代谢表型化的制作方法

专利名称：代谢表型化的制作方法
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生化反应生物体的全部“代谢表型”为其代谢属性的总和且由其遗传组成与“环境”的相互作用来决定，其中将所述的环境看作是最可能广泛的含义。术语“代谢表型”还可以适用于生物体代谢特征的各个方面。
各种顺序的生化反应(代谢转化)在生物体内发生且这些反应中的绝大部分由酶催化。
酶是起加速生化反应的生化催化剂作用的特定的蛋白质。如果没有酶，那么正常细胞活动所需的许多反应可能就不足以在正常身体pH和温度下快速进行。作为催化剂，酶增加反应速度，而在反应结束时可以以不改变的形式被回收。
通过酶起作用的分子称作“底物”且酶对特定的底物表现出极大的特异性，例如葡糖氧化酶氧化葡萄糖，而不氧化半乳糖。这种特异性由酶表面上的底物结合位点决定。该位点是提供对一种或多种底物的优选结合能力的氨基酸的特定排列。某些，酶具有广泛的底物特异性，而其它的酶对个别物质具有特异性。因此，例如己糖激酶使葡萄糖、甘露糖和果糖磷酸化，而葡糖激酶对葡萄糖具有特异性。
生物活性和分子生物学国际联合会(IUBMB)已经建立了具有6种主要酶类型的酶分类体系1.氧化还原酶2.转移酶3.水解酶4.裂解酶5.异构酶6.连接酶将这些类别中的每一种进一步分成各个酶所属的亚类。全部具体内容目前可以在国际互联网上得到(http//www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme)。
作为实例，胍乙酸N-甲基转移酶(EC 2.1.1.2)催化S-腺苷-L-甲硫氨酸和胍乙酸转化成S-腺苷-L-高半胱氨酸和肌酸。这是甲基转移酶的实例。
可以影响酶催化的反应的因素包括存在的底物的量、存在的产物的量、存在的酶的量和每种酶分子的活性。酶分子的活性可以受到各种因素影响，包括其内在活性、存在的辅因子和辅基以及结合在变构部位上。酶的量和每个酶分子的活性均可以受到受试者之间的遗传性变异的影响。酶的量和每个分子的活性合并成总体酶活性且这种活性在不同的受试者之间可以显著改变。这类变化可以独立地影响整个范围的不同酶和代谢转化且这种变化对每一受试者而言可以产生不同的总体代谢表型。进行生化转化所需的任何其它物质水平的变化也会产生代谢表型。例如，受试者之间UDP-葡糖醛酸(UDPGA)水平的变化可以导致受试者进行药物葡糖醛酸化作用的能力的改变。
尽管一般根据每催化的反应考虑代谢表型，但是代谢表型在其最广泛意义上还可以包括可能与某类受试者中发生的非每反应相关的调节。另外，受试者的总体代谢表型可以受到诸如肠细菌这类下受试者体内或体上存活的其它生物体的性质和量的影响。重要的是，尽管受试者的基因型在该受试者的整个生命过程中可以保持恒定，但是受试者的总体代谢表型可以随年龄和其它“环境”影响、诸如疾病、感染和营养状态的不同而改变。
代谢表型的变化导致异生物、诸如药物的代谢在受试者之间不同。治疗代谢上的差异是对给药物质产生不同反应(例如功效的程度、毒性的程度等)的主要因素，因为它们可以使与活性物质的接触程度不同。因此，例如，毒性物质快速代谢成非毒性代谢物可以导致快速解毒，而毒素的缓慢代谢者更能够使代谢作用减缓。相反，药物的有效成分或衍生物的快速代谢可以导致治疗功效降低。对给药物质产生不同反应的其它因素包括受试者之间在从肠中吸收和受体的不同敏感性上的差异。对毒物敏感性和反应上的遗传变异性综述在《毒理学通讯》(ToxicologyLetters)(2001)第120卷中，其文章标题为″对毒物的敏感性和反应上的遗传变异性″(“Genetic variability in susceptibility andresponse to toxicants”)，作者为Ingelman-Sundberg(259-268页)和Miller等(269-280页)。人体药物代谢上的个体间变异性是Pacifici和Pelkonen编辑且由Taylor和Francis(2001)出版的教科书《人体药物代谢的个体间变异性》(“Interindividual Variability in HumanDrug Metabolism”)的主题。
体液和代谢表型变化的作用胞内流体的生化组成方面在胞外组织中得到反映且由此在接触该组织的循环血液中得到反映。因此，细胞流体生化组成上的改变易于影响胞外组织流体的生化组成和血液的生化组成。血液组成的改变由此可以在改变的尿组成上得到反映。因此，异常的细胞代谢过程能够在生物流体、诸如血和尿的组成改变上得到反映且由此这些流体为身体状况提供了诊断窗。当给予毒素、诸如肝或肾毒素时，通常导致这类流体发生主要改变，而根据这些流体也可以鉴定内在因素，诸如主要的酶缺乏。
因此，例如，在经典丙酮酸尿中，苯丙氨酸羟化酶缺乏导致不能将苯丙氨酸转化成酪氨酸并产生改变的尿组成，其中苯丙酮酸、苯基乳酸和苯乙酸的水平升高(参见《具有临床相关性的生物化学教科书》(Textbookof Biochemistry With Clinical Correlations)，第4版，1997，T.M.Devlin编辑，Wiley-Liss出版)。这是代谢的遗传决定的错误的实例且这类疾病称作“先天性代谢缺陷”(例如，参见Newsholme和Leech，1983，《医药科学生物化学》(Biochemistry for the Medical Sciences)，JohnWiley and Sons出版)。对描述的尿改变的鉴定结果用于鉴定酶缺乏。
与严重的代谢缺陷一样，存在不足以导致正常代谢过程受到破坏且由此导致疾病的其它个体间代谢表型上较少的差异。然而，当生物体受到不常见的攻击、诸如大剂量特定化学化合物、例如药物物质攻击时，这类差异可以显示出来。另外，这类差异可以使诸如癌症这类与长期接触有害物质、诸如环境污染和烟草烟相关的疾病的危险因素改变。
生物样品的NMR光谱分析目前充分确立了核磁共振(NMR)波谱法在研究生物流体的低分子量组成上的应用(例如Nicholson和Wilson(1989)，“生物流体的高分辨率质子核磁共振波谱法”(High resolution proton magnetic resonancespectroscopy of biological fluids)-《NMR波谱法的发展》(Progressin NMR Spectroscopy)，21，449-501；Lindon等(1999)，“生物流体的NMR波谱法”(NMR spectroscopy of biofluids)-《有关NMR波谱法的年度报告》(Annual reports on NMR spectroscopy，38)。用于NMR的高磁场磁铁的出现已经成为这种研发中的一个因素。这类磁铁显著改善了所述技术的灵敏度且冷冻探子的应用带来了进一步的改善。用于检验复杂混合物的另一个有益方面在于磁场强度的增加使NMR信号的分散得到改善，即信号更为展开且几乎不易于彼此重叠。已经显著改善了现代NMR光谱法的能力的其它因素包括产生更高灵敏度的探头设计的改进、计算能力的便利有效性和例如用于选择性抑制含水样品中的水信号的改进脉冲序列的研发。流动探头的出现已经能够比常用的高精度、脆性玻璃样品管显著增加样品的通过量。
除在生物流体上的可用性外，NMR光谱法还可以成功地用于检验小(约10-20mg)样品的固体组织(例如Moka等(1997)，“对完整的肾组织样品进行的幻角自旋质子核磁共振光谱分析”(Magic angle spinningproton nuclear magnetic resonance spectroscopic analysis ofintact kidney tissue samples)-《分析通讯》(AnalyticalCommunications)，34，107-109)。然而，这需要称作幻角自旋(MAS)的特定技术且与溶液状态的NMR光谱法相比，MAS-NMR光谱法是耗时的手段。由于使用了自动溶液状态的NMR光谱法，所以每天能够检验150份以上的样品，而就MAS-NMR光谱法而言，每天一般只能检验10份样品，其中由操作者手动改变样品。
大量有机化合物含义可以通过1H NMR光谱法检测到的质子，条件是在所分析的样品中存在足够的化合物，这意味着1H NMR光谱法基本上是用于有机化合物的最通用的检测器。对来自特定样品成分的1H NMR光谱信号的检测限取决于所含成分的量、类型和质子的分子环境以及NMR实验的性质。主要局限在于不能观察到可交换的质子，诸如羟基上的那些质子。任何特定的有机化合物的1H NMR光谱对该化合物而言基本上是唯一的。另外，NMR光谱易于解释和预测，从而可以根据其1H NMR光谱推定化合物的结构特征且通常是完整的结构。
在生物流体通常的一维(1D)1H NMR光谱中，所有可检测到的成分的各自光谱根据其相对的浓度而言均为叠加的且这有利于定量。实际上，信息中特别富含生物流体、诸如尿和血浆的高场1H NMR光谱，而在单一实验中可以检测到极大量的低-中分子量成分。脂蛋白和诸如蛋白质这类高分子量成分也存在于血浆中，而其1H NMR光谱受到因共振核运动受限产生的信号增宽的影响。这类增宽减少了来源于这类成分和有关这类成分的信息量。
生物流体NMR光谱法的应用与NMR光谱法相比，传统的临床化学试验提供了更确切的定量且还提供了更好的检测极限。另一方面，1H NMR光谱检验超过传统临床化学的显著优点，即前者在单一实验中测定所有可检测到成分的水平而不需要指定成分需要分析。因此，通过1H NMR光谱法可以观察到令人意外的改变且可以鉴定预先未识别的物质。因此，1H NMR光谱法具有用于非常规研究的作为同时多分析物检测器的巨大能力且非常适合于检测新的生物标记。
使用鉴定和跟踪对毒素的反应的NMR光谱法分析给药后体液是公知的(例如Holmes等(1992)“与氯化汞(II)和2-溴乙胺诱发的大鼠肾中毒性损害的进展和恢复相关的生化过程的NMR光谱法和模式识别分析”(NMR spectroscopy and pattern recognition analysis of thebiochemical processes associated with the progression andrecovery from nephrotoxic lesions in the rat induced bymercury(II)chloride and 2-bromoethanamine)-《分子药理学》(Mol.Pharmacol.)，42，922-930)。在毒理学研究的背景中，生物流体NMR光谱法可以检测给药物质的代谢物和/或给药物质诱导的内源性生物流体成分的改变且可以用于评价毒性作用和鉴定相关的防御过程，诸如葡糖醛酸化作用和硫醚氨酸形成。生物流体NMR光谱法还具有阐明毒性机制的显著潜能。
已知使用NMR光谱法易于从生物流体样品中鉴定机制中的某些先天性代谢缺陷(例如Moolenaar等(2003)“先天性代谢缺陷领域中体液的质子核磁共振光谱”(Proton nuclear magnetic resonancespectroscopy of body fluids in the field of inborn errors ofmetabolism)-《临床生物化学年鉴》(Ann.Clin.Biochem.)，40，1，16-24)。还已知可以将生物流体的NMR光谱用于诊断其它疾病情况和跟踪对疗法的反应。
在用基于NMR的手段监测生命系统代谢状态成功后，产生了术语“metabonomics”(Nicholson等(1999)，““Metabonomics”通过NMR光谱数据的多元统计分析理解生命系统对病理生理刺激的代谢反应”(“Metabonomics”understanding the metabolic responses of livingsystems to pathophysiological stimuli via multivariatestatistical analysis of biological NMR spectroscopic data)-《异生物》(Xenobiotica)，29，1181-1189)。将Metabonomics定义为“生命系统对病理生理刺激或遗传修饰的多参数代谢反应的定量测定”。Metabonomics与基于分别检测基因表达改变和蛋白质水平的基因组和proteomics技术互补。与其它技术相关的metabonomics的优点在于metabonomics着眼于总体代谢结果而不是在代谢上可以显著或可以不显著的基础影响。
模式识别从生物(生物流体或组织-衍生的)NMR光谱组中提取有用的生化信息中的复杂因素是其巨大的复杂性。用于研究这些复杂多参数数据组的有效方式为使用基于计算机的模式识别法。
模式识别(PR)是用于多元数据分析方法的一般术语，所述的多元数据分析方法可以用于寻找数据组的模式或由此用于寻找与其它已知因素相关的数据要素(例如，参见Beebe等，1998，《化学计量法实用指南》(Chemometrics，A Practical Guide)，John Wiley and Sons，NewYork等)。其中固有的是数据组由大量不同的已经测定各种参数(或“变量”)的对象组成的假定。无论那些参数如何，一般对所有数据中的对象测定相同的参数，不过，偶然缺少的值也是可以接受的。在一组NMR光谱中，不同的对象可以是不同的光谱，而各种参数一般为全部光谱中的不同特定窗的积分。便利的是将PR法分类为“有监督的”或“无监督的”且下面的部分中描述了这些多元统计分析法中的某些描述在。
无监督PR法无监督PR法用于测定多元数据组中固有聚类模式而不涉及任何其它独立的知识。无监督模式识别法的实例包括主成分分析(PCA)、系统聚类分析(HCA)和非线性制图(NLM)。
主成分分析(PCA)主成分分析(PCA)(例如Sharaf等，1986，《化学计量法》(Chemometrics)，J.Wiley和Sons，New York)是最有用和最便于应用的无监督PR技术之一。主成分(PCs)是由初始变量与适宜的加权系数的线性组合生成的潜在变量。这些PCs的特性使得(i)各PC与所有的其它PCs正交(即与之不关联h)；和(ii)第一个PC含有最大部分的数据组(信息量)变化且随后的PCs含有相当少量的变化。
在数学术语中，可以将数据矩阵X看作由“取分”矩阵T和“加载矩阵”P组成，使得X＝TPt，其中上标“t”表示转置。根据数据矩阵X计算协方差矩阵C。然后通过对角化确定协方差矩阵的特征值和特征向量。特征向量图上的不同对象(主分量或PCs)的坐标以“取分”表示且包括取分矩阵T。特征向量系数以“加载”表示且包括加载矩阵P并得到PCs的描述符。
任意两种主分量取分的图通常称作“取分图”。PC1与PC2的取分图提供了二维形式的最大信息量，不过，低级PC图可能也是有用的。这类取分图可以用于显示数据组中的固有聚类。
有监督法如果合适，有监督模式识别法也可以用于分析多元数据。在这类分析中，如果可能，数据组(X)与一个或多个已知因素(Y)相关，诸如分类隶属度或X数据组外的一个或多个参数值。在这类方法中，X和Y数据“串连组”用于构建根据X数据估计所需的Y因素的统计“模型”。然后用独立的数据(称作验证数据组)测试这种模型以便确定其稳定性和预测能力。一旦得到验证，则该模型可以合理地用于预测样品的相关Y因素，其中仅得到X数据。
有监督模式识别法的实例包括如下方法分类分析的软独立模拟(soft independent modelling of class analysis)(SIMCA)；偏最小二乘分析(PLS)；线性鉴别分析(LDA)；K-最近邻分析(KNN)；人工神经网络(ANN)；概率性神经网络(PNNs)；法则归纳法(RI)；和Bayesian法。例如，参见(re.S IMCA)Wold(1976)“通过不相交主分量模型进行的模式识别”(Pattern recognition by means of disjoint principalcomponents models)-《模式识别》(Pattern Recog.)，8，127；(re.PLS)Frank等(1984)“使用偏最小二乘法预根据光谱数据预测产品质量”(Prediction of product quality from spectral data using thepartial least squares method)-《化学信息组合杂志》(J.Chem.Info.Comp.)，24，20(re.LDA)Nillson，1965，《学习机器》(LearningMachines)，McGraw-Hill，New York)；(re.KNN)Beebe等，1998，《化学计量法实用指南》(Chemometrics，A Practical Guide)John Wileyand Sons，New York等(re.ANN)Anker和Jurs(1992)“通过人工神经网络预测C-13核磁共振化学位移”(Prediction of C-13 nuclearmagnetic resonance chemical shifts by artificial neuralnetworks)-《化学年鉴》(Anal.Chem.)，64，1157(re.PNN)Speckt(1990)Probabilisticneural networks-《神经网络》(Neur.Networks)，3，109(re.RI)Quinlan(1986)“决策树的诱导”(Inductionof decision trees)-《机器学习》(Machine Learning)，1，81；(re.Bayesian Methods)Bretthorst，1990，“使用Bayesian概率原理对参数估计的引入”(An introduction to parameter estimation usingBayesian probability theory)-Maximum Entropy和Bayesian Methods，Ed.Fougere，Kluwer Academic Publishers，The Netherlands，53-79。
偏最小二乘(PLS)PLS是上述描述的PCA法的回归延伸。在PLS中，数据矩阵X中的对象之间的变化由X-取分T描述且所针对的回归的Y-块变化以Y-取分U描述。PLS进行的内容基本上使T与U之间的协方差达到最大值。就PLS模型而言，计算一组PLS重量W，它含有各X-变量对Y变化的解释的影响。相应组的Y-块重量命名为C。还计算了X-加载矩阵P。这些加载矩阵用于解释和进行X的适当分解。
X和Y的PLS分解由此可以如下描述X＝TPt+EY＝TCt+F其中E和F分别为X和Y残值且上标“t”表示相关矩阵的转置。
然后通过下列公式得到PLS回归系数BB＝W(PtW)-1Ct随后可以按照下列公式计算Y的估计值YestYest＝XW(PtW)-1Ct＝XB偏最小二乘鉴别分析(PLS-DA)PLS-DA是产生数据矩阵(X)中的“潜在”变量的有监督多元法，所述的潜在变量描述了已知类对象(Y)之间的最大间距。PLS-DA基于上述PCA法的回归延伸。而PCA便利地起运转以找到描述研究对象中存在的最大变化，PLS-DA运转以找到已知类对象之间的最大间距。这一过程通过对携带类信息的“假”向量或矩阵(Y)的PLS回归来进行。计算的PLS分量由此集中在描述分离(Y)类的X的变化上，条件是该信息存在于数据中。在实际模拟前必须已知分级隶属度。一旦计算和验证了模型，则它可以合理地用于预测未知类对象的分类隶属度。
神经网络-PLS和PLS-DA诸如PLS和PLS-DA这类方法依赖于输入变量之间的线性相关性的提取且它可以明显性质分析能力。基于神经网络的模式识别技术可以通过改进的预测能力，特别是在预测的因素受到许多不相关的原因影响时。尽管如此，但是诸如PLS和PLS-DA这类方法通常具有足够的能力并提供相对超过“黑匣子”神经网络法的显著有益性，即它们使某些信息易于获得，其作为输入数据组的方面在模型建立中特别重要，即与神经网络模型相比，PLS和PLS-DA模型在解释方面更为清楚。
PR法用于metabonomic数据模式识别法已经用于分析metabonomic数据，包括例如复杂NMR光谱数据，且有一定程度的成功。例如，参见Anthony等(1994)“基于来源于尿的质子核磁共振光谱的中毒性肾损害部位的模式识别分类”(Pattern recognition classification of the site ofnephrotoxicity based on metabolic data derived from protonnuclear magnetic resonance spectra of urine)-《分子药理学》(Mol.Pharmacol.)，46，199-211；Beckwith-Hall等(1998)“对三种模型肝毒素的生化作用的核磁共振光谱和主分量分析研究”(Nuclearmagnetic resonance spectroscopic和principal componentsanalysis inyestigations into biochemical effects of three modelhepatotoxins)-《化学毒理学研究》(Chem.Res.Tox.)，11，260-272；Gartland等(1990)“尿的高分辨率1H NMR光谱的模式识别分析。毒理学数据分类的非线性制图手段”(Pattern recognition analysis ofhigh resolution1H NMR spectra of urine.A non-linear mappingapproach to the classification of toxicological data)-《生物医学中的NMR》(NMR in Biomedicine)，3，166-172；Holmes等(1992)“与氯化汞(II)和2-溴乙胺诱发的大鼠肾中毒性损害的进展和恢复相关的生化过程的NMR光谱法和模式识别分析”(NMR spectroscopy andpattern recognition analysis of the biochemical processesassociated with the progression and recovery from nephrotoxiclesions in the rat induced by mercury(II)chloride and2-bromoethanamine)-《分子药理学》(Mol.Pharmacol.)，42，922-930；Holmes等(1994)“用于分析来自正常和病理状态的人尿的1H NMR光谱的自动数据还原和模式识别法”(Automatic data reduction andpattern recognition methods for analysis of1H NMR spectra ofhuman urine from normal and pathological states)-《生物化学年鉴》(Anal.Biochem.)，220，284-296。
数据过滤尽管模式识别法可以用于“未过滤的”数据，但是通常优选过滤数据以除去无关的变化。这类过滤需要一定程度的有监督以取分有关与无关的变化。
一种数据过滤的方法单纯包括删除选择的光谱区且然后使用剩余部分进行工作。因此，例如在使用水消除获得的含水样品的1H NMR光谱中，残余水信号的数量根据水消除的有效性改变且可以删除这些无关信号。
另一方面，可以通过“正交过滤”除去与所关注的变化无关(即与之正交)数据变化。一种优选的正交过滤法通常称作正交信号校正(OSC)，其中除去与所关注的变化正交的潜在变量(Wold等(1998)“近红外光谱的正交信号校正”(Orthogonal Signal Correction of NearInfrared Spectra-《化学计量和智能实验室系统》(Chemometrics andIntelligent Laboratory Systems)44，175-185)。
正交信号校正OSC法使模式与Y-向量无关的对象之间的X变化的最长向量定位并从数据矩阵中除去将其除去。由此过滤了所得数据组以使模式识别集中于与所关注特征有关而不是无关的对象群中的变化，即正交变化。每当必要时可以重复该过程，条件是应避免“过于配合”。
在PLS中，计算重量W以使X与Y的协方差达到最大值。相反，在OSC中，计算W以使使X与Y的协方差达到最小值，如果可能，这与计算与Y接近正交的要素相同。然后可以从光谱数据X中扣除这类与Y正交且由此含有不需要的变化的要素而产生集中在所关注的变化上的过滤的预示矩阵。
如果PCA提示分离了不同的类别，那么可以将正交信号校正(OSC)用于使这种分离最优化，由此改善随后的多元模式识别分析的性能并提高模型的预测能力。
模拟和预测在PLS、PLS-DA和神经网络分析中固有的是使用来自已知特性或类型的样品的“建立模型”或“模拟”数据建立数学“模型”的构思。
一旦计算了模型，则可以使用已知体系或类型的并非用于计算模型的样品的数据验证它。在这种方式中，可以测试模型的预测能力。一旦得到验证，则可以将这类模型合理地用于预测未知体系或类型的样品的体系或类型(测试数据)。分析前，必须按照与模拟数据相同的方式处理测试数据，包括应用任何过滤。
任何特定的模型仅等同于用于使其公式化的数据。因此，优选所有模拟和测试数据获自相同(或相似)条件下且使用相同(或相似)实验参数的相差无几的个体。
表型化的现有技术可以通过无监督PR法、诸如PCA检验来自代谢未攻击的受试者(即未给药)的生物流体NMR光谱组内的变化且在恒定实验条件下有时可以观察到不同的分类(例如Bollard等(2001)“使用尿的高分辨率(1)HNMR光谱法和模式识别对因雌性大鼠昼间变化和发情期导致的生化改变的研究”(Investigations into biochemical changes due to diurnalvariation and estrus cycle in female rats using highresolution(1)HNMR spectroscopy of urine and patternrecognition)-《生物化学年鉴》(Anal.Biochem.)，295，2，194-202)。
然而，该方法不一定提供有关与代谢转化相关的不同分类的有意义的清楚信息(例如Baud-Camus等(2001)“使用咖啡因作为代谢探子和带有紫外检测或电雾化质谱的高效液相色谱法测定N-乙酰化表型”(Determination of N-acetylation phenotype using caffeine as ametabolic probe and high-performance liquid chromatography witheither ultraviolet detection or electrospray massspectrometry)-Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.，760，1，55-63)。
通过检验可以对不同基团之间提供鉴别的光谱特征，能够对分离的意义做出解释。然而，这是无法提供有意义的证据的不可靠和非目标的手段且它为极其无效的检验潜在的精细和复杂的变化的方式，这种精细和复杂的变化与不同的代谢表型有关。
相反，在目标手段中，在给予测试物质(就乙酰化者表型而言，诸如咖啡因)以确立受试者进行特定的代谢转化的能力后，已知使用应用NMR光谱法或其它技术在生物流体中检测成分的模式。换句话说，可以将NMR光谱法和其它技术用于使用给药后生物流体的代谢表型。在这些分析中，所关注的成分通常为未改变的给药物质和/或其代谢物。为简明起见，下文将术语“给予的化合物的代谢物”看作包括给予的化合物自身。通常可以将这类成分的比例测定为相关代谢能力的范围。从这类分析中能够确定受试者在整个不同的代谢转化方面的能力，这取决于合适的测试物质的有效性。然而，一般来说，预计受试者进行一种类型转化的能力与其所有其它转化方面的能力无关。因此，可以预计当研究受试者在各种生化转化方面的能力时，需要多种测试物质。尽管偶然进行这类分析，但是不必对人或动物受试者给予任何物质在安全性和道德论理范围上是不理想的，而广泛应用这类方法是不可能的。其它复杂情况在于给予测试物质可能导致酶诱导作用，从而在一定时间后使代谢状态改变。因此，例如，这类表型化可能是与毒性研究相关的难题。
本文所用的术语生物标记一般指的是受试者或受试者样品中的化学或生物化学本体或统计学上相关的本体组合或具有与其存在、不存在或水平相关的重要性的受试者中的生理反应、即表示特定的生理状态、疾病或毒性过程或易倾向于特定类型代谢或疾病过程的生理反应且还可能与临床结果相关。
这类生物标记的实例包括化学和生物分子，例如代谢底物、中间体或产物、结构蛋白、核酸、转运和受体蛋白、免疫蛋白、与代谢或遗传控制相关的蛋白、催化蛋白、酶及其相关因子。其它生物标记的实例还包括生物过程的活性、例如基因表达的水平和细胞信号传导途径的活性水平。
可以理解术语生物标记还指的是与上述分子或过程的存在、不存在或水平相关或特征为上述分子或过程的存在、不存在或水平的任意可测定的信号；例如由测定值的输出获得的信号或模式，所述的测定值通过诸如核磁共振(NMR)波谱法和/或任意其它化学分析技术、诸如质谱法(MS)、红外(IR)光谱法、气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)这类技术或通过使用这类技术的任意整体组合、例如GC-MS取得。
本文所用涉及样品的术语化学组成包括化学和/或生化种类的组合，所述的化学和/或生化种类包括所述的样品。
本文所用涉及样品的术语物理参数包括通过下列方法获得的物理测定值诸如色谱法、衍生、分级分离和分离、结晶、沉降、光谱分析、分子量分析、衍射、溶解度分析、浊度、折射率或电阻率、熔点或沸点分析。
本发明本发明涉及鉴定受试者代谢表型的方法并涉及预测受代谢表型影响的反应的方法和受其影响的危害因素的测定方法。本发明特别包括鉴定受试者代谢表型和通过分析该受试者生物流体预测受试者对一种或多种治疗的反应的方法。
如上所述，已经确认的代谢表型化的手段依赖于对受试者给药且任何分析给药后生物流体。与该手段基本上不同的是，本发明基于令人意外的发现，即生物流体中的给药物质的代谢物水平的变化与给予该物质前生物流体方代谢物分布的变化之间存在相关性。因此，本发明能够在给予该物质前预测受试者对物质的反应。此外，本发明能够测定受试者的代谢表型而无需对该受试者给予测试物质。显然，如果具有产生不良反应的能力，那么它非常适用于能够预测受试者在例如药物治疗中的反应。另外，由于上述原因(安全性、伦理和酶的诱导作用)，非常有利的是能够测定受试者的代谢表型而无需进行任何给药。这种新的且根本不同的方法为寻找给药前与给药后性能的关系提供了具有显著目标的手段。
因此，本发明在一个方面中提供了建立模型的一般方法，使用该模型可以预测受试者对能够对该个体给予的物质的反应。在该方法中，可以对有代表性的受试者群体、下文称作模型建立群体模型建立群体给予给药物质。可以在所有模型建立群体的成员中测定所关注的反应，无论通过何种方式都是合适的。可以通过1H NMR光谱法或通过另一种合适的技术(例如近红外光谱法、高效液相色谱法、质谱法或气相色谱法)或通过这类技术的组合检验从给药前模型建立群体中采集的生物流体或其它样品。给药前和给药后反应数据可以共同构成模型建立数据。化学计量模式识别(PR)技术、诸如PLS或PLS-DA可以应用于模型建立数据以使给药后反应的变化与给药前数据的变化之间发生相联系。有时可以在PR前将数据过滤法、诸如OSC用于除去给药前数据中无关的变化。一旦得到建立和验证，则可以将模型与来自一个或多个测试受试者或与模型建立群体相似类型的受试者的合适的给药前数据结合使用，其中需要预测对相同物质的反应。一般来说，对所关注的每种物质需要新的模型，不过，可以将对一种物质衍生的模型与极为相关的物质结合使用。
本发明在另一个方面中提供了建立模型的一般方法，使用该模型可以表征受试者代谢表型的一种或多种成分。在该方法中，可以谨慎选择给予的物质和该物质的量以攻击所关注的特定代谢转化。可以对有代表性的受试者群体、下文称作模型建立群体给予选择的物质。如果便利，可以通过1H NMR光谱法或通过群体合适的方式测定给药后生物流体或其它样品中所关注的代谢物。根据这种分析可以测定每一受试者在相关代谢转化方面的能力范围。可以通过1H NMR光谱法或通过另一种合适的技术(例如近红外光谱法、高效液相色谱法、质谱法或气相色谱法)或通过这类技术的组合检验从给药前模型建立群体中采集的生物流体或其它样品。给药前和给药后“代谢能力”测定值可以共同构成模型建立数据。化学计量模式识别(PR)技术、诸如PLS或PLS-DA可以应用于模型建立数据以使给药后能力测定值的变化与给药前数据的变化之间发生相联系。有时可以在PR前将数据过滤法、诸如OSC用于除去给药前数据中无关的变化。一旦得到建立和验证，则可以将模型与来自一个或多个测试受试者或与模型建立群体相似类型的受试者的合适的给药前数据结合使用，其中需要测定对相关代谢能力或多种能力。
本发明在第一个方面中提供了模型的产生方法，使用该模型可以表征对受试者不给予测试物质的那些受试者的代谢表型的选定方面或使用该模型可以在不给药的情况下预测受试者给药后的反应，其中这些反应依赖于代谢表型，该方法包括下列步骤获得与给予给药物质前多个受试者相关的给药前数据；获得与给予给药物质后多个受试者相关的给药后数据；将给药前数据中受试者之间的变化与给药后数据中受试者之间的变化建立相关性并且基于观察到的相关性生成给药前-给药后预测模型。
所述的给药前和/或给药后数据可以获自生物流体的样品，所述的生物流体诸如尿、血、血浆、血清、唾液、汗、泪、呼气或呼气冷凝物；或获自为植物组织、植物流体或匀浆物、植物提取物或植物渗出物的样品，包括，例如精油；或获自为人或动物组织、鱼组织或鱼油、组织提取物、组织培养物提取物、细胞培养物上清液或提取物或来源于微生物的样品。所述的给药前和/或给药后数据可以包括与化学组成和/或物理参数相关的数据。
在分析前处理所述的给药前和/或给药后样品或受试者(例如用一种或多种化学试剂处理以便产生一种或多种现有物质的衍生物)以便例如增加数据回收或改善样品的稳定性。
所述的给药前和/或给药后数据来源于核磁共振(NMR)波谱法和/或任意其它化学分析技术或为使用核磁共振(NMR)波谱法和/或任意其它化学分析技术或通过使用这类技术的任意集中组合、例如GC-MS获得的组合数据，所述的任意其它化学分析技术诸如质谱法(MS)、红外(IR)光谱法、气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)。
所述的给药前和/或给药后数据可以为物理数据或来源于其中的数据。
优选通过给予合适的物质对多种生化转化中的每一种生成表面化模型。类似地，通过给予合适的物质可以对多种给药物质中的每一种建立反应预测反应。
在模式识别前，通过取现有变量的比例和/或其它现有变量的其它组合可以扩展原始给药前数据组。例如，可以通过形成包括获得数据的比例或多种比例的其它数据达到这一目的。
就一组给予任意特定物质的受试者而言，可以将模式识别法用于鉴定给药物质的可变代谢模式或对该物质的可变反应。可以有监督或无监督模式识别法用于鉴定与给药后数据中所关注的变化相关的给药前数据中的变化。
可以将数据过滤法、诸如正交信号校正(OSC)用于除去与给药后数据中所关注的变化无关的给药前数据中的变化。
该方法可以用于鉴定对代谢表型通过信息或可以用于预测对给药的反应的生物标记或生物标记的组合。
本发明在第二个方面中提供了测定受试者代谢表型的选定方面的方法，该方法包括下列步骤分析涉及与模型相关的未给药的受试者的数据，所述的模型描述了与多个受试者相关的给药前与给药后数据的相关性，对所述的多个受试者给予了可攻击所关注的生化转化或途径的特定物质；按照预定的模型标准产生可描述未给药的受试者的代谢表型的确定数值或分类。
预定的模型标准包括一种或多种数据等式，这些等式定义了给药前与给药后数据之间的关系并基于给药前数据表征了受试者且鉴定了属于异常值的测试数据。
与未给药的受试者相关的数据获自生物流体，诸如尿、血、血浆、血清、唾液、汗、泪、呼气或呼气冷凝物；或获自植物组织、植物流体、植物匀浆物、植物提取物或植物渗出物，包括例如精油；或获自人或动物组织、鱼组织或鱼油；或获自组织提取物、组织培养物提取物、细胞培养物上清液或细胞培养物提取物；或获自来源于微生物的样品；或获自在增加数据回收或样品稳定性的处理后上述样品类型中的任意一种。
可以使用核磁共振(NMR)波谱法和/或任意其它技术或提供任意的技术组合产生与受试者相关的特征组合和/或物理数据。
可以将表型化方法用于进行代谢表型影响的危害评价的目的和/或用于目标为具体的健康监测方案的应用目的和/或用于目标为预防/预防性治疗的应用目的和/或表征保险目的的风险的目的和/或为任意其它目的、例如生育筛选受试者的目的。
本发明在另一个方面中提供了预测受试者对给药物质的反应的方法，该方法包括下列步骤分析涉及与模型相关的未给药的受试者的数据，所述的模型描述了与多个给予了特定给药物质的受试者相关的给药前与给药后数据的相关性；并可以按照预定的模型标准预测受试者应接受的物质的最大或最小剂量以及受试者应接受的给药物质的量。还可以预测应对受试者给药的频率和受试者应接受的物质的剂量的次数。可以选择受试者所用的适宜控释制剂。
可以使用核磁共振(NMR)波谱法和/或任意其它技术或提供使用任意的技术组合产生特征组合和/或物理数据。
测定受试者代谢表型的选定方面或预测受试者对给药物质的反应的方法可以进一步包括下列步骤分析与未给药的受试者在预先鉴定的一种或多种生物标记方面相关的数据。所述的生物标记可以与一种或多种试剂反应而产生可见的改变，诸如颜色改变。优选通过使涉及给予给药物质前多个受试者的给药前数据与涉及给予给药物质后多个受试者的给药后数据建立联系来选择生物标记。
可以将该方法用于未实验室实验或临床试验或其它目的筛选一组表型上均一或相似的受试者。
该方法可以基于生物流体或组织的给药前分析而用于使实验数据的生物学变化合理化，其中这类变化是因表型异质性所导致的。
数据可以作为整体基于取自受试者的物理和/或化学测定值。这类测定值的实例未血压、心率、流量峰值、身高、体重等。
给药后数据可以描述与给药前状态相关的改变，例如用降血压药治疗的人体受试者的血压降低。
优选确定与特定模型和/或方法极限不一致的测试数据。
所述的受试者可以为动物，特别是哺乳动物，诸如人、小鼠、大鼠、猪、母牛、公牛、绵羊、马、狗或家兔或任意农场动物或任意动物，诸如用于运动或繁殖目的的赛马。另一方面，所述的受试者可以为植物、鱼或任意其它水生生物体或生物组织、组织培养物、细胞培养物或微生物培养物。
数据可以获自有代表性的、或被认为有代表性的一组被视为单一受试者的受试者。
例如，可以将来自大量类似受试者(例如植物)的样品彼此研磨并将所得物质用于获得视为与单一植物受试者相关的数据。
给药物质可以为任意物质或物质的混合物或制剂，尤其是包括研究或开发中的可能成为药物或医疗物质的药物或医疗物质，还包括例如毒素、杀虫剂、除草剂、食品或饲料物质、食品或饲料添加剂；和任意种类的流体，包括液体、气体、蒸汽和烟，例如烟草的烟。
可以通过任意方式或途径以主动或被动方式在任意时间期限内给予在任意基质或介质中的给药物质，所述的任意方式或途径包括例如通过注射、通过食用、通过饮用、通过吸入或通过吸烟，所述的任意时间期限包括受试者的终生或其任意具体的组成部分或部分，这类给药包括因环境接触或污染或因医疗、牙科、兽医或外科手术导致的给药。
可以将该方法用于鉴定不对受试者给予测试物质的该受试者的乙酰化者表型。另外或可选地可以将该方法用于预测受试者对给予物质的反应，其中该反应依赖于乙酰化者表型。
该方法可以用于预测受试者对异烟肼诱导的毒性或半乳糖胺诱导的毒性的敏感性。
本发明还涉及产生模型的设备。
本发明在另一个方面中提供了用于反应预测和/或用于代谢表型化的设备，该设备包括一种或多种模型，每种模型模拟与多个给予了特定给药物质的受试者相关的给药前和给药后数据的相关性；处理器，它用于分析涉及与模型中的至少一种相关的未给药的受试者的数据且由此测定未给药的受试者的代谢表型的一个或多个方面或预测其对按照所用模型给药的反应。
另外或可选地将该设备进一步用于产生一种或多种模型，使用该模型可以表征对受试者不给予测试物质的那些受试者的代谢表型的选定方面或使用该模型可以在不给药的情况下预测受试者给药后的反应，其中这些反应依赖于代谢表型，该设备用于获得与给予给药物质前多个受试者相关的给药前数据；获得与给予给药物质后多个受试者相关的给药后数据；并将给药前数据中受试者之间的变化与给药后数据中受试者之间的变化建立相关性且基于观察到的相关性生成给药前-给药后预测模型。
优选该设备可以进一步包括一种或多种用于进行物理和/或化学分析的分析仪器和装置，所述的物理和/或化学分析诸如NMR波谱法、质谱法、红外光谱法或高效液相色谱法。
该设备还可以用于鉴定一种或多种生物标记，特别是基于如上所述鉴定的一种或多种生物标记的应用进行反应预测或代谢表型化。
本发明在另一个方面中提供了用于代谢表型化或用于预测受试者对给药的反应的设备，该设备包括在测试条件下接受来自受试者的样品的测试区，所述的测试区导入了一种或多种试剂，这些试剂可以与样品中的一种或多种生物标记发生化学反应而在测试区产生可见表象的改变，已经预先如上所述鉴定了所述的生物标记且产生的测试区的可见表象为代谢表型的特征或对给药反应的预测。
优选该设备可以确定对受试者合适的给药方案。
该设备基于对特异性生物标记增加的抗体的应用。可以通过酶催化的反应、例如使用固定在固相支持物上的酶检测选择的生物标记和/或对其进行定量。
本发明还涉及包括通过本发明方法产生的一种或多种模型的设备。
该设备可以进一步用于确定与特定模型的极限无关的测试数据。
本发明还具有许多应用(1)不需要矫正疗法的“良好”的受试者能够进行下列步骤的代谢表征(表型化)-危险评价，例如特别与某些表型相关的膀胱癌。
-特定健康监测方案、如果合适例如在高危受试者中进行的特定健康监测方案的靶向适用。
-预防/预防性治疗、如果合适即在高危受试者中进行的预防/预防性治疗的靶向应用。
-为保险目的对与受试者相关的危险程度的鉴定。
-具有所需特征的受试者、例如在繁殖的农场动物中的筛选。
-为实验室或临床实验进行的受试者表型上均一亚类的筛选。
(2)需要药物、医疗、牙科、兽医或其它治疗的受试者受试者代谢表征(表型化)和/或预测受试者对给药或治疗的反应，能够-通过不对易受损受试者给药或通过降低药物剂量和/或频率和/或治疗给药的期限避免不良药物反应(例如昏迷、致命)。
-预测药物治疗的少量副作用的发生和严重程度(例如恶心、倦睡)。
-基于维持活性药物物质在体内的适当水平、同时将副作用减少到最低限度的最佳药物治疗的选择(化合物、剂量、剂量频率和治疗过程的期限)。
-避免与医疗、牙科、兽医手术和物质、例如麻醉剂、诸如氟烷相关的不良反应。
-适宜的医疗、牙科或兽医手术或治疗的选择。
(3)药物的研发和许可可以许可在不同受试者中具有不同作用(例如功效、毒性)的药物，条件是可以进行给药前代谢表型化和由此适应治疗。这一结果能够-“磨耗”因在功效或毒性上的可变反应而减少(在药物研发过程中放弃化合物)。
-恢复/再次许可某些未得到批准的药物，其中有效性或毒性上的问题限于某些受试者亚群而非作为整个的群体。
在与药物研发相关的研究(例如对毒性或功效)中，给药前毒性表型化能够-解释可变的结果，其中该变化是因不同受试者之间或不同受试者亚群之间的表型差异所致。
-具有某些所需代谢特征的所需试验组的筛选。
(4)生物标记鉴定合适的模型不对测试数据进行直接分析，而是可以用于鉴定可测定代谢表型或预测通过代谢表型测定的反应的生物标记或生物标记的组合。由于建立了相关的生物标记，所以可以基于这些生物标记研发简便的分析方法，例如尿测验片法或HPLC法。这一方法可以减少对复杂技术、诸如NMR光谱法的依赖且能够进行更远程的测试，例如在当地的实验室、制药公司、医院或医生的手术室中。
现在仅通过实施例并参照附图来进一步描述本发明，其中附

图1.1表示给予半乳糖胺HCl(缩写GalN HCl)(800mg/kg)后半乳糖胺的可变尿排泄；附图1.2表示给予GalN HCl(800mg/kg)后N-乙酰化种类的可变尿排泄；附图1.3表示反应者中GalN HCl(800mg/kg)诱导的尿的某些改变；附图1.4表示给予半乳糖胺HCl(800mg/kg)后马尿酸盐和组氨酸在尿排泄中的改变；附图1.5表示来自半乳糖胺研究中第1天(给药前)尿NMR光谱的PCA的PC1对PC5的取分图；附图1.6表示来自半乳糖胺研究中第1天(给药前)尿NMR光谱的PCA的PC1对PC5的加载图；附图2.1表示从对雄性Sprague-Dawley大鼠给予异烟肼(400mg/kg)后0-7小时采集的尿样的NMR光谱中观察到的N-乙酰化代谢物的不同模式的实例；附图2.2表示来自给予异烟肼(200mg/kg)动物的第1天尿样(给药后0-7小时)的NMR光谱N-乙酰基区(δ2.23-δ2.13)PCA的PC1对PC2的取分图；附图2.3表示异烟肼代谢的两个可选起始途径；附图3.1表示从给予异烟肼(200mg/kg)后0-7小时采集的尿样的NMR光谱中比值(峰高“a”/峰高尿囊素)的给药前预测；附图3.2表示涉及产生附图3.1中所述结果的PLS分析的回归系数；附图3.3表示对从给予大鼠异烟肼(200mg/kg)后0-7小时采集的尿中排泄的代谢物C的量的给药前预测；附图3.4表示对从给予大鼠异烟肼(200mg/kg)后0-7小时采集的尿中的比值[(部分C)/(部分A+B)]的给药前预测；附图3.5表示与附图3.4相关的模型的体内验证。
附图3.6表示用于体外试验组的[(部分C)/(部分A+B)]的给药前预测；附图4.1表示给予大鼠对乙酰氨基酚后24-小时期限中N-乙酰化化合物(δ约2.22-约2.11)的总尿排泄的给药前预测(对该参数而言，使用第1个模型)。
附图4.2表示给予大鼠对乙酰氨基酚后24-小时期限中排泄的“MA”量的给药前预测(对该参数而言，使用第1个模型)。
附图4.3表示给予大鼠对乙酰氨基酚后24-小时期限中N-乙酰化化合物(δ约2.22-约2.11)的总尿排泄的给药前预测(对该参数而言，使用第2个模型)。
附图4.4表示与附图4.3相关的模型的体内验证。
附图4.5表示给予大鼠对乙酰氨基酚后24-小时期限中对乙酰氨基酚葡糖苷酸(“G”)的尿排泄的给药前预测；附图4.6表示与附图4.5相关的模型的体内验证。
附图4.7表示给予大鼠对乙酰氨基酚后24-小时期限中“MA”的尿排泄的给药前预测(对该参数而言，使用第2个模型)。
附图4.8表示与附图4.7相关的模型的体内验证。
附图4.9表示与附图4.7相关的模型的体内验证。
附图4.10表示给予大鼠对乙酰氨基酚后24-小时期限中“P”的尿排泄的给药前预测；附图4.11表示与附图4.10相关的模型的体内验证。
附图4.12表示给予大鼠对乙酰氨基酚后24-小时期限中排泄的“S”的量的观察到的与给药前预测的值的关系。
附图4.13表示给予大鼠对乙酰氨基酚后获得的24-小时尿样中G/S比的观察到的与给药前预测的值的关系。
附图5.1表示给予男性人体对乙酰氨基酚后前3小时中N-乙酰化化合物(δ2.210-2.135)/kg体重的总尿排泄的给药前预测；
附图5.2表示与附图5.1相关的模型的体外验证。
附图5.3表示给予男性人体对乙酰氨基酚后前3小时尿/kg体重中排泄的对乙酰氨基酚葡糖苷酸(“G”)量的给药前预测；附图5.4表示与附图5.3相关的模型的体外验证。
附图5.5表示给予男性人体对乙酰氨基酚后前3小时尿/kg体重中排泄的“T”量的给药前预测；附图5.6表示与附图5.5相关的模型的体外验证。
附图5.7表示给予男性人体对乙酰氨基酚后前6小时中N-乙酰化化合物(δ2.210-2.135)/kg体重的总尿排泄的给药前预测；附图5.8表示与附图5.7相关的模型的体外验证。
A.模型剂量过程的优选特征1.模型建立群体形成模型建立群体的受试者应尽可能是有代表性的形成测试群体的受试者。膳食可以影响生物流体的组成且受试者之间的膳食变化由此在与生物流体-衍生的模型中是重要的。理想的情况是，这些方法足够稳定以不受膳食变化的影响，而这可能需要对每种模型进行测试。作为对可变膳食的可能作用的预防，应适合于所有模型的建立、验证和从接受相同膳食的受试者中获得的特定模型相关的测试数据。这对实验室动物比对人更易于实现。实际上，如果标准动物膳食和表征人膳食对所有相关操作而言均是特定的，那么可能是有利的，因为能够对一定范围的不同模型快速检查测试受试者的尿样。一般来说，模型建立群体的大小越大，则生成的模型越稳定。一旦建立了模型，则需要使用一组不属于该模型建立群体成员的受试者验证。
2.剂量给药物质、剂量水平、给药频率和给药方式取决于应用。如果目的在于产生代谢表型化的方法，那么给药物质需要提供可以表征所关注的转化程度的一种或多种代谢物是可能的。理想的情况是，选择的代谢物仅受所关注的转化的影响，而不接触前它复杂情况。因此，给予的化合物可以是可能带有一-或二-化学官能基的小的不复杂的化学化合物。为了建立这类表型化模型，可能的情况是选择的物质的单剂量可以足够，但该剂量需要提供足够大的代谢上不同的个体之间的差别。如果目的在于建立用于反应预测的模型，那么给药方案应与在测试受试者中预测反应的方案相同。
3.样品a.给药前样品需要选择给药前以便含有相关的代谢信息。如果必要，可以取一种以上类型的样品并将其信息量合并。优选样品易于得到且取样过程应可以疼痛和不适感减少到最低限度。为了给药前取样时间与给药时间之间发生的代谢表型的改变的可能性减少到最低限度，应尽可能在与给药数据接近时获得给药前样品。
尿是理想的给药前样品，因为它含有丰富的代谢信息且可以以尤其对人体受试者极少或没有不适感的方式取样。另外，对人而言，基本上可以按照要求对尿取样。从动物、诸如大鼠中采集尿稍困难一些；不能按照要求获得尿样且较小的动物、诸如大鼠一般必须寄居在单个笼内几小时才能安排特定的尿样采集。
血液也含有代谢信息且少量血液相对易于从较大动物或人中通过“针刺”法取样。然而，必须进行特定的安排以抑制凝块，例如应用血清或应用含有肝素锂的小瓶。尤其从较小的动物中获得大量的血更为困难且可能需要特定的技术和静脉切开者。根据取血样的部位和便于固定受试者的不同可能需要满足和/或镇静。血浆或血清是两种可以进行正常分析的血液-衍生的流体。
唾液、汗、呼出的呼气或呼出的呼气冷凝物、泪和母乳是其它易于获得且可以含有相关代谢信息的其它体液，这取决于研究的性质。
b.给药后样品给药后样品类型取决于应用。给药后样品可以是完整的受试者，例如人或大鼠或来源于该生物体的如上述a.部分中所述的样品。如果必要，可以取一种以上类型的样品。
c.样品的稳定性需要采取特定的安排以确保生物样品的稳定性，否则它们就会发生因细菌或其它方式导致的降解。如上所述，需要进行特定的安排以防止血或血浆凝块。最好将尿样、尤其是可能发生排泄物污染或其它污染的尿样收集入含有抗菌剂、诸如叠氮化钠的小瓶。叠氮化钠具有在1H NMR光谱中不可见的有益性。如果在较长时间期限内采集尿样，即几小时而非几分钟，那么最好无论在何种情况下都用冰或其它方式冷却采集容器或袋。一旦采集并稳定，则应立即分析所有的生物流体或将其储存在深度冷冻(-20℃或-20℃以下)待分析。优选可以在采集后立即将任何“固体”组织样品“骤”冻在液氮中且随后储存在-80℃下待分析。应选择不会通过增塑剂或其它塑料成分的渗漏污染样品的采集和储存容器。
4.样品的制备在分析前可能需要一些样品制备或处理。一般如下制备用于进行1HNMR光谱分析的样品，不过，在不同操作者使用的实际步骤中可能存在很大程度的变化a.尿样一般通过将400μl尿与200μl磷酸盐缓冲液(0.2M Na2HPO4和0.2MNaH2PO4的81∶19(v/v)混合物，pH7.4)混合制备用于NMR分析的尿样；如果获得的尿量不足，那么该不足量由纯水与最少200μl尿组成。使尿-缓冲液混合物在室温下保持稳定10分钟以便能够发生缓冲作用且然后以13,000rpm再离心10分钟以除去悬浮的颗粒。将500μl“澄清”缓冲的尿转入NMR管并加入50μl TSP/D2O溶液。TSP(3-三甲基甲硅烷基-[2，2，3，3-2H4]-1-丙酸钠)是用于NMR实验的化学位移参比化合物(δ0)且D2O提供了NMR分光计的场/频率锁。TSP/D2O溶液的浓度使得能够得到在NMR管中0.1mM的TSP终浓度。
b.血浆样品一般通过将150μl血浆与350μl盐水(在10％(v/v)D2O和90％(v/v)H2O的混合物中的0.9％(w/v)NaCl)混合制备用于1H NMR分析的血浆样品。因样品中与蛋白质结合的可能性而不加入化学位移参比化合物诸如TSP。
随所用分析技术的不同，可以将对样品的化学衍生用于增加数据回收。因此，例如，合适的发色团可以与化合物结合，而这些化合物还可以通过监测紫外光或可见光吸收的分光光度检测器检测到。另一种选择可以是通过荧光分析结合荧光标记以提高检测限。通过这类衍生，可以检测到预先不可检测到的化合物且检测限对其它化合物可以得到改善。还可以将化学衍生用于有利于不同样品成分的色谱分离。物理和/或化学处理还可以用于除去不需要的样品成分，诸如血浆蛋白，否则可能在分析过程中产生问题。
5.物理-化学分析技术a.给药后样品的分析需要根据测定的参数和样品的数量和性质、例如整个生物体或生物流体的类型选择分析技术。可以在不同模型中关注的巨大参数范围指的是可能需要分析仪器和方法的宽范围。
如果应用是测定给药特定物质后的特定反应，例如血压的改变，那么应选择最合适的技术，例如血压计。如果物质的毒性是所关注的病灶，那么最好例如使用安装了适宜试剂盒的自动临床分析仪测定血浆参数范围，诸如酶活性。另一方面，可以按照作用类型分类组织病理学发现或可以根据严重程度对其进行数字评分。如果目的在于剂量表型化模型，那么一般可以需要给药后分析技术对给药物质的一种或多种代谢物提供定量或至少是相对的定量。
b.给药前样品的分析如果使用给药后样品，那么对给药前样品分析技术的选择会受到样品性质的影响，而另外选择的给药前分析技术要求能够显示出代谢信息。优选通过NMR光谱法或通过另一种能够进行间接代谢物检测和定量的方式分析体液或身体组织，即选择的技术可以理想地检测各代谢物并对其定量而不需要特别对那些特定的代谢物进行分析。这一结果能够应用于模型中最有用的代谢物，尽管它们目前并不已知。还能够鉴定所关注的新代谢物标记。就建立模型而言，鉴定每种观察到的代谢物并不必要，而分析技术应对每种样品提供可靠的定量指纹。理想的情况是，选择的技术易于使用，但由于昂贵和需要的复杂水平而始终不可能。一种可能的技术、即大部分分析化学实验室中的标准分析仪器是高效液相色谱(HPLC)，例如其带有UV-可见分光光度检测。尽管它相当耗时，但是HPLC技术能够提供需要来自给药前样品的数据类型。对HPLC检测器的选择是关键因素且可以通过在分析前进行样品的化学衍生促进数据回收。NMR光谱法的应用并不限于任何特定类型的NMR实验。
c.不同分析仪器的可变性能不同的分析仪器可以以不同方式起作用且单部件仪器的性能可能随时间而改变。这类仪器的变化可能特别重要，其中样品之间灵敏的给药前变化需要特征化以建立成功的模型，不过，数据过滤、诸如OSC可能有助于将其在“有监督”PR分析中的作用减小到最低限度。因此，在建立特定模型的过程中，理想的情况是使用特定的仪器在个别情况下取所有特定类型的测定值。如果不能够一次进行所有的分析，那么必须确保仪器性能不会在不同使用期限之间发生显著改变。如果使用多部件或类型仪器从模型建立群体中取测定值，那么必须进行交叉检查以确保来自每一仪器的性能相似。需要对不同仪器之间存在显著性能差异的仪器进行取消选择或重新校准。
6.多元PR分析前的数据处理在PR分析前进行某些数据处理可能有帮助或必不可少。
理想的情况是，所有将利用的物理和/或化学数据可以用于生成化学计量分析的输入数据。然而，随获取的数据类型的不同，在多元分析前需要进行一定的数据归纳。由于使用了诸如尿这类生物流体的1H NMR光谱数据，所以尽管进行了缓冲，但是仍然可以将其用于处理化学位移等级上的小pH-诱导的峰位的移动。因此，在删除某些诸如残余水信号这类区后，将各1D1H NMR光谱的剩余部分沿其横坐标分成连续的部分(对600MHz分光计而言一般为0.04ppm宽)且对每一个部分获得积分。
如果需要这类数据归纳，那么以尝试不同的数据归纳法为佳，例如使用不同的光谱部分宽度，条件是预先的尝试没有产生适当的模型。数据过滤技术、诸如OSC的应用可以通过有助于变量的选择促进数据归纳。
由于使用了生物流体NMR数据，所以通常对每个数据归纳的光谱进行“归一化”且存在大量进行这类处理的方式。通常使每个NMR光谱归一化或按比例缩放以得到与数据组中各其它NMR光谱相同的总积分。另外，其它数据处理可以证实有助于例如将来自尿样的1H NMR数据按比例缩放成δ5.4上尿囊素峰(如果存在)的恒定积分或肌酸酐峰的恒定积分。在人体内，尿肌酸酐的排泄与肌肉质量相关，依次与体重极为相关。将尿的数据按比例缩放成恒定的肌酸酐由此有助于消除与体重相关的排泄量的差异。另外，通过测定尿中代谢物浓度的确定值并考虑由每个受试者排泄的尿量，能够获得确实代表每个受试者代谢物排泄的数据组。如果测定了代谢物的排泄量且还已知体重，但可变，那么可以将上述方法用于使尿数据对每单位体重的排泄量归一化。还可以用于使数据“块化”，从而将带有属于特定范围的数值的变量处理为离散组。
尽管非线性变量的组合可能更为有益，但是对分析、诸如PCA、PLS或PLS-DA的特定局限在于它们依赖于发现有用的现有变量的线性组合。
因此，在进行这类分析前，显然可以通过加入现有变量的非线性组合扩展X数据矩阵。特别地，两种变量的比值通常比各自的绝对值更有意义且取比值尤其有助于与代谢表型化建立联系，其中不同代谢物的相对量通常是重要的。因此，扩展的X矩阵应包括原始X变量与除一个变量与其自身之比外的所有原始变量的一对一的比值。这种手段如下面的简单实例中所示原始X矩阵

扩展的X矩阵

在稍为更复杂的实例中，扩展三种原始X变量以产生新的6变量矩阵原始3变量矩阵

扩展的矩阵

在下列简单PLS-类实例中证实了该手段的潜在有益性，其中需要根据两个X变量预测单Y变量原始数据矩阵

扩展的矩阵

在原始的矩阵中，没有可以产生Y1的X1和X2的恒定线性组合。然而，通过如所述的扩展X矩阵，极为简单的线性关系变得显而易见，即Y1＝2(X1/X2)。
在进行化学计量分析前，一般需要对数据组中的每个变量进行一定形式的按比例缩放。典型的缩放手段包括平均定心(mean-centring)、单位方差缩放(unit variance scaling)和排列缩放(pareto scaling)。
7.化学计量法重要的是实现本发明的范围并不限于特别具体的化学计量法的应用。可以使用这任意类可以鉴定和建立前--给药后数据相关性的方法。
一般可以将有监督模式识别(PR)法、诸如PLS或PLS-DA用于实现靶向模型建立，即给药前-给药后数据相关性。能够在使用这些有监督方法前使用无监督PR法，诸如PCA，例如检验对给予的化合物的反应的变化或检验给予的化合物的代谢上的变化。这类无监督分析可以有助于鉴定异常值且决定是否建立分类法或是否建立数字结果模型(参见下文)。
有时在复杂程度较低的获得用于代谢表型某些方面或反应预测的前建立差别的手段中，对给药前数据应用无监督法、诸如PCA可能足够。这种手段具有简便的优点，但它测定稳定鉴别者的能力远低于有监督法。这类方法依赖于能够根据给药后特性对各模型建立前建立数据点编码(例如颜色代码)。这种手段的成功与否取决于编码的群体可以为显著的给药前的情况。一般来说，这种无监督手段可能是唯一合适的，其中对不同的反应组存在相对明显的给药前鉴别者。鉴别者复杂和“隐藏的”是不合适的且重要的是不能将数据过滤法、诸如OSC与这种“无监督”手段一起使用。
在模型建立中所用的化学计量法取决于所关注或需要的最终的应用。因此，当目的在于获得用于分类代谢表型的某些方面(例如“快速”或“缓慢”乙酰化)或预测对给药物质的反应(例如“不良药物反应”或“无不良药物反应”)的方法时，分类方法、诸如PLS-DA可能合适。另一方面，如果目的在于获得对代谢能力的某些方面的定量措施或预测对给药物质的某些反应的确定值，那么诸如PLS这类方法可能合适。神经网络分析(NNA)可能有用，这取决于应用，且已经证实NNA在分类作用中是有利的，其中给药前差别可以来源于大量独立来源之一，例如，如果X数据为A或B或C类，那么反应为Y1，如果X数据不属于这些类，那么反应为Y2。重要的是神经网络方法不能够鉴定可提供所关注差别的那些给药前特征。诸如PCA、PLS和PLS-DA这类方法能够鉴定差别特征且在理解任何鉴别的科学基础方面有显著的优点且其中需要衍生出其它进行相同鉴别的分析方法。
有时将数据过滤法、诸如OSC用于除去与给药后数据中所关注的变化无关的前建立数据中的变化。例如，OSC可以有助于将物理和/或化学分析中所用的分析仪器性能上的任何变化的影响减小到最低限度。
通常需要从建立某些的数据中排除相对少量的异常值，因为其数据在某些情况中与模型建立不一致或妨碍其建立，PCA取分图和DmodX值可以用于鉴定异常值。就PLS模型而言，可以通过任意下列方式合理地排除异常值a)X取分的检验(t1/t2)；b)X残值的检验(DmodX)；c)X和Y间距的取分之间的相关性的检验(例如t1/u1)；d)Y取分的检验(例如u1/u2)；e)Y残值的检验(DmodY)。
8.反应预测应用对活生物体给予的物质通常发生各种不同的代谢转化。然后确定的代谢物中的每一种可以依次进行上述和下述的各种进一步转化。因此，一种原始化合物的完全代谢可能包括极其复杂的混杂的不同途径和许多不同的酶。因此，多种不同表型的影响可以提供对给药物质的反应性质且去除(deconvolve)所有这些不同的影响极为困难。因此，就反应预测应用而言，优选在不去除(deconvolving)不同影响的情况下将本发明直接用于预测反应。因此，例如，在对雄性Sprague-Dawley大鼠给予半乳糖胺HCl(800mg/kg)(参见实施例1)时产生的肝损害的巨大变化程度(如组织病理学和临床化学参数所证实的)可能主要与给药前尿的变化相关以便提供对半乳糖胺HCl的敏感性的预测模型，而不需要理解属于反应的决定因素的代谢因素。
B.模型验证程序的优选特征模型有效性的验证在所有类型的数学模拟中具有重大意义。模型的稳定性和预测能力的验证需要独立于用于模型建立的数据的验证数据。根据与基于模型的对验证数据组的预测相关的误差等级评价模型的预测能力。可以通过将对模型估计的误差的等级与和基于模型的对验证数据组的预测相关的误差等级进行比较来判断模型的稳定性。就考虑为用于未来“未知”样品预测的模型而言，应满足可预测性和稳定性这两种要求。
在PLS模型的情况中，可以如下进行“内部”和“外部”验证可以通过下列步骤进行PLS模型的“内部”验证首先测定R2Y和Q2Y值且随后观察与其X矩阵中的相应行相关的Y数据位置随机化对这些值的影响(一般可以进行20个单独的行交换)。R2Y提供了根据X数据解释Y数据的PLS模型的能力的确定值，其中模型中包括了所有的数据。
然而，可以通过过度配合获得假高R2Y值且PLS模型的实际测试为其预测能力。Q2Y提供了PLS模型的预测能力的确定值且提供交叉验证程序获得，其中使用来源于数据的剩余部分的模型为X-Y的预测依次提供了不同的XY数据部分。R2Y和Q2Y基于1的最大理论值，不过，Q2Y一般应小于R2Y。以R2Y和Q2Y的实际值为条件，Q2Y与R2Y近似的含义是具有良好的预测能力。在PLS模型体内验证的第二个阶段中，使Y数据的位置随机化且如果原始模型有效，那么Q2Y和R2Y值基本上均应减小。Y数据的位置与其在X矩阵中的相应行的随机化应使Q2Y显著减小，理想的情况是到零。R2Y值还应在Y数据随机化时显著减小，但不必减小至零，因为模拟程序始终会试图找到X数据中的某些，甚至可以预测随机化Y数据的噪声。
可以通过取测试组动物进行PLS模型的“外部”验证，所述的动物不形成模型建立群体且其Y值近似包括模型中的Y数据范围。对考虑为有效的模型而言，测试样品的预测误差(在来自Umetrics的SIMCA软件中，将其命名为RMSEP-预测的均方根误差)必须在与对模型样品的估计误差(在来自Umetrics的SIMCA软件中，将其命名为RMSEE-估计的均方根误差)相同的范围。
C.测试步骤的优选特征本发明的一个极为重要的特征涉及带有非常用或极端的代谢表型的受试者的鉴定方法。特别证实诸如这些受试者具有不良或特应性药物反应。由于应用于可以包括在任何模型建立运用中的受试者数量的实际限制，所以不能基于全部范围的代谢表型建立模型且不能包括罕有表。
另外，伦理的差异也可以是表型变化的重要因素。然而，在测试阶段，本发明的重要特征在于与模型中的表型范围不一致的任意表型均可以作为异常值得到鉴定。例如，就PCA和PLS模型而言，可以在由PC-或PLS-取分模式的模型平面或超平面方向或与模型相距的剩余方向上检测这些异常值(DModX，Y)。另外，就PLS模拟而言，取分方向中的异常值可以存在于X-区间(T)、Y-区间(U)以及X与Y(T/U)的内在相关性中。
由于将测试受试者鉴定为异常值，所以不能鉴定其代谢表型或其对所述给药物质的反应不可预测，具有足够的置信度。因此，在反应预测应用中，显然不能在所有至这类异常值下给予所述物质或在谨慎条件下持续进行，例如持续起始的低剂量。因此，尽管模型剂量步骤存在实际局限，但是模型应能够通过关于所有测试受试者的有用信息。
可以将所谓受试者尿的单NMR光谱与各种模型进行比较以预测受试者对各种治疗的反应或评价受试者代谢表型的几个方面。可以将NMR光谱以电子件方式储存以便在需要且如果需要时使用。这种类型的手段减少了所需的物理和/或化学测试的数量，不过，可能需要在受试者生命的不同阶段的测试以顾及到代谢表型中与年龄相关的改变。
一般来说，对所各种的每种物质需要新的模型，但是对一种物质衍生的模型可以与极为相关的物质结合使用。
本发明每个方面的优选特征在进行必要修改后可以用于各其它的方面。引入本文提及的法律上许可的现有技术的对比文件的全部内容。
实施例实施例1.Sprague-Dawley大鼠对给予半乳糖胺盐酸盐的可变反应。基于应用给药前生物流体样品NMR光谱的单纯反应编码的PCA的可能反应预测方法的实施例。
30只幼小的年龄相近的雄性Sprague-Dawley大鼠获自CharlesRiver，France。在确保它们看起来各自健康的观察结果后，将它们放入带有可随意饮水和取标准商品实验室膳食(来自Usined’Alimentation Rationnelle，Villemoisson-sur-Orge，France的膳食A04C)的单独的代谢笼中。将实验室温度维持在20±2℃和60±20％的相对湿度。过滤实验室空气且每小时改变14次。施加固定的“12小时光照-12小时黑暗”循环。在短期笼“环境适应”后开始进行研究。取样方案如表1.1中所示。
表1.1半乳糖胺HCl研究的取样方案。B、U和P表示分别对血、尿和病变取样。在第1天开始时进行给药。

在给药时(在第1天开始)生长的大鼠各自体重约为260g。将半乳糖胺(缩写为GalN)HCl(来自Sigma，France)溶于生理盐水并通过腹膜内注射给予200mg/kg或800mg/kg；10只动物(Nos.101-110)接受低剂量且10只动物(Nos.201-210)接受高剂量。10只对照组动物(Nos.1-10)接受口服剂量的玉米油。
在第2天通过CO2使各组10只大鼠中的5只安乐死，在第8天时使用相同技术使剩余的动物安乐死。早期安乐死的大鼠序号为6-10、106-110和206-210。晚期安乐死的大鼠序号为1-5、101-105和201-205。
每天将前-和给药后尿样采集入含有叠氮化钠(0.100ml的10％(w/v)叠氮化钠水溶液)作为抗菌防腐剂的冰冷却的容器中，持续7小时。在给药的当天再进行过夜尿的采集(7-24小时给药后)。在进行每次采集前清洁尿采集仪器以便将细菌、食物和粪便的污染减少到最低限度。将尿样深度冷冻待进行NMR分析。
在异氟烷麻醉下从眼眶窦采血样。在前3天和恰在第2天或第8天安乐死时从所有动物中采血样。在实施安乐死后，对每只大鼠取样用于组织病理学检查，其中取样包括从每只大鼠体内取10份肝样品(从每个肝叶中取2份)。将血样采集入含有肝素锂作为抗凝剂的小瓶中并立即在约-4℃下离心以分离血浆。在30℃下使用AU600多参数临床分析仪(Olympus)分析各血浆样品部分的临床化学参数范围，其中包括丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)等。
通过将400μl尿与200μl磷酸盐缓冲液(0.2M Na2HPO4和0.2MNaH2PO4的81∶19(v/v)混合物，pH7.4)混合制备用于NMR分析的尿样；如果获得的尿量不足，那么该不足量由纯水与最少200μl尿组成。使尿-缓冲液混合物在室温下保持稳定10分钟以便能够发生缓冲作用且然后以13,000rpm再离心10分钟以除去悬浮的颗粒。将500μl“澄清”缓冲的尿转入NMR管并加入50μl TSP/D2O溶液。TSP(3-三甲基甲硅烷基-[2，2，3，3-2H4]-1-丙酸钠)是用于NMR实验的化学位移参比化合物(δ0)且D2O提供了NMR分光计的场/频率锁。TSP/D2O溶液的浓度使得能够得到在NMR管中0.1mM的TSP终浓度。在30℃下使用带有用于减小水信号大小的NOESYPRESAT脉冲序列的Bruker AMX 600 MHz NMR分光计(Claridge，1999)进行NMR分析。主要的获取参数为
分光计频率600MHz光谱宽度约7200Hz(12ppm)Bruker脉冲程序noesyprld时间域中的数据点数65536扫描次数64空扫描次数4获取时间约4.55秒预饱和时间3秒混合时间0.1秒在获取后，通过应用于自由感应衰减信号的指数乘方施加0.3Hz谱线增宽，此后将NMR光谱进行傅立叶变换成32768时间点。调整光谱相位得到NMR信号周围的均匀基线且通过将δ0值指定为TSP峰设定化学位移的尺度。在进行数据归纳前，使用直线基线校正算法使前1天的各光谱的基线移动至零强度。使用应用“xwinnmr”软件的SiliconGraphics计算机(Bruker GmBH)进行所有这些光谱加工处理。
给药后尿NMR光谱的表观检查显示在半乳糖胺HCl(800mg/kg)对内源性代谢物的作用方面在动物之间存在显著变化(参见表1.5和附图1.3和1.4)。基于这一表观检查，易于将动物分类为(i)“反应者”或(ii)“弱或无反应者”。另外，发现反应者在其给药后0-24小时期限内的尿中半乳糖胺的排泄量大于弱/无反应者在其给药后0-24小时期限内的尿中半乳糖胺的排泄量(参见附图1.1和表1.6)且这一结果表明半乳糖胺代谢与其毒性之间的联系。
附图1.1表示三种NMR光谱。光谱“a”是从给药后0-7小时的201号动物中采集的第1天尿的光谱。光谱“b”获自确认的GalN HCl。光谱“c”是从给药后0-7小时的203号动物中采集的第1天尿的光谱。将光谱“a”和“c”按比例缩放成恒定的尿囊素(δ5.4)峰高。GalN显然存在于来自201号动物的尿中，而不存在于来自203号动物的尿中。
此外，在从给药后24-31小时采集尿样的NMR光谱中，反应者表现出存在确定的N-乙酰基峰，至少是显著的，而弱/无反应者的光谱中不存在该峰(参见附图1.2)。将该峰临时指定为N-乙酰基半乳糖胺。对800mg/kg剂量反应的动物之间的显著变异性还在组织病理学和临床化学数据中得到了反映(参见表1.2-1.4)。
附图1.2表示从给药后24-31小时的202号动物(光谱“a”)和203号动物(光谱“b”)中采集的第2天尿样的NMR光谱。将光谱按比例缩放成恒定的肌酸酐。认为是N-乙酰基半乳糖胺的N-乙酰化种类显然存在于光谱“a”中，而不存在于光谱“b”中。
然后对随后给予半乳糖胺盐酸盐(800mg/kg)的动物的前1天(给药前)尿样的NMR光谱进行PCA。该数据组由9个光谱组成，因为前1天尿量不足以获得206号动物的NMR光谱。在进行PCA前，使用“AMIX”软件(Bruker GmBH)按照固定方式对前1天的每一个光谱进行“数据归纳”。排除某些光谱区，保留的区为δ9.0-66.25和4.5-δ2.76和δ2.48-80.5。将保留的区尽可能分成有序的0.04ppm-宽的部分并对每个光谱的每个部分获得积分。然后将数据归纳的值均匀地归一化而对每个“光谱”得到1000的总积分值。将所得的数据组加载入多元统计分析软件包(来自Infometrix的“Pirouette”)。然后使用平均定心(mean-centred)缩放对各变量进行PCA。按照给药后性能对所得的取分图进行颜色编码并通过检查发现PC1对PC5的取分图使反应者与无反应者分开。该图和相应的加载图分别作为附图1.5和1.6表示。对附图1.5的检查提示可以从合适的给药前PCA取分图预测各大鼠对给予半乳糖胺HCl(800mg/kg)的反应，这取决于如何对已知的反应这和无反应的相关性这制图。附图1.6表示这类分析如何可以显示出能够鉴别反应者与无反应者的给药前特征。
下面的各种附图和表提供了不同大鼠对半乳糖胺HCl(800mg/kg)的可变反应的一些具体内容且表示了PCA可以如何用于区分反应者与无反应者的给药前。可能的情况是，使用PLS、PLS-DA或神经网络分析的有监督PR法能够获得远优于本文所述的无监督PR手段的反应者与无反应者的给药前差别。
表1.2半乳糖胺HCl-给药大鼠组织病理学改变的概括。

表1.3给药后24小时取样的血浆的临床化学分析。对缩写的关键词和测量单位参见表1.4。


表1.4血浆的化学缩写和单位

表1.5通过半乳糖胺HCl-给药大鼠中的NMR观察到的尿改变的概括。这些结果指的是晚期安乐死的大鼠组(动物1-5、101-105和201-205)。


附图1.3表示来自202号动物前1天和第3天尿样的部分noesypresat NMR光谱。在给药前采集24-17小时的给药前样品(光谱“a”)。采集给药后48-55小时的给药后样品(光谱“b”)。将光谱按比例缩放成恒定的肌酸酐。与光谱“a”相比，光谱“b”显示出肌酸、甜菜碱、胍乙酸(GAA)和牛磺酸增加和三甲胺-N-氧化物(TMAO)和2-氧代戊二酸盐减少。
附图1.4表示来自201号动物前1天和第3天尿样的部分noesypresat NMR光谱。在给药前采集24-17小时的给药前样品(光谱“a”)。采集给药后48-55小时的给药后样品(光谱“b”)。将光谱按比例缩放成恒定的尿囊素。与光谱“a”相比，光谱“b”显示出组氨酸排泄量增加马尿酸盐排泄量减少。
表1.6与尿中排泄的半乳糖胺量相关的对半乳糖胺HCl(800mg/kg)的反应的变异性。对每只动物而言，该表表示从给药后0-24小时采集的尿中排泄的半乳糖胺的量且列出了是否观察到了毒性反应。

由206号动物排泄的半乳糖胺测定量稍低于预计值，得出其未强反应者且这可能是由于在膀胱中保留的尿导致的。给药后0-24小时期限内206号动物仅排泄了3.7ml尿且这是任何动物在该期限中产生的最少量的尿。当测定的尿体积极低时，代谢物排泄最可能受到低估；这是因为在膀胱中存在大量不足以排尿的高度浓缩的尿。
附图1.5表示通过对9份可利用的高剂量(800mg/kg)动物前1天尿样的1H NMR光谱的PCA获得的PC取分图；将不足的前1天的尿用于获得206号动物的NMR光谱。使用菱形对无反应者编码数据点(动物序号203、204、205、207和208)并使用十字形对反应者编码数据点(动物序号201、202、209、210)，但应注意207号动物处于反应者与无反应者之间的分界线上。该图表示存在可以区分那些受到和不受800mg/kg半乳糖胺重度影响的动物之间的给药前尿光谱的特征。反应者具有高于无反应者的给药前尿肌酸水平且所有反应者中仅有一个(动物201)具有低于无反应者的给药前尿2-氧代戊二酸盐/肌酸酐比值(另外参见附图1.6)。
根据代表0.04ppm-宽光谱部分的中心点标记附图1.6的各标绘的点。因此，例如，点标记的3.02表示来自δ3.04-83.00ppm的光谱部分(或变量)。所关注的点为那些基本上对PCs1和5提供的非零的点。对附图1.5和1.6的比较表明与反应者相比，无反应者具有相对高的集中在δ3.02处的光谱部分的积分值。这种差异看起来是由于2-氧代戊二酸盐在无反应者中的水平较高所致且2-氧代戊二酸盐也产生集中在δ2.46处的部分。三甲胺-N-氧化物主要产生了集中在δ3.26的部分且无反应者由此具有高TMAO尿水平。一种对此可能的解释在于无反应者为缓慢的乙酰化者。
实施例2.大鼠中可变的尿异烟肼代谢物模式及其与异烟肼毒性的相关性。个体之间代谢能力上的差异的主要意义的实施例。
30只幼小的年龄相近的雄性Sprague-Dawley大鼠获自CharlesRiver，France。在确保它们看起来各自健康的观察结果后，将它们放入带有可随意饮水和取标准商品实验室膳食(来自Usined’Alimentation Rationnelle，Villemoisson-sur-Orge，France的膳食A04C)的单独的代谢笼中。将实验室温度维持在20±2℃和60±20％的相对湿度。过滤实验室空气且每小时改变14次。施加固定的“12小时光照-12小时黑暗”循环。在短期笼“环境适应”后开始进行研究，此时大鼠约为6周龄且体重约为200g。
当生长中的大鼠体重各自约为250g时，在命名为“第1天”的当天给药。将异烟肼(来自Sigma，France)溶于生理盐水并通过腹膜内注射给予200mg/kg或400mg/kg；10只动物(Nos.101-110)接受低剂量且10只动物(Nos.201-210)接受高剂量。10只对照组动物(Nos.1-10)接受腹膜内注射盐水。
每日将前-和给药后7小时尿样收集入含有叠氮化钠(0.1ml的10％(w/v)叠氮化钠水溶液)作为抗菌防腐剂的冰冷却的容器。在给药后7-24小时还进行过夜的尿采集。在每次采集前清洁尿采集仪器以便将细菌、食物和粪便的污染减少到最低限度。在不对叠氮化物溶液进行任何校准的情况下测定各尿样的终体积。将尿样冷冻储存待分析。
计划在实施安乐死前立即取采给药后血样，而在实施安乐死后也立即取样用于组织病理学检查。正如实施例1中所述，目的在于在给药后1天时通过CO2使各组10只大鼠中的5只安乐死，由此提供早期血样和组织病理学样品；在给药后7天时使用相同技术使剩余的动物安乐死，因此提供晚期血样和组织病理学样品。计划早期安乐死的大鼠序号为6-10、106-110和206-210。晚期安乐死的大鼠序号为1-5、101-105和201-205。然而，来自接受高剂量异烟肼的组的某些动物(Nos.204、205、207和209)患有令人意外的惊厥且死亡或必须对其实施早期安乐死以防止患病。通过比较，其它来自高剂量组的动物(Nos.201-203、206、208和210)显著表明没有明显的疾病作用的临床迹象。将尿样深度冷冻待NMR分析。
通过将400μl尿与200μl磷酸盐缓冲液(0.2M Na2HPO4和0.2MNaH2PO4的81∶19(v/v)混合物，pH7.4)混合制备用于NMR分析的尿样；如果获得的尿量不足，那么该不足量由纯水与最少200μl尿组成。使尿-缓冲液混合物在室温下保持稳定10分钟以便能够发生缓冲作用且然后以13,000rpm再离心10分钟以除去悬浮的颗粒。将500μl“澄清”缓冲的尿转入NMR管并加入50μl TSP/D2O溶液。TSP(3-三甲基甲硅烷基-[2，2，3，3-2H4]-1-丙酸钠)是用于NMR实验的化学位移参比化合物(δ0)且D2O提供了NMR分光计的场/频率锁。TSP/D2O溶液的浓度使得能够得到在NMR管中0.1mM的TSP终浓度。在30℃下使用带有用于减小水信号大小的NOESYPRESAT脉冲序列的Bruker AMX 600MHz NMR分光计(Claridge，1999)在303K下进行NMR分析。主要的获取参数为分光计频率600MHz光谱宽度约7200Hz(12ppm)Bruker脉冲程序noesyprld时间域中的数据点数65536扫描次数64空扫描次数4获取时间约4.55秒预饱和时间3秒混合时间0.1秒在获取后，通过应用于自由感应衰减信号的指数乘方施加0.3Hz谱线增宽，此后将NMR光谱进行傅立叶变换成32768时间点。调整光谱相位得到NMR信号周围的均匀基线且通过将δ0值指定为TSP峰设定化学位移的尺度。将光谱和选择的扩展绘制在纸上。如果通过多元模式识别法检验一组光谱，那么使用直线基线校正算法使各光谱的基线移动至零强度。使用应用“xwinnmr”软件的Silicon Graphics计算机(BrukerGmBH)进行这些光谱加工处理。
给药后0-7小时采集的NMR光谱的表观检查显示在认为是来源于异烟肼的某些代谢物的模式方面存在显著变化。这种变化在认为来源于不同的N-乙酰化种类的2ppm区内的三个峰中特别明显。在下文中将这些峰在约2.22、2.20和2.15ppm处的峰分别命名为“a”、“b”和“c”且由它们产生的化合物在下文中命名为化合物“A”、“B”和“C”。在每次剂量下看起来这些代谢物主要有两种不同类型的模式且这些称作1类和2类的不同模式的实例如附图2.1中所示。
给予异烟肼(200mg/kg)后0-7小时采集的尿样的数据归纳的NMR光谱的PCA也显示了代谢的变化(参见附图2.2)。为了进行这种分析，首先使用AMIX程序(Bruker GmBH)按照固定的方式对9份可利用的样品的NMR光谱进行“数据归纳”。将除δ2.23-δ2.13内的N-乙酰基区外的所有光谱区除去。将各光谱的剩余部分分成两个连续的0.05ppm-宽部分并对每个部分获得积分。然后将数据归纳的值归一化而对每个“光谱”得到1000的总积分值。将所得的数据组加载入多元统计分析软件包(来自Infometrix的“Pirouette”)并使用各变量(光谱部分)的平均定心缩放(mean-centred scaling)进行主成分分析(PCA)。由于仅使用了两个输入变量，所以这上PCA的无意义的实例，但它支持存在如手术测定的两种不同类型的N-乙酰基模式的结论，1类动物为101、103和109号动物且2类动物为102、105、106、107、108和110号动物。在附图2.2中，用十字形标记1类动物的数据点，而用菱形标记2类动物的数据点。
异烟肼是在人体内的代谢受到N-乙酰化者表型影响的传统物质实例且在本实施例中观察到的不同代谢物模式提示在试验组内存在缓慢和快速的N-乙酰化者。异烟肼代谢物的模式在一定程度上是剂量依赖性的，但能够基于固定的峰高比标准将所有第1天(0-7小时)尿的光谱指定为具有1类或2类模式，而与剂量水平无关(参见标2.1)。在高剂量水平下明显观察到仅那些表现出2类N-乙酰基模式的动物发生一定的毒性反应，包括肾功能降低(通过尿糖和/或乳酸盐增加显示出来)、惊厥和死亡(参见表2.1)。
表2.1.对雄性Spague-Dawley大鼠给予200和400mg/kg异烟肼后观察到的代谢和其它特性的概括。
表2.1，部分1.

在扣除局部基线后根据绘制的光谱以毫米测定峰高(缩写为pk.ht.)。
表2.1，部分2.

N-乙酰基模式类型的测定标准

表2.1，部分3.
在200mg/kg剂量下没有检测到肾功能降低，但某些动物在400mg/kg剂量下表现出肾功能受损。此外，在400mg/kg剂量下，观察到乙酰基模式的类型与是否存在任何肾功能降低之间存在相关性。仅2类动物表现出通过尿糖和乳酸盐水平增加证实的肾功能降低。作为产生2类乙酰基模式的动物，206号动物在尿乳酸盐方面显示出一定程度的异常特性。然而，值得注意的是该动物处于如乙酰基峰高比确定的2类区的极端边缘上。
表2.1，部分3

表2.1，部分4.在400mg/kg剂量下，观察到的乙酰基类型与是否发生惊厥和早产之间存在进一步的相关性。仅2类动物存在惊厥和早产死亡。206号动物再次异常在于它为2类，但没有因早产死亡。

表2.1提示反映出N-乙酰基模式的某些代谢差异对异烟肼毒性具有关键作用。怀疑关键的代谢步骤为可以如下进行的异烟肼的起始转化1)通过N-乙酰化得到N-乙酰基异烟肼；或2)通过水解异烟肼的酰胺基得到肼和异烟酸(参见附图2.3)。
我们怀疑肼可以导致所观察到的惊厥且我们推定在本研究中表现出毒性反应的动物具有特定的N-乙酰化者表型，即它们为相对缓慢的N-乙酰化者且它们由此由400mg/kg剂量异烟肼产生的毒性肼多于其它推定为相对快速的N-乙酰化者的其它高剂量动物由400mg/kg剂量异烟肼产生的毒性肼。为了基于在本研究中观察到的异烟肼(400mg/kg)的可变作用证实因素的性质，必须鉴定产生峰“a”、“b”的化合物“A”和“B”。已经将化合物“C”鉴定为N-乙酰基异烟肼。
正如众所周知的，本实施例证实给药物质的代谢物模式可以用于区分不同的代谢表型。本实施例还证实可以通过使用PR法对这些代谢物模式提出问题。本实施例也证实了代谢表型在测定对给予特定物质的个体反应中的决定性的重要意义。在下一个实施例中证实了本发明使生物样品中给药后代谢性能的变化与给药前变化建立联系以便提供预测模型。
实施例3.在随后给予异烟肼(200mg/kg)的雄性Sprague-Dawley大鼠中尿异烟肼代谢物的量的给药前预测。可以获得证实数据给药前与给药后预测的实施例。
75只幼小的年龄相近的雄性Sprague-Dawley大鼠获自CharlesRiver，France。在确保它们看起来各自健康的观察结果后，给它们指定序号101-175并放入带有可随意饮水和取标准商品实验室膳食(来自Usine d’Alimentation Rationnelle，Villemoisson-sur-Orge，France的膳食A04C)的单独的代谢笼中。将实验室温度维持在20±2℃和60±20％的相对湿度。过滤实验室空气且每小时改变14次。施加固定的“12小时光照-12小时黑暗”循环。在短期笼“环境适应”后开始进行研究，此时大鼠约为6周龄且体重约为200g。当生长的大鼠各自约为250g体重时，进行给药。将异烟肼(来自Sigma，France)溶于生理盐水并通过腹膜内注射对每只大鼠给予200mg/kg。
将个体给药前(给药前48-41小时)和给药后(给药后0-7小时)尿样收集入含有叠氮化钠(0.1ml的10％(w/v)叠氮化钠水溶液)作为抗菌防腐剂的冰冷却的容器。在每次采集前清洁尿采集仪器以便将细菌、食物和粪便的污染减少到最低限度。在不对叠氮化物溶液进行任何校准的情况下测定各尿样的终体积。
通过将400μl尿与200μl磷酸盐缓冲液(0.2M Na2HPO4和0.2MNaH2PO4的81∶19(v/v)混合物，pH7.4)混合制备用于NMR分析的尿样；如果获得的尿量不足，那么该不足量由纯水与最少200μl尿组成。使尿-缓冲液混合物在室温下保持稳定10分钟以便能够发生缓冲作用且然后以13,000rpm再离心10分钟以除去悬浮的颗粒。将500μl“澄清”缓冲的尿转入NMR管并加入50μl TSP/D2O溶液。TSP(3-三甲基甲硅烷基-[2，2，3，3-2H4]-1-丙酸钠)是用于NMR实验的化学位移参比化合物(δ0)且D2O提供了NMR分光计的场/频率锁。TSP/D2O溶液的浓度使得能够得到在NMR管中0.1mM的TSP终浓度。
在30℃下使用带有用于减小水信号大小的NOESYPRESAT脉冲序列的Bruker 600 MHz NMR分光计(Claridge，1999)对制备的尿样进行NMR分析。Bruker DRX分光计用于获取给药后NMR数据，而Bruker AMX分光计用于获取给药前NMR数据。主要的获取参数为分光计频率600MHz光谱宽度约7200Hz(12ppm)Bruker脉冲程序noesyprld时间域中的数据点数65536扫描次数32(给药后光谱)；64(给药前光谱)空扫描次数4获取时间约4.55秒预饱和时间3秒混合时间0.1秒在获取后，通过应用于自由感应衰减信号的指数乘方施加0.3Hz谱线增宽，此后将NMR光谱进行傅立叶变换成32768时间点。调整光谱相位得到NMR信号周围的均匀基线且通过将δ0值指定为TSP峰设定化学位移的尺度。将各给药后NMR光谱绘制在纸上并在进行局部基线校准后用手工方式对选择的峰进行峰高测定。测定高度的峰为δ5.4处的尿囊素峰；分别称作如实施例2的“a”、“b”和“c”的在约δ2.22、δ2.20和δ2.15ppm处的三个峰；和δ0处的TSP峰。在进行可产生多元统计分析的数据归纳前，使用直线基线校正算法使各光谱的基线移动至零强度。使用应用“xwinnmr”软件的Silicon Graphics计算机(BrukerGmBH)进行上述光谱处理和绘图操作。
在进行数据归纳后，使用来自Infometrix的“Pirouette”软件对给药后NMR光谱的“N-乙酰基”区(δ2.3-δ2.1)进行PCA。然而，与实施例2的结果相反，尽管数据组中存在宽范围的模式，但是没有观察到1类和2类光谱的不同分组。因为不能够鉴定分布中合适的自然边界，所以通过确定值而非通过特定类的隶属度可以更好地描述各给药后光谱。这由此意味着下列给药前与给药后的相关性分析会基于数字预测而非分类预测变得更好。
存在与获得有用的尿代谢物排泄测定值的一些问题且由此采取两种不同的手段对给药后样品中的不同N-乙酰化种类的排泄进行定量。第一种手段在于对有关内源性尿成分尿囊素的代谢物A、B和C(如实施例2中命名)的排泄进行定量。因此，将峰a、b和c在各NMR光谱中的强度描述为有关尿囊素在δ5.4处的峰的峰高比。尿囊素峰为便利的内标点，不过，在δ4.05处的肌酸酐的亚甲基信号也可以用于该目的。第二种手段在于采用通过参比以已知的恒定量加入的TSP信号大小的成分A、B和C的绝对排泄量的确定值并考虑每只大鼠产生的尿体积的措施。
因此，例如，使用公式获得不同动物的化合物C的绝对排泄量的相对确定值(峰高“c”/TSP峰高)*(采集的尿体积)。在此重要的是应注意该测定值是有效的，因为使用除没有可利用的尿且未制备NMR样品的138号动物外的400μl尿以恒定的方式制备了所有的给药后NMR样品。以毫米测定峰高并以毫升测定尿体积。第二中手段的局限在于在一定期限内从动物中采集的尿可能无法代表在该期限过程中通过膀胱的尿量且实践证明这类排泄“误差”在采集的尿极少时是特别可能存在的。用于定量的第一种手段的局限在于内源性参比化合物尿囊素的排泄在这种情况中可能并非不变，不过，现有的实践已经表明它是有用的参比点。
使用AMIX程序(Bruker GmBH)以恒定的方式对各给药前NMR光谱进行”数据归纳”。除去某些光谱区(例如含有TSP和残余水信号的区)，此后将各光谱的剩余部分分成有序的0.04ppm-宽部分并得到各部分的积分。然后对数据归纳的光谱归一化而得到各“光谱”的相同总强度。随后尝试进行PLS分析以找到能够预测各种N-乙酰化代谢物“A”、“B”和“C”的给药后排泄的给药前特征。使用来自Umetrics的SIMCA软件进行这些PLS分析。
发现在某些动物中，令人意外地可以根据给药前数据预测采集自给予异烟肼(200mg/kg)后0-7小时的尿样的NMR光谱中相对于δ5.4处的尿囊素峰高的“a”和“b”的峰高(参见涉及峰“a”的附图3.1和3.2)。考虑到峰“a”的情况，其与尿囊素的峰高比提供了NMR样品中比值的相对测定值(化合物A的量/尿囊素的量)。如果在本研究中将所有大鼠第1天7小时内的尿采集期限的尿囊素排泄推定为恒定值，那么所述的比值(“a”的峰高/尿囊素峰高)不同大鼠在该期限中排泄的化合物A的量的相对测定值。因此，这些发现表明对某些大鼠而言，使用合适的模型可以预测给予异烟肼(200mg/kg)后排泄的化合物A和B的量。
还发现对在第1天0-7小时采集期限过程中产生超过3ml尿的大量动物而言，可以根据给药前数据预测所述的量(“c”的峰高/TSP峰高)*(采集的尿体积)(参见附图3.3)。由于均按照确实相同的方式制备和获得了NMR样品和相关光谱，所以该量是每只大鼠排泄的化合物C的量的相对测定值。因此，使用合适的模型能够根据给药前数据预测给予异烟肼(200mg/kg)后排泄的化合物C的量。
附图3.1表示根据给药前尿NMR光谱数据进行模型建立和用于PLS模型预测的验证数据，所述的给药前尿NMR光谱数据为采集自对雄性Sprague-Dawley大鼠给予异烟肼(200mg/kg)后0-7小时的尿样的NMR光谱中的值(“a”峰高/尿囊素峰高)。标记数据点并使用空心三角形编码以用于模型建立数据且使用实心三角形标记用于验证数据。空心三角形表示对数据用于建立预测PLC模型的大鼠观察到和预测的结果。实心三角形表示对11只数据被从建立模型过程中排除的大鼠(序号110、111、122、125、128、135、140、144、147、167和172)观察到和预测的结果。对该附图的表观评价表明已经得到了有效的模型且它能够根据对给药前数据的分析预测峰“a”的排泄水平与尿囊素的水平的关系。
涉及附图3.1的PLS分析的回归系数如分析中所用各变量的附图3.2中所示。如上所述，这些变量来源于给药前光谱的连续部分的积分。在附图3.2中根据相关0.04ppm-宽光谱部分中心处的化学位移鉴定了PLS分析中所用的不同变量。光谱部分的回归系数的正或负值的大小越大，则对该部分的预测贡献越大且例如，集中在δ3.42处的给药前光谱部分与A给药后的浓度成反比。
附图3.3表示根据给药前尿NMR光谱数据、即Sprague-Dawley大鼠在异烟肼(200mg/kg)后排泄的化合物C进行模型建立和用于PLS模型预测的验证数据。标记附图3.3中的数据点并使用空心三角形编码以用于模型建立数据且使用实心三角形标记用于验证数据。空心三角形表示对数据用于建立模型的不同大鼠观察到和预测的结果。实心三角形表示对8只数据被从建立模型过程中排除的大鼠(序号105、108、115、116、121、142、157和163)观察到和预测的结果。将每只动物排泄的代谢物C的相对量测定为(“c”峰高/TSP峰高)*(产生的尿体积)。对该附图的表观评价表明已经得到了有效的模型。
在对数据的进一步分析中，采取不同的手段对给予异烟肼或排泄的化合物A、B和C进行定量。在该手段中，首先对来自含有三种峰“a”、“b”和“c”的δ2.24-2.12的区进行整体积分。然后获得对δ2.24-2.17(含有峰“a”和“b”)和δ2.17-2.12(含有峰“c”)区的分别的积分作为总δ2.24-2.12积分的部分，得到“部分A+B”和“部分C”。随后根据后两种量计算比值[部分C/(部分A+B)]。该手段的基本原理在于积分应提供比获自峰高测定值更好的相对量的估计值，同时认为提供表型差异的各比值(量C/量A)和(量C/量B)可以有效地被单一比值[部分C/部分A+B]]取代。部分A+B或部分C的知识的含义是可以计算比值[量C/(量A+量B)]。因此，我们尝试使用来自Umetrics的SIMCA软件建立用于根据前建立数据预测部分A+B、部分C和[部分C/(部分A+B)]的PLS模型。从而获得了三种实现成功预测[部分C/(部分A+B)]的可能方式。
我们使用对恒定总光谱数据(排除某些光谱区后)归一化的给药前NMR数据发现获得了分别根据前建立数据成功预测三种量中的每一种、即部分A+B、部分C和比值[部分C/(部分A+B)]的PLS模型。
附图3.4表示对雄性Sprague-Dawley大鼠给予异烟肼(200mg/kg)后0-7小时采集的尿中[部分C/(部分A+B)]的测定值与给药前预测值的关系的图。所示的结果仅对模拟数据而言。该图表示可以检测给药前与给药后数据的相关性。
附图3.5表示内部模型验证分析结果证实观察到的[部分C/(部分A+B)]的给药前数据与给药后值之间的相关性并非随机的。
附图3.6表示对外部产生的测试组的[部分C/(部分A+B)]的预测。在这种情况中，使用本异烟肼研究数据建立的前--给药后预测模型用于对来自实施例2中所述异烟肼研究的9只低剂量动物的结果进行测试的前--给药后预测。预测组(实心圆圈)由6只2类动物和3只1类动物组成且结果证实可以对2类测试动物成功预测[部分C/(部分A+B)]，但无法良好地对1类测试动物进行预测(RMSEE＝0.1524；RMSEP(1和2类)＝0.4416；RMSEP(2类)＝0.2325)。然而，对模拟数据(空心圆圈)的检验表明它几乎完全由2类动物组成且这为为何对2类测试动物的预测优于对1类动物的预测提供了可能的解释。然而，重要的是应注意该模型的稳定性足以为在单独研究中获得的测试数据提供一定有用的预测。
由于进一步的工作，所以证实能够进行对如实施例2中观察到的异烟肼(400mg/kg)-诱发的毒性的敏感性或无敏感性的给药前预测。然而，此处获得的决定性的结果在于可以根据给药前生物流体NMR光谱预测某些表型测定的给药后结果。
实施例4.随后给予对乙酰氨基酚(600mg/kg)的雄性Sprague-Dawley大鼠的尿对乙酰氨基酚代谢物的给药前预测。表示可以获得给药前与给药后的数值预测的实施例。
获得75只年龄和体重相近的雄性Sprague-Dawley大鼠。在给药前3天，大鼠的平均体重为260.2g(标准偏差12.6g)且在给药时大鼠约为7周龄。将它们保持在温度-、湿度-和光照/黑暗-控制的实验室内可随意引水和取标准啮齿动物膳食的单个笼中。在对笼中环境适应后开始研究。对65只大鼠口服给予在含有甲基纤维素(0.5％w/v)和Tween80(0.1％w/v)的水溶液中的对乙酰氨基酚(600mg/kg)。将10只大鼠用作对照组并仅口服给予给药载体。将来自每只大鼠的各前-和给药后24-小时尿样采集入冰冷却的容器中，该容器内还含有固定体积的叠氮化钠溶液作为防腐剂。给药前48-24小时采集给药前尿样。给药后0-24小时采集给药后尿样。在并对叠氮化物溶液进行任何校准的情况下测定每份尿样的终体积。按照包括使用固定体积的尿、尿pH缓冲溶液和TSP/D2O溶液的标准步骤制备尿样用于NMR分析。使用安装了流动探头的BrukerNMR分光计、应用Bruker的“xwinnmr”和“iconnmr”软件在600MHz下获得1H NMR光谱。使用“noesyprld”程序进行水的消除。对乙酰氨基酚-给药大鼠的给药后光谱还显示出N-乙酰基信号，发现它位于分辨率增强后的约2.18、2.165、2.155和2.15ppm处。开始将这些信号分别指定为硫酸对乙酰氨基酚(目前称作“S”)、对乙酰氨基酚葡糖苷酸(目前称作“G”)、来源于对乙酰氨基酚的硫醚氨酸(目前称作“MA”)和对乙酰氨基酚自身(目前称作“P”)。对乙酰氨基酚的硫醚氨酸(MA)有时也称作对乙酰氨基酚的N-乙酰半胱氨酸的轭合物。掺加对乙酰氨基酚葡糖苷酸和对乙酰氨基酚证实了其峰的排布且根据在1.86ppm处的相似大小的峰证实了MA乙酰基的排布。对文献(Bales等(1984)“如通过质子NMR光谱法研究的对乙酰氨基酚及其代谢物的尿排泄”(Urinaryexcretion of acetaminophen and its metabolites as studied byproton NMR spectroscopy)-《临床化学》(Clin.Chem.)，30，10，1631-1636)的参照提示对乙酰氨基酚所半胱氨酸轭合物的N-乙酰基峰能够与对乙酰氨基酚的N-乙酰基峰重叠，而实际上，看起来更可能的情况上半胱氨酸轭合物的N-乙酰基峰可以与来自硫醚氨酸的N-乙酰基峰重叠。这种情况在对MA和P定量的过程中保持一定程度的不确定性且下文当我们涉及MA和P的模型和数据时，应牢记测定的量可能含有某些来自半胱氨酸轭合物的贡献。给药后对照组样品的光谱中不存在明显的干扰。通过参比2.22-2.11ppm化学范围的相关乙酰基信号对各种对乙酰氨基酚-相关的尿代谢物、包括对乙酰氨基酚自身进行定量，不过，也能够使用其它信号。首先将给药后光谱中来自约2.22-约2.11ppm的全部N-乙酰基信号群对TSP信号积分，得到每份NMR样品中N-乙酰化种类总量的确定值。任何将给药后0-24小时期限中每只大鼠总排泄的N-乙酰化种类的相对确定值计算为(总N-乙酰基积分/TSP积分)*采集的尿体积(按毫升计)。随后使用高斯倍增(1b-1，gb 0.5)对各给药后光谱进行分辨率增强且将来自四种成分S、G、MA和P的信号彼此进行积分。对这些值求和且然后将各成分的量计算为总分数。作为N-乙酰基群中的其它成分相对不明显，将S、G、MA和P的这些分数值与每只动物的总乙酰基排泄的值合并得到该动物排泄的各成分量的估计值。计算S/G比值。按照两种不同方式使给药前光谱归一化。在第一种手段中，在从6.3-4.0ppm中排除含有残余水信号和来自受水消除步骤影响的脲的信号的区后，将9.5-0.5ppm的总光谱积分调整至获得的总面积。在第二种手段中，将给药前光谱对已经以恒定量加入到每份NMR样品中的TSP归一化。随后将TSP-归一化的给药前光谱各自乘以给药前采集过程中尿的相关体积(按毫升计)。因此，在这第二种手段中，获得了给药前脲代谢物各自24-小时排泄的相对确定值。在进行化学计量分析前排除TSP信号。
使用来自Umetrics的SIMCA软件构建给药前-给药后预测的PLS模型。
附图4.1表示给予对乙酰氨基酚(600mg/kg)的大鼠0-24小时的N-乙酰化化合物总排泄的测定值与PLS-预测值之间关系的图。所示结果仅对模拟数据而言且与该参数的第一种模型相关。该图表示了给药前和给药后数据之间的显著相关性。该模型所用的RMSEE值为7.98。
附图4.2表示给予对乙酰氨基酚(600mg/kg)的大鼠0-24小时的MA排泄的测定值与PLS-预测值之间关系的图。所示结果仅对模拟数据而言且与该参数的第一种模型相关。该图表示了给药前和给药后数据之间的显著相关性。该模型所用的RMSEE值为1.28。
附图4.3表示给予对乙酰氨基酚(600mg/kg)的大鼠0-24小时的N-乙酰化化合物总排泄的测定值与PLS-预测值之间关系的图。所示结果仅对模拟数据而言且与该参数的第一种模型相关。该图表示了给药前和给药后数据之间的显著相关性。该模型所用的RMSEE值为12.99。
附图4.4表示产生附图4.3中所示给药前预测的模型的成功体内验证。该图证实了附图4.3所示的并非随机的前-和给药后数据之间的相关性。该模型的体外验证也是成功的且产生了12.89的RMSEP值，其与该模型所用的12.99的RMSEE值相差无几。
附图4.5表示给予对乙酰氨基酚(600mg/kg)的大鼠0-24小时的对乙酰氨基酚葡糖苷酸(“G”)排泄的测定值与PLS-预测值之间关系的图。所示结果仅对模拟数据而言且与该参数的第一种模型相关。该图表示了给药前和给药后数据之间的显著相关性。该模型所用的RMSEE值为6.99。
附图4.6表示产生附图4.5中所示给药前预测的模型的成功体内验证。该图证实了附图4.5所示的并非随机的前-和给药后数据之间的相关性。该模型的体外验证也是成功的且产生了7.27的RMSEP值，其与该模型所用的6.99的RMSEE值相差无几。
附图4.7表示给予对乙酰氨基酚(600mg/kg)的大鼠0-24小时的“MA”排泄的测定值与PLS-预测值之间关系的图。所示结果仅对模拟数据而言且与该参数的第二种模型相关。该图表示了给药前和给药后数据之间的显著相关性。该模型所用的RMSEE值为1.90。
附图4.8表示产生附图4.7中所示给药前预测的模型的成功体内验证。该图证实了附图4.7所示的并非随机的前-和给药后数据之间的相关性。该模型的体外验证也是成功的且产生了1.32的RMSEP值，其与该模型所用的1.90的RMSEE值相差无几。体外验证如附图4.9中所示，其中空心圆圈为建立模型的数据且实心圆圈为不用于建立模型实践的测试数据。
附图4.10表示给予对乙酰氨基酚(600mg/kg)的大鼠0-24小时的“P”排泄的测定值与PLS-预测值之间关系的图。所示结果仅对模拟数据而言且与该参数的第二种模型相关。该图表示了给药前和给药后数据之间存在相关性。该模型所用的RMSEE值为3.51。
附图4.11表示产生附图4.10中所示给药前预测的模型的体内验证。该图证实了附图4.10所示的并非随机的前-和给药后数据之间的相关性。该模型的体外验证也是成功的且产生了3.30的RMSEP值，其与该模型所用的3.51的RMSEE值相差无几。
未对“S”排泄的给药后量直接进行给药前预测。然而，通过扣除对排泄自N-乙酰化种类总排泄预测的“G”、“P”和“MA”量的预测能够产生24-小时给药后期限中每只大鼠排泄的“S”量的给药前预测。通过将对“S”的预测值与对“G”的适宜预测值合并能够获得对每只大鼠给药后G/S比的给药前预测。附图4.12表示对“S”排泄的量测定值与预测值之间的关系。附图4.13表示对G/S比的测定值与预测值之间的关系。
本研究结果证实新方法并不限于简单预测通过乙酰化者表型测定的反应。此处出现的结果表明可以进行有关葡糖醛酸化的量和相对程度以及硫醚氨酸形成的给药前预测且在给予对乙酰氨基酚时进行。并不易于对尿中排泄的硫酸对乙酰氨基酚的量进行预测，而获得的结果提示可以检测到“附带的差异”。来源于对乙酰氨基酚的硫醚氨酸MA具有特定的毒理学意义，因为认为它来源于与谷胱甘肽轭合的毒性反应中间体。葡糖醛酸化、硫酸化和谷胱甘肽轭合是2期代谢中最重要的转化且它们各自对外源性物质具有主要防御作用。因此，本数据表明可以对大量外源性化合物的代谢和毒性进行主体特异性给药前预测。用于给出了所示的实施例，所以存在认为对代谢表型的其它方面存在给药前尿决定因素的每种理由，即可以建立给药前模型用于代谢表型的各种方面并用于由这些方面中的一个或多个控制的给药反应。
实施例5.随后给予对乙酰氨基酚(1000mg)的男性人尿对乙酰氨基酚代谢物量的给药前预测。表示可以在人中进行给药前-给药后预测的实施例。
招募99位成年男性人受试者进行经过伦理批准的临床试验。规定某些膳食限制，诸如不食用鱼且不饮酒，持续一定期限。为取得本研究的资格，受试者必须在本研究前不服用对乙酰氨基酚或其它药物一定期限。记录每一受试者的体重和身高。在研究的当天，首先由每位受试者提供“急射”的中流给药前尿样品。随后每位受试者用固定体积的水服用2×500mg对乙酰氨基酚BP片。给药后，需要每位受试者提供两个连续时间段、即从给药开始0-3小时和3-6小时内他所产生的所有尿。在这些时间期限各自结束时，需要每位受试者尽可能地完全排空其膀胱并记录每位受试者各给药后时间期限内产生的尿质量。按照标准步骤制备所有尿样用于进行NMR分析，包括使用440微升尿。使用应用Bruker的“xwinnmr”和“iconnmr”软件的Bruker NMR分光计在600MHz下获取1H NMR光谱。使用“noesyprld”程序进行水的消除。在给药后光谱中，首先将来自2.210-2.135ppm的N-乙酰基信号对TSP积分并将每位受试者的N-乙酰化种类的总排泄的确定值测定为(乙酰基积分/TSP积分)*采集的尿质量(按g计)。该公式基于尿样的密度近似恒定的推定。作为复核，测定大量有代表性的样品的样品密度且发现它们属于1.00-1.04g/ml的范围，即近似恒定密度的推定是合理的。随后使用FID的高斯倍增(1b-1，gb 0.5)对给药后光谱进行分辨率增强。如果可能，然后将硫酸对乙酰氨基酚(S)、对乙酰氨基酚葡糖苷酸(G)和未改变的对乙酰氨基酚(P)的量直接测定为来自2.210-2.135ppm的总积分分数。不能获得3-6小时采集期中排泄的未改变的对乙酰氨基酚(P)量的精确测定值且不使用该数据。对乙酰氨基酚硫醚氨酸(MA)的水平一般不会高至足以精确测定的水平。通过每位受试者在特定采集期中排泄的各对乙酰氨基酚代谢物(S、G和P)的量通过该受试者和期限中的N-乙酰化种类的总排泄量(预先计算的)乘以相关的2.210-2.135ppm积分分数来计算。如果合适，对两次采集的数据求和而得到整个0-6小时给药后期限的数据。因为任何特定的受试者接受的对乙酰氨基酚的有效量取决于其体重，所以将总N-乙酰基、S、G和P的排泄结果鱼体重数据合并而得到每kg体重的排泄量。作为在大鼠中使用对乙酰氨基酚进行研究，应注意对乙酰氨基酚的半胱氨酸轭合物已经影响了对未改变的对乙酰氨基酚的定量。按照两种不同方式使给药前光谱归一化(在排除某些区后对总光谱面积并对恒定的肌酸酐)并使用来自Umetrics的SIMCA软件构建用于给药前-给药后预测的PLS模型。
附图5.1表示服用对乙酰氨基酚(1000mg)的男性志愿者每kg体重的N-乙酰化化合物总排泄量(0-3小时采集)的测定值与PLS-预测值的关系。所示的结果仅对模拟数据而言。该图表示发现给药前和给药后数据之间存在显著的相关性。该模型所用的RMSEE值为1.12。
附图5.2表示分析与基于附图5.1的模型相关的外部试验组的每kg体重的N-乙酰化化合物总排泄量(0-3小时采集)的测定值与PLS-预测值的关系。RMSEP值为0.80，与1.12的模型RMSEE值相比良好。
附图5.3表示服用对乙酰氨基酚(1000mg)的男性志愿者每kg体重的对乙酰氨基酚葡糖苷酸(“G”)排泄量(0-3小时采集)的测定值与PLS-预测值的关系。所示的结果仅对模拟数据而言。该图表示发现给药前和给药后数据之间存在显著的相关性。该模型所用的RMSEE值为0.84。
附图5.4表示分析与基于附图5.3的模型相关的外部试验组的每kg体重的“G”排泄量(0-3小时采集)的测定值与PLS-预测值的关系。RMSEP值为0.70，与0.84的模型RMSEE值相比良好。
附图5.5表示服用对乙酰氨基酚(1000mg)的男性志愿者每kg体重的“P”排泄量(0-3小时采集)的测定值与PLS-预测值的关系。所示的结果仅对模拟数据而言。该图表示发现给药前和给药后数据之间存在显著的相关性。该模型所用的RMSEE值为0.185。
附图5.6表示分析与基于附图5.5的模型相关的外部试验组的每kg体重的“G”排泄量(0-3小时采集)的测定值与PLS-预测值的关系。RMSEP值为0.170，与0.185的模型RMSEE值相比良好。
附图5.7表示服用对乙酰氨基酚(1000mg)的男性志愿者每kg体重的N-乙酰化化合物总排泄量(0-6小时采集)的测定值与PLS-预测值的关系。所示的结果仅对模拟数据而言。该图表示发现给药前和给药后数据之间存在显著的相关性。该模型所用的RMSEE值为1.47。
附图5.8表示分析与基于附图5.7的模型相关的外部试验组的每kg体重的N-乙酰化化合物总排泄量(0-6小时采集)的测定值与PLS-预测值的关系。RMSEP值为1.13，与1.47的模型RMSEE值相比良好。
来自本研究的结果证实可以将该方法扩展至人且该方法可以成功地应用于所有的哺乳动物的原理。特别应注意该方法可以在没有进行完全膳食控制的人中起作用且使得使用这类控制可以预计改善的结果。此处提供的发现代表了对样品和数据的初步分析且模型改进也上可能的。标准分析方法、诸如带有UV-可见检测的HPLC在给药后样品中的应用能够对对乙酰氨基酚代谢物提供改善的定量且由此可以有利于模型建立。特别地，这类技术的应用应使P和MA的定量比本文所用的NMR法得到改善。此外，认为可以通过在进行PLS分析前取给药前变量(在这种情况中，为0.04ppm宽的给药前NMR光谱部分)的比值和其它组合获得改进的模型。
虚拟实施例本发明的主要特征在于能够预测对给药的反应且由此筛选合适的给药物质和治疗方案，例如药物治疗、麻醉剂等。这类方法能够基于预定标准、诸如毒性、关系和副作用鉴定合适的给药物质、确定最大或最小剂量、确定合适的剂量、合适的给药频率、合适的剂量次数并筛选合适的控释制剂。在下面的虚拟实施例中证实了这些方法的典型构建，包括鉴定抗菌物质在设定时间期限内清除特定类型感染的最低剂量。因此，可以用不同的抗菌水平治疗患有具体感染的不同模型建立群体。从分析中删除涉及无法在设定期限内清除任意受试者感染的剂量水平的数据。就各其它数据组而言，可以建立分类模型以鉴定满足清除标准的那些受试者的给药前特征和不满足清除标准的那些受试者的给药前特征。分析与各模型相关的受试者测试数据以找到与清除该表型受试者感染相关的最低剂量等同值。不必给予该剂量；例如，这类给药取决于是否可以在该剂量水平下预计不可接受的副作用。
本发明的另一个特征在于筛选用于任何目的的表型上均一组的受试者的能力。一般来说，要求筛选一组与代谢表型、例如N-乙酰化者表型的一种成分同型的受试者。就该实施例而言，可以使用攻击N-乙酰化的给药物质建立模型。然后可以按照给予的异质性标准建立分类模型。可以检验涉及与模型相关的未知N-乙酰化者表型受试者的测试数据且由此对受试者分类。可以将属于一类的受试者看作在给药物质N-乙酰化方面表型上均一。
同样，本发明使在诸如毒性或功效研究这类研究中获得的可变数据合理化。例如，在一组中产生毒性而在另一组中不产生毒性的给药方案可能上合理的，条件是通过使用给药前表型化发现一组是快速的O-甲基化器(methylator)，而其它组为缓慢的O-甲基化器(methylator)。这类表示可以要求考虑到给药物质的代谢且能够鉴定产生或消除毒性代谢物的关键O-甲基化步骤。
本发明的另一个特征在于有利于鉴定给药前生物标记或生物标记的组合，通过它们在给药前样品中的存在或浓度可以证实特定代谢表型或对可能的给药物质的特定反应。例如，在PCA中，可以将提供所关注的不同类分离的取分图与相应的加载图进行比较。然后可以鉴定提供差别的给药前变量及其与分类分离相关的肯定或否定的性质。有时这些变量可以直接由特定化合物产生。在NMR光谱数据的情况中，特定的变量或变量组合可以表示含有鉴别特征的光谱区。然后基本上可以通过检验那些模型剂量光谱区鉴定鉴别的化合物(或“生物标记”)。
有时必须从有代表性的较广泛组的受试者的大量受试者中采样。例如，一般仅能够这类植物田地上取少量植物样品。然后需要根据对选择的植物特征的分析筛选用于整个田地的特定除草剂剂量。
权利要求
1.模型的产生方法，使用该模型可以表征对受试者不给予测试物质时那些受试者的代谢表型的选定方面，或使用该模型可以在不给药的情况下预测受试者给药后的反应，其中这些反应依赖于代谢表型，该方法包括下列步骤获得与给予给药物质前多个受试者相关的给药前数据；获得与给予给药物质后多个受试者相关的给药后数据；并将给药前数据在受试者之间的变化与给药后数据在受试者之间的变化建立相关性，并且基于观察到的相关性生成给药前-给药后预测模型。
2.权利要求1的方法，其中所述的给药前和/或给药后数据获自样品，所述的样品为生物流体，诸如尿、血、血浆、血清、唾液、汗、泪、呼气或呼气冷凝物。
3.权利要求1的方法，其中所述的给药前和/或给药后数据获自样品，所述的样品为植物组织、植物流体或匀浆物、植物提取物或植物渗出物，包括例如精油。
4.权利要求1的方法，其中所述的给药前和/或给药后数据获自样品，所述的样品为人或动物组织、鱼组织或鱼油、组织提取物、组织培养物提取物、细胞培养物上清液或提取物，或来源于微生物。
5.权利要求1、2、3或4的方法，其中所述的给药前和/或给药后数据包括与化学组成或物理参数相关的数据。
6.权利要求1、2、3、4或5的方法，其中在分析前处理所述的给药前和/或给药后样品或受试者(例如用一种或多种化学试剂处理以便产生一种或多种现有物质的衍生物)，以便增加数据回收或改善样品的稳定性。
7.权利要求1-6中任意一项的方法，其中所述的给药前和/或给药后数据来源于核磁共振(NMR)波谱法和/或任意其它化学分析技术或这类技术的任意集中组合、例如GC-MS或者是使用这样的技术获得的组合数据，所述的任意其它化学分析技术为诸如质谱法(MS)、红外(IR)光谱法、气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)。
8.权利要求1-7中任意一项的方法，其中所述的给药前和/或给药后数据为物理数据或来源于其中的数据。
9.权利要求1-8中任意一项的方法，其中通过给予合适的物质对多种生化转化中的每一种产生表型化模型。
10.权利要求1-8中任意一项的方法，其中通过给予合适的物质建立用于多种给药物质中的每一种的反应预测模型。
11.权利要求1-10中任意一项的方法，其中在模式识别前，通过取现有变量的比值和/或其它组合扩展原始的给药前数据组。
12.上述权利要求中任意一项的方法，其中对给予任何特定物质的一组受试者而言，将模式识别法用于鉴定给药物质的可变代谢模式或对给药物质的可变反应模式。
13.上述权利要求中任意一项的方法，其中对给予任何特定物质的一组受试者而言，将无监督模式识别法用于鉴定与给药后数据中所关注的变化相关的给药前数据中的变化。
14.上述权利要求中任意一项的方法，其中对给予任何特定物质的一组受试者而言，将有监督模式识别法用于鉴定与给药后数据中所关注的变化相关的给药前数据中的变化。
15.上述权利要求中任意一项的方法，其中对给予任何特定物质的一组受试者而言，将数据过滤法、诸如正交信号校正(OSC)用于除去与给药后数据中所关注的变化无关的给药前数据中的变化。
16.上述权利要求中任意一项的方法，用于鉴定生物标记或生物标记的组合，所述生物标记可提供有关代谢表型的信息或可以用于预测对给药的反应。
17.测定受试者代谢表型的选定方面的方法，该方法包括下列步骤分析涉及与模型相关的未给药的受试者的数据，所述的模型描述了与多个受试者相关的给药前与给药后数据的相关性，对所述的多个受试者给予了可攻击所关注的生化转化或途径的特定物质；按照预定的模型标准产生可描述未给药的受试者的代谢表型的数值或分类。
18.权利要求17的方法，其中与未给药的受试者相关的数据获自生物流体，诸如尿、血、血浆、血清、唾液、汗、泪、呼气或呼气冷凝物；或获自植物组织、植物流体、植物匀浆物、植物提取物或植物渗出物，包括例如精油；或获自人或动物组织、鱼组织或鱼油；或获自组织提取物、组织培养物提取物、细胞培养物上清液或细胞培养物提取物；或获自来源于微生物的样品；或获自在增加数据回收或样品稳定性的处理后上述样品类型中的任意一种。
19.权利要求17和/或18的方法，进一步包括使用核磁共振(NMR)波谱法和/或任意其它技术或通过使用任意技术的组合产生与受试者相关的特征组合和/或物理数据的步骤。
20.上述权利要求中任意一项的表型化方法，用于进行代谢表型影响的危害评价的目的和/或用于目标为具体的健康监测方案的应用目的和/或用于目标为预防/预防性治疗的应用目的和/或表征保险目的的风险的目的和/或为任意其它目的、例如生育筛选受试者的目的。
21.预测受试者对给药物质的反应的方法，该方法包括下列步骤分析涉及与模型相关的未给药的受试者的数据，所述的模型描述了与多个给予了特定给药物质的受试者相关的给药前和给药后数据的相关性；并按照预定的模型标准，对为未给药的受试者预测的在用所述给药物质对受试者给药后的预测反应进行数值或分类预测。
22.权利要求21的方法，其中可以按照预定标准预测受试者应接受的物质的最大或最小剂量。
23.权利要求21或22的方法，其中可以按照预定标准预测受试者应接受的给药物质的量。
24.权利要求21、22或23的方法，其中可以按照预定标准预测应对受试者给药的频率。
25.权利要求21-24中任意一项的方法，其中可以按照预定标准预测受试者应接受的物质的给药次数。
26.权利要求21-25中任意一项的方法，其中可以按照预定标准选择受试者所用的适宜控释制剂。
27.权利要求21-26中任意一项的方法，其中与未给药的受试者相关的数据获自生物流体，诸如尿、血、血浆、血清、唾液、汗、泪、呼气或呼气冷凝物；或获自植物组织、植物流体、植物匀浆物、植物提取物或植物渗出物，包括例如精油；或获自人或动物组织、鱼组织或鱼油；或获自组织提取物、组织培养物提取物、细胞培养物上清液或细胞培养物提取物；或获自来源于微生物的样品；或获自在增加数据回收或样品稳定性的处理后上述样品类型中的任意一种。
28.权利要求21-27中任意一项的方法，进一步包括使用核磁共振(NMR)波谱法和/或任意其它技术或通过使用任意技术的组合产生与受试者相关的特征组合和/或物理数据的步骤。
29.测定受试者代谢表型的选定方面或预测受试者对给药物质的反应的方法，该方法包括下列步骤针对一种或多种预先如权利要求16中所述鉴定的生物标记分析与未给药的受试者相关的数据。
30.权利要求29的方法，其中所述的生物标记与一种或多种添加的试剂反应而产生可见的改变，诸如颜色的改变。
31.上述权利要求中任意一项的方法，用于为实验室实验或临床试验或任意其它目的筛选一组表型上均一或相似的受试者。
32.上述权利要求中任意一项的方法，基于生物流体或组织的给药前分析而用于使实验数据的生物学变化合理化，其中这类变化是因表型异质性所导致的。
33.上述权利要求中任意一项的方法，其中所述的数据总体上基于取自受试者的物理和/或化学测定值。
34.上述权利要求中任意一项的方法，其中所述的给药后数据描述了相对于给药前状态的改变，例如用降血压药治疗的人体受试者的血压降低。
35.上述权利要求中任意一项的方法，其中可以鉴定与特定模型和/或方法的极限不一致的测试数据。
36.上述权利要求中任意一项的方法，其中所述的受试者为动物，特别是哺乳动物，诸如人、小鼠、大鼠、猪、母牛、公牛、绵羊、马、狗或家兔或任意农场动物或用于运动或繁殖目的的任意动物，诸如赛马。
37.上述权利要求中任意一项的方法，其中所述的受试者为植物、鱼或任意其它水生生物体。
38.上述权利要求中任意一项的方法，其中所述的受试者为生物组织、组织培养物、细胞培养物或微生物培养物。
39.上述权利要求中任意一项的方法，其中数据获自有代表性的、或被认为有代表性的一组被视为单一受试者的受试者的样品。
40.上述权利要求中任意一项的方法，其中所述的给药物质为任意物质或物质的混合物或制剂，尤其是包括药物或医疗物质或者研究或开发中的可能成为药物或医疗物质的物质，还包括例如毒素、杀虫剂、除草剂、食品或饲料物质、食品或饲料添加剂；和任意种类的流体，包括液体、气体、蒸汽和烟，例如烟草的烟。
41.上述权利要求中任意一项的方法，其中通过任意方式或途径以主动或被动方式在任意时间期限内给予在任意基质或介质中的给药物质，所述的任意方式或途径包括例如通过注射、通过食用、通过饮用、通过吸入或通过吸烟，所述的任意时间期限包括受试者的终生或其任意具体的组成部分或部分，这类给药包括因环境接触或污染或因医疗、牙科、兽医或外科手术导致的给药。
42.上述权利要求中任意一项的方法，用于鉴定不对受试者给予测试物质时该受试者的乙酰化者表型。
43.上述权利要求中任意一项的方法，用于预测受试者对给予物质的反应，其中该反应依赖于乙酰化者表型。
44.上述权利要求中任意一项的方法，用于预测受试者对异烟肼诱导的毒性的敏感性。
45.上述权利要求中任意一项的方法，用于预测受试者对半乳糖胺诱导的毒性的敏感性。
46.权利要求1-43中任意一项的方法，用于预测受试者对对乙酰氨基酚诱导的毒性的敏感性。
47.产生权利要求1-15中任意一项的模型的设备。
48.用于反应预测和/或代谢表型化的设备，该设备包括一种或多种模型，每种模型模拟与多个给予特定给药物质的受试者相关的给药前和给药后数据的相关性；处理器，它用于分析涉及与模型中的至少一种相关的未给药受试者的数据，由此测定未给药的受试者的代谢表型的一个或多个方面或预测其对按照所用模型给药的反应。
49.权利要求48的设备，该设备进一步安排成产生权利要求1-15中任意一项的一种或多种模型。
50.权利要求47-49的设备，进一步包括一种或多种用于进行物理和/或化学分析的分析仪器或装置，所述的物理和/或化学分析为诸如NMR波谱法、质谱法、红外光谱法或高效液相色谱法。
51.用于鉴定权利要求16的一种或多种生物标记的设备。
52.上述权利要求中任意一项的设备，其可基于应用已经预先如权利要求16和/或51中所述鉴定的一种或多种生物标记而用于反应的预测或代谢表型化。
53.用于代谢表型化或用于预测受试者对给药的反应的设备，该设备包括接受来自待测试受试者的样品的测试区，所述的测试区可导入一种或多种试剂，这些试剂可以与样品中的一种或多种生物标记发生化学反应而在测试区产生可见表象的改变，所述生物标记是已经预先按照权利要求16和/或51鉴定出来的且产生的测试区的可见表象为代谢表型的特征或对给药反应的预测。
54.用于进行权利要求21-26中所述方法的设备，其中可以鉴定对受试者合适的给药方案。
55.权利要求47-54中任意一项的设备，其基于对是针对特异性生物标记的抗体的应用。
56.权利要求47-55中任意一项的设备，其中通过使用例如固定在固相支持物上的酶的酶催化反应检测选定的生物标记和/或对其定量。
57.包括通过权利要求1-15中任意一项的方法产生的一种或多种模型的设备。
58.权利要求47-57中任意一项的设备，其进一步安排成可鉴定与特定模型的极限不一致的测试数据。
全文摘要
本发明提供了模型的产生方法，使用该模型可以表征对受试者不给予测试物质的那些受试者的代谢表型的选定方面或使用该模型可以在不给药的情况下预测受试者给药后的反应，其中这些反应依赖于代谢表型，该方法包括下列步骤获得与给予给药物质前多个受试者相关的给药前数据；获得与给予给药物质后多个受试者相关的给药后数据；并将给药前数据中受试者之间的变化与给药后数据中受试者之间的变化建立相关性且基于观察到的相关性生成给药前－给药后预测模型。该模型用于测定受试者代谢表型的选定方面或用于在不给药的情况下预测受试者给药后反应。这一目的通过下列步骤实现当给予可攻击所关注的生化转化或途径的特定物质时，分析涉及与模型相关的未给药的受试者的数据，所述的模型描述了与多个受试者相关的给药前与给药后数据的相关性；并按照预定的模型标准产生可描述未给药的受试者的代谢表型的确定值或分类。
文档编号G06F19/00GK1701334SQ03815559
公开日2005年11月23日 申请日期2003年6月16日 优先权日2002年6月14日
发明者T·A·克莱顿, J·R·埃弗里特, J·C·林顿, J·K·尼克尔森 申请人:辉瑞大药厂