尚无适宜的鱼类 酶活性监测C0 2酸化水体的酸化程度和危害程度，影响了海水酸化对水生生物影响的深入 研究。

【发明内容】

[0006] 本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优 点。
[0007] 本发明还有一个目的就是提供一种利用鱼的ACP活性监测C02酸化水体的方法，本 方法利用鱼的ACP作为敏感生物标记物，能敏感地表明水体中⑶2酸化的程度和危害程度， 为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。
[0008] 为了实现根据本发明的这些目的和其他优点，提供了一种利用鱼的ACP活性监测 C02酸化水体的方法。本检测方法为获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的ACP作为 敏感生物标记物。其中，ACP是酸性磷酸酶的简写。
[0009] 优选的是，所述鱼的ACP活性与C02酸化水体的pH值大小呈负相关。
[0010] 优选的是，建立鱼的ACP活性与C〇2酸化水体的pH值大小关系的标准曲线，然后将 待检测水域中的同种同大小的鱼的ACP活性与所述标准曲线比对，得到待检测水域中0) 2酸 化水体的pH值大小。
[0011] 优选的是，采用蛋白定量测定试剂盒、ACP测定试剂盒和可见分光光度计测定鱼的 ACP活性。
[0012]优选的是，所述鱼的ACP活性测定包括如下步骤：
[0013] 步骤一、待测样本处理:制备全鱼匀浆，然后离心分层，取上层清液为待测样本；
[0014] 步骤二、待测样本蛋白浓度的测定:分别将等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本 加入1、2、3号管中，并分别向各管加入等量的考马斯亮蓝显色剂，分别混匀，静置，用分光光 度计并用双蒸水调零后，于lcm光径，在波长595nm处，测定1、2、3号管中物质的光密度，分别 记为1号0D值，2号0D值，3号0D值，然后代入如下公式计算得待测样本蛋白浓度：
[0015]
[0016]步骤三、在空白管中加入双蒸水0.03mL，在标准管中加入浓度为0. lmg/mL的酚标 准应用液0.03mL，在测定管中加入待测样本0.03mL，在空白管、标准管和测定管中分别各加 入缓冲液〇. 5mL和基质液0.5mL，然后充分混匀，37 °C水浴30分钟；
[0017]步骤四、在空白管、标准管和测定管中分别各加入碱液lmL和显色剂1.5mL，然后快 速混匀，静置10分钟，将空白管的溶液于可见光分光光度计调零后，使用lcm光径于520nm 处，测标准管和测定管的光密度，分别记为标准0D值和测定0D值，然后代入如下公式计算 ACP活性：
[0018]
[0019] 其中，取样量为0.03mL，在37°C时，每0.5h每克组织蛋白与基质产生lmg酚，定义为 1个ACP活力单位。
[0020] 优选的是，所述步骤一中全鱼匀浆为全鱼与浓度0.65%的鱼用生理盐水按质量比 为1:9配置，且所述离心分层用冷冻离心机，11028g，4°C，离心10min。
[0021]优选的是，所述步骤二中等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本均为0.05ml，蛋白 标准品的浓度为〇.563g/L，分别加入考马斯亮蓝显色剂的量均为3ml，静置lOmin。
[0022]优选的是，所述鱼为海水青鏘或淡水青鏘。
[0023] 本发明至少包括以下有益效果:酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)是一种在酸 性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸的水解酶。它是鱼体内重要的代谢酶，参与信号 转导、能量转换等生命活动。主要存在于巨噬细胞、溶酶体内，在正常情况下，ACP活性较低。 ACP对环境因素和机体pH变化非常敏感。本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于鱼 的ACP活性监测C02酸化水体的方法，该方法有利于预测海水酸化的生物效应。对保护海水 酸化的首要冲击者、水体生产力中的主要产物一鱼类和其他生物，发展可持续的渔业和生 态系统具有现实意义。并且本发明可以利用鱼的ACP监测C0 2酸化水体的污染情况，通过鱼 的ACP与C02酸化水体的pH值大小呈负相关，就可以快速准确监测到水体受到C02的酸化程度 和危害程度。
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书 能够据以实施。
[0025] 实施例1
[0026]本方案利用鱼的ACP活性监测C02酸化水体的方法，获取需要检测的水域中的鱼， 并采用所述鱼的ACP作为敏感生物标记物，通过检测鱼的ACP活性，然后比对同类同大小的 鱼的ACP活性与C02酸化水体的pH值大小关系的标准曲线，就可以检测出水体受C0 2酸化的pH 值大小，不但检测准确，且敏感度高，而且能直观反映C02酸化水体对生物的危害程度。
[0027] 实施例2
[0028]本方案利用鱼的ACP活性监测C02酸化水体的方法，获取需要检测的水域中的鱼， 并采用所述鱼的ACP作为敏感生物标记物，根据鱼的ACP活性与水体受C02酸化的pH值大小 呈负相关，通过测定鱼的ACP活性，然后比对同类同大小的鱼的ACP活性与C0 2酸化水体的pH 值大小关系的标准曲线，如果检测样本鱼的ACP活性比正常情况下的同类同大小的鱼的ACP 活性高，则判断水域受到C0 2酸化;ACP活性越高，则判断水域C02酸化越严重，甚至可判断是 否达到危害水体生物的程度。
[0029] 实施例3
[0030]本方案利用鱼的ACP活性监测⑶2酸化水体的方法，获取需要检测的水域中的鱼， 并采用所述鱼的ACP作为敏感生物标记物。首先通过实验建立鱼的ACP活性与C02酸化水体 的pH值大小关系的标准曲线，然后将待检测水域中的同种同大小的鱼的ACP活性与所述标 准曲线比对，得到待检测水域中C0 2酸化的pH大小。
[0031 ]通过实验建立鱼的ACP活性与C02酸化水体的pH值大小关系的标准曲线，如下： [0032]采用30天龄海水青鏘稚鱼作为监测水污染的生物样本，将稚鱼分成5组，每组3个 平行进行，分别在表1所述的水环境中饲养，其中水域的PH8.1为对照组。饲养8周后，每个平 行取3尾鱼样品测定，每组测定3*3 = 9个数据，将每组9个数据数理统计后得到各组鱼的ACP 活性如表2所示，根据表2的数据绘制鱼的ACP活性与C02酸化水体的pH值大小关系的标准曲 线。
[0033] 表1 5组稚鱼饲养的水域中C02酸化水体的pH值
[0035]用C02充气系统持续泡控目标pH值的酸化海水，以目前近海表层海水的平均值 (pH8.1)为对照组。通过向海水中充入高纯C02气体，用HENTEX pH/ORP控制器监测并持续泡 控每个养殖槽中海水pH值，以保持各组实验海水pH值的稳定。饲养的其他条件是:每天三次 投喂200目饲料，总投喂量为鱼体重的5%。每天详细观察和记录鱼的活动、摄食、畸形、死亡 等，8周后随机采集鱼样品，分别称鱼体湿重，提取用于测定鱼的ACP。
[0036] 表2 5组鱼样品的ACP活性
[0038]使用南京建成生物公司生产的蛋白定量测定试剂盒、ACP测定试剂盒和可见分光 光度计测定待测水域中的海水青鏘的ACP活性的具体步骤如下：
[0039]步骤一、待测样本处理:制备全鱼匀浆，然后离心分层，取上层清液为待测样本；
[0040] 步骤二、待测样本蛋白浓度的测定:分别将等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本 加入1、2、3号管中，并分别向各管加入等量的考马斯亮蓝显色剂，分别混匀，静置，用分光光 度计并用双蒸水调零后，于lcm光径，在波长595nm处，测定1、2、3号管中物质的光密度，分别 记为1号0D值，2号0D值，3号0D值，然后代入如下公式计算得待测样本蛋白浓度：
[0041]
[0042]步骤三、在空白管中加入双蒸水0.03mL，在标准管中加入浓度为0. lmg/mL的酚标 准应用液0.03mL，在测定管中加入待测样本0.03mL，在空白管、标准管和测定管中分别各加 入缓冲液〇. 5mL和基质液0.5mL，然后充分混匀，37 °C水浴30分钟；
[0043] 步骤四、在空白管、标准管和测定管中分别各加入碱液lmL和显色剂1.5mL，然后快 速混匀，静置10分钟，用空白管溶液于可见光分光光度计调零后，使用lcm光径于520nm处， 测标准管和测定管的光密度，分别记为标准0D值和测定0D值，然后代入如下公式计算ACP活 性：
[0044]
[0045] 其中，取样量为0.03mL，在37°C时，每0.5h每克组织蛋白与基质产生lmg酚，定义为 1个ACP活力单位。
[0046] 然后将计算得海水青鏘的ACP活性，比对用表2的数据绘制鱼的ACP活性与C02酸化 水体的pH值大小关系的标准曲线，不但可以知道水体是否受到C〇2酸化，而且从标准曲线中 可以知道水体中C〇2酸化的pH大小，更能知道水体对生物体危害程度。
[0047] 实施例4
[0048] 利用实验可以建立任何鱼种的鱼的ACP活性与⑶2酸化水体的pH值大小关系的标 准曲线，然后取待测水域中的鱼做样本，只要做样本的鱼与建立标准曲线的鱼是同类同大 小的即可进行比对。
[0049] 利用蛋白定量测定试剂盒、ACP测定试剂盒和可见分光光度计测定待测水域中的 鱼的ACP活性具体步骤如下：
[0050] 步骤一、待测样本处理:取与建立标准曲线用鱼一样和大小相当的鱼制备全鱼匀 浆，全鱼匀浆为全鱼与0.65%浓度的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，然后离心分层用冷 冻离心机，1 l〇28g，4°C，离心10min分层，取上层清液为待测样本；
[0051] 步骤二、待测样本蛋白浓度的测定:分别将等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本 加入1、2、3号管中，并分别向各管加入等量的考马斯亮蓝显色剂，分别混匀，静置，预热，用 分光光度计并用双蒸水调零后，于lcm光径，在波长595nm处，测定1、2、3号管中物质的0D，分 另IJ记为1号0D值，2号0D值，3号0D值，然后代入如下公式计算得待测样本蛋白浓度：
[0052]
[0053]步骤三、在空白管中加入双蒸水0.03mL，在标准管中加入浓度为0. lmg/mL的酚标 准应用液0.03mL，在测定管中加入待测样本0.03mL，在空白管、标准管和测定管中分别各加 入缓冲液〇. 5mL和基质液0.5mL，然后充分混匀，37 °C水浴30分钟；
[0054]步骤四、在空白管、标准管和测定管中分别各加入碱液lmL和显色剂1.5mL，然后快 速混匀，静置10分钟，用空白管溶液于可见光分光光度计调零后，使用lcm光径于520nm处， 测标准管和测定管的光密度，分别记为标准0D值和测定0D值，然后代入如下公式计算ACP活 性：
[0055]
[0056] 其中，取样量为0.03mL，在37 °C时，每0.5h每克组织蛋白与基质产生lmg酚，为1个 ACP活力单位。
[0057] 将计算得鱼的ACP活性，比对试验建立鱼的ACP活性与⑶2酸化水体的pH值大小关 系的标准曲线，不但可以知道水体是否受C〇2酸化，而且从标准曲线中可以知道水体中C〇2酸 化的pH值大小，更能知道水体对生物体危害程度。
[0058] 实施例5
[0059]利用实验建立12周龄的淡水青鏘的ACP活性与C02水体的pH大小关系的标准曲线， 然后取待测水域中的鱼做样本，只要取得样本的鱼与建立标准曲线的鱼是同类同大小的即 可进行比对。
[0060] 取得待测水域中12周龄的淡水青鏘做样本，然后利用蛋白定量测定试剂盒、ACP测 定试剂盒和可见分光光度计测定待测水域中的该鱼的ACP活性具体步骤如下：
[0061] 步骤一、待测样本处理:取与建立标准曲线用鱼一样和大小相当的鱼制备全鱼匀 浆，全鱼匀浆为全鱼与0.65%浓度的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，然后离心分层用冷 冻离心机，1 l〇28g，4°C，离心10min分层，取上层清液为待测样本；
[0062] 步骤二、待测样本蛋白浓度的测定:分别将双蒸水、浓度为0.563g/L的蛋白标准品 和待测样本各〇.〇5ml加入1、2、3号管中，并分别向各管加入考马斯亮蓝显色剂3ml，分别混 匀，静置lOmin，预热到35°C，用分光光度计并用双蒸水调零后，于lcm光径，波长595nm处，测 定1、2、3号管中溶液的0D，分别记为1号0D值，2号0D值，3号0D值，然后代入如下公式计算得 待测样本蛋白浓度：
[0063]
[0064]步骤三、在空白管中加入双蒸水0.03mL，在标准管中加入浓度为0. lmg/mL的酚标 准应用液0.03mL，在测定管中加入待测样本0.03mL，在空白管、标准管和测定管中分别各加 入缓冲液〇. 5mL和基质液0.5mL，然后充分混匀，37 °C水浴30分钟；
[0065]步骤四、在空白管、标准管和测定管中分别各加入碱液lmL和显色剂1.5mL，然后快 速混匀，静置10分钟，用空白管溶液于可见光分光光度计调零后，使用lcm光径于520nm处， 测标准管和测定管的光密度，分别记为标准0D值和测定0D值，然后代入如下公式计算得ACP 活性为 70 ? 01U/gprot:
[0066]
[0067] 其中，取样量为0.03mL，在37 °C时，每0.5h每克组织蛋白与基质产生lmg酚，为1个 ACP活力单位。
[0068] 将计算得鱼的ACP活性和标准曲线比对，得到待测水域的⑶2酸化的pH为7.57,这 样既可以知道水体已受到C〇2酸化，也可以从标准曲线中知道水体中的C〇2酸化的pH大小，更 能知道水体对生物体危害程度。
[0069] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 应用范例，它完全适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地另 行修改他用，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特 定的细节和这里示出与描述的实施例。
【主权项】
1. 一种利用鱼的ACP活性监测C02酸化水体的方法，其特征在于，获取需要检测的水域中 的鱼，并采用所述鱼的ACP作为敏感生物标记物。2. 根据权利要求1所述的利用鱼的ACP活性监测C02酸化水体的方法，其特征在于，所述 鱼的ACP活性与C0 2酸化水体的pH值大小呈负相关。3. 根据权利要求1或2所述的利用鱼的ACP活性监测C02酸化水体的方法，其特征在于，建 立鱼的ACP活性与C0 2酸化水体的pH值大小关系的标准曲线，然后将待检测水域中的同种同 大小的鱼的ACP活性与所述标准曲线比对，得到待检测水域中C0 2酸化水体的pH值大小。4. 根据权利要求3所述的利用鱼的ACP活性监测C02酸化水体的方法，其特征在于，采用 蛋白定量测定试剂盒、ACP测定试剂盒和可见分光光度计测定鱼的ACP活性。5. 根据权利要求4所述的利用鱼的ACP活性监测C02酸化水体的方法，其特征在于，所述 鱼的ACP活性测定包括如下步骤： 步骤一、待测样本处理:制备全鱼匀浆，然后离心分层，取上层清液为待测样本； 步骤二、待测样本蛋白浓度的测定:分别将等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本加入 1、2、3号管中，并分别向各管加入等量的考马斯亮蓝显色剂，分别混匀，静置，用分光光度计 并用双蒸水调零后，于lcm光径，在波长595nm处，测定1、2、3号管中物质的光密度，分别记为 1号0D值，2号0D值，3号0D值，然后代入如下公式计算得待测样本蛋白浓度：步骤三、在空白管中加入双蒸水0.03mL，在标准管中加入浓度为0. lmg/mL的酚标准应 用液0.03mL，在测定管中加入待测样本0.03mL，在空白管、标准管和测定管中分别各加入缓 冲液0.5mL和基质液0.5mL，然后充分混匀，37 °C水浴30分钟； 步骤四、在空白管、标准管和测定管中分别各加入碱液lmL和显色剂1.5mL，然后快速混 匀，静置10分钟，将空白管的溶液于可见光分光光度计上调零后，使用lcm光径于520nm处， 测标准管和测定管的光密度，分别记为标准OD值和测定OD值，然后代入如下公式计算ACP活 性：其中，取样量为〇. 〇3mL，在37°C时，每0.5h每克组织蛋白与基质产生lmg酚，定义为1个 ACP活力单位。6. 根据权利要求5所述的利用鱼的ACP活性监测C02酸化水体的方法，其特征在于，所述 步骤一中全鱼匀浆为全鱼与浓度0.65%的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，且所述离心 分层用冷冻离心机，ll〇28g，4°C，离心10min。7. 根据权利要求5所述的利用鱼的ACP活性监测C02酸化水体的方法，其特征在于，所述 步骤^中等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本均为〇 .〇5ml，蛋白标准品的浓度为0.563g/ L，分别加入考马斯亮蓝显色剂的量均为3ml，静置lOmin。8. 根据权利要求4-7任一项所述的利用鱼的ACP活性监测C02酸化水体的方法，其特征 在于，所述鱼为海水青鏘或淡水青鏘。
【文档编号】G01N1/28GK106053749SQ201610545356
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】许友卿, 丁兆坤, 刘永强, 唐旎, 张茜
【申请人】广西大学