专利名称：核酸测序系统以及方法
核酸测序系统以及方法
相关申请的交叉引用因此，本发明提供了一种用于对多个核酸进行测序的方法，它可包括 以下步骤(a)通过一种系统开始对于包括多个核酸的一个阵列的一个测序过 程的循环，该系统能够确定该阵列的核苷酸序列；(b)评估该系统的一个参数； (c)基于该参数改变对于该阵列的测序过程；并且(d)对于该阵列进行另一个 循环的测序过程。—种用于多个核酸的测序的方法可包括以下步骤(a)将一种工作流 体《I入处于一个系统里的一个阵列或多个核酸中，该系统对于该阵列进行一个 核酸测序过程；并且(b)通过该系统对于该阵列进行至少一循环的测序过程； 其中在引入该阵列之前将该工作流体加热或冷却。
00101 —种用于对多个核酸进行测序的方法可包括以下步骤(a)通过一种 系统对包括多个核酸的一个阵列进行测序过程的一个循环，该系统能够确定该 阵列的核苷酸序列；(b)检测表明该阵列的位点上存在多个核苷酸的多个信号； 并且(c)重复步骤(a)以及(b);其中步骤(a)以及(b)的时序安排暂时被解
除联系。 还提供了一种用于对多个核酸进行测序的系统，包括一个射流运送系 统用于协助多个测试反应方案； 一个成像系统，用于获取测序数据；多个诊断 部件，这些诊断部件被配置为在该测序系统的运作过程中测量多个系统参数； 质量评估电路，该质量评估线路被配置为基于一种多步骤的分析对该测序系统 的质量进行评定；以及控制电路，该控制电路被配置为基于由这些诊断部件或 该质量评估电路所收集的数据来改变该测序系统的运行状态。
7附图
图6是一个流程图，该流程图展示了根据本技术的多个方面用于一种 初始测序循环的质量控制方法的示例性逻辑，这样来确定有待测试的样品的质
量；
0021] 图7是一个流程图，该流程图展示了根据本技术用于控制碱基或核苷 酸加入的质量的示例性逻辑；以及
00221 图8是一个流程图，该流程图展示了根据本技术的多个方面用于对质 量控制解除阻断的示例性逻辑。
详细i兌明 测序仪12包括一个射流控制/输送系统18以及一个检测系统20。射 流控制/输送系统18将接收多个工作流体(如总体上由参考标号22所表示)， 用于循环通过处理中的样品的多个样品容器(总体上由参考标号24所标明)。 如本领域的那些普通技术人员将会理解，这些工作流体将根据测序的特定阶段 而变化。例如，在使用这些已标记的核苷酸的SBS中，被引入样品中的这些工 作流体将包括一种聚合酶以及四种常见的DNA类型的多种有标记的核苷酸， 每种核苷酸具有一个独特的荧光标签以及与其连接的一种阻断剂。该荧光标签 允许检测系统20在该阵列的单独的位点上检测哪些核苷酸是最后被加到与模 板核酸进行杂合的探针上，并且该阻断剂在每个位点防止每个循环中加入多于 一个的核苷酸。在其他的处理中，例如边测序边连接，这个阶段的工作流体将 包括多种询问探针，这些询问探针带有附着至其上的独特的荧光标签。类似地， 这些询问探针将在一个构型中的每个位点处结合至这些模板上，该构型允许这
9些询问探针连接至一个锚定引物上并且可由检测系统20进行检测用于每个位 点上的模板的测序。 虽然以上关于通过样品的物理性移动将样品与不同站点相互作用的 系统已经对该系统进行了示例说明，但应理解在此给出的原理还可应用至一种 系统，其中通过不要求移动样品的其他装置而实现了在每个站点处发生的步
1骤。例如，在这些站点处存在的试剂可通过连接至包含不同的试剂的储存器的 一个流体系统被输送至一个样品上。类似地， 一个光学系统可被配置为检测一 个样品，该样品与一个或多个试剂站点处于流体联通。这样，多个检测步骤可 在输送在此说明的任何特定的试剂之前、过程中或之后实施。因此，通过中断 一个或多个处理步骤可将样品从处理中有效地去除，无论这些步骤是进行液体 输送或光学检测，而不必将样品从其在装置中的位置上物理性地去除。 然后该反向光束通过反向光束光学部件54被返回，该反向光束光学 部件可对该光束进行滤波，这样使得该光束中不同的波长分离开，并且将这些 分离的光束指向一个或多个照相机56。照相机56可基于任何适宜的技术，如 包括电荷藕连器件，该器件基于在器件中光子碰撞的位置生成像素化的图像数 据。照相机生成图像数据然后被传送至图像处理电路58中。总体而言，处理 电路58可进行不同的运作，如模拟-数字转换、比例缩放(scaling)、滤波、 以及将多帧中的数据的相关联，以适当地并准确地对样品上特定位置处的多个 位点进行成像。图像处理电路58可存储图像数据，并最终将图像数据传送至 后处理系统30中，在该后处理系统可从图像数据中推导出序列数据。可在检 测站点上使用的特别有用的检测装置包括，例如在US 2007/0114362 (美国专利申请系列号11/286,309)以及WO 07/123744中描述的那些检测装置，每个 专利申请通过引用结合在此。 图5代表了根据这一方法用于执行并控制测序运作的示例性逻辑。该 测序运作(总体上用参考标号94表示)从在该测序系统中加载一个样品阵列 开始，如在步骤96中所示。如以上所指出，可采用许多不同的方法，如可以 采用多个阵列的不同配置。例如，在一个目前所考虑的实施方案中，采用了众 多在遗传上不同的位点的多个阵列，其中每个位点具有众多相同的寡核苷酸、 模板、或有待测序的片段。该阵列可加载在一个样品容器中并且被结合至射流 控制/输送系统上，这样使得试剂以及其他工作流体可被引入样品中并巡行通过 该样品容器用于多种反应(例如碱基加入以及解除阻断)、冲洗、等等。
对存在过多的位点或位点分布不均匀的另一种响应可以是将某些区 域或位点掩蔽并且在处理过程中忽略来自此类区域的图像数据。在步骤130中 所表示的掩蔽响应总体上会包括对于像素化图像发展一种数字掩蔽，其中对应 于特定位点的特定位置被标明为第一个值，并将有待分析的位点标明为第二个 值。这种二元掩蔽总体上会作为一个查询表来存储，该查询表允许在随后的测 序循环中对掩蔽像素的位点进行比较，使得此类位置的数据将不会为了分析以 及测序而进行处理。然而，有、可能这种掩蔽会导致来自测序的过多位点甚至 样品阵列的大区域的消失，这样对样品采取进一步处理变得不经济或者另外是 不可取的。于是，在步骤132中，可能希望确定掩蔽是否已经导致过少的位点。 如同步骤118—样，这一询问可基本上由以下确定事项构成确定在数字掩蔽 之后剩余位点的数目是否使测序就可收集的数据的量值而言值得进行。如果在 步骤130进行掩蔽之后用于测序的可利用的位点过少，则该掩蔽可如在步骤 134所示重新进行评估，以此来确定是否对某些位点可靠地进行测序。然后可 相应地改变掩蔽并且可进行测序。如果用于测序的可利用的位点过少，则测序 可被完全中断。 可被监测的图像质量的另一个方面是该样品之内存在的气泡。如果检 测到气泡，则图像数据、或部分数据对于进一步处理可能是不适当的。例如， 图像数据可表现为具有模糊的区域或检测的颜色无法区分的区域。此外，气泡 的存在可意味着一个具体样品的潜在问题。例如，气泡可阻碍核苷酸附着至样 品上。可在流体通道之内通过光电二极管或其他检测器(例如一个检测器，该 检测器被配置为监测在对空气与液体之间折射率差异感应的二极管所接收的 信号中的变化)对气泡的存在进行检测。如果检测到气泡，则可执行任何数目 的适宜的响应步骤。例如，该情形可能要求将样品返回特定的射流站点并且再 次执行碱基加入步骤。在用空气而不是液体将这些通道从上到下进行充满的情 况下，有可能自动调整焦深，以便恢复"干，，图像的焦点，或者简单地使更多 液体流动通过该通道以便去除空气的气泡。另一种可能的响应可包括掩蔽某些 区或位点并且忽略已确定为包含气泡的区域以及位点的图像数据。再另 一种响 应可包括如果确定气泡是一种有害成分以至适当的成像已不再可能，则中断该 样品上的测序运作。
0068应当注意的是类似于步骤136的询问、以及响应(如在步骤138以及 140上所总结的那些响应)也可以是参照图6在以上所总结的初始循环质量控制例行程序的一部分。即，有可能样品的质量控制被流体输送系统或检测系统的不良作用打了折扣。在此类情况中，还可执行多种例行程序(例如那些旨在
步骤138以及140上的例行程序)以确保在可靠的信息的基础上进行样品质量
评估。在希望的情况下，可对测序系统的参数进行调整并且对样品进行再次成像，并且基于改进的输入数据对样品质量进行再次评估。
[0069如以上所指出，样品阵列可被设计为协助某些类型的质量控制。例如，具有已知的核苦酸序列的对照束或位点可包含于在阵列中。例如，此类已知的序列可以是四种常见的DNA核苷酸的重复序列。作为替代，此类对照位点可包括单一核香酸类型的均聚物序列。在例行程序106中执行的质量控制可依赖于连续的测序以及成像步骤的过程中对于此类对照物的预期的结果，它们与未知组合物的位点的测序以及成像步骤平行进行，对于这些未知组合物而言序列信息是所希望得到的。然后，如在步骤142上所示，可作出对此类对照位点的评估以确定碱基预计的加入是否已经被检测到。因为此类对照位点的序列是已知的，所以这种评估可确定(例如)没有加入碱基、加入错误的i成基、或检测到碱基结合的低产量(例如，在一个对照位点上预期的特征性染料颜色光强是弱的或被另一种颜色使其变模糊)。可包括的另一种类型的对照是具有直接附着的标记部分的位点。例如，在针对使用荧光标记测序的实施方案中， 一个位点可包括直接附着的荧光标记(例如，不通过经杂合的寡核苷酸)以作为一种对照用于独立于测序化学的其他方面的检测质量(例如，杂合以及核苷酸加入的效率)。
[0070加入碱基失败可通过图像数据中的单一光强来表明，该光强低于所希望的阈值。加入错误的碱基可通过在图像数据中(例如在对照位点上)与预计的颜色信号相比被检测到的不同的颜色信号来表明。对于低产量的石咸基结合的表示可以(如以上所表示)是一个信号强度，该强度低于预期的强度，类似于没有加入碱基的测试。预期的强度可以是一个特定的阈值水平，该水平在全部循环中保持不变。作为替代，根据每个步骤的可接受的产量损失或根据从一个或多个先前循环中所检测到的信号中确定的经验确定的产量损失能够在每个循环上降低阈值水平，例如，象以下关于信噪比(S/N)的说明。[0071可以设想几个应答来用于改进测序、图像数据、或序列数据，其中询问142确定了对照位点的成像是有缺陷的。例如，如在步骤144中所示，该系统可对流体输送以及检测系统进行询问以确定运作参数是否在可接受的范围内。可替代地，或除了这一步骤之外，碱基加入步骤可如步骤146所示来进行重复。总体而言，步骤146，如同以上说明的再次成像步骤一样，可要求将样品返回至射流站点中用于石咸基的加入。
[00721 此外，可使用几种参数以帮助监测成像以及测序运作。如在整个本披露中的不同段中所提及的，那些参数可包括与化学有关的参数(例如评估试剂输送)、与基准物有关的参数(例如对照束)、样品位点参数(例如位点质量、分布、形状、数目、等等)、以及温度参数(例如流体温度、阵列温度、仪器温度、等等)。然而，许多其他参数可证明在确定测序运作是怎样成功地进行中是有用的。例如，可对不同环境参数进行监测以提供关于外部因素可怎样影响测序运作的输入。这些环境参数可包括(而无限制)湿度、外部电源、温度、振动、等等。此外，监测流动单元下游的pH水平可以证明是有用的。这样做可产生关于以下问题的了解碱基加入、阻断、解除阻断、以及洗涤的步骤是在多么有效地进行着。还可能令人希望的是来对在单独的样品位点之间发生的任何定相进行监测。例如，在一个样品位点上的序列的多个单独的拷贝可经历核苷酸不附着的多个循环。结果是一个位点在所延伸的种类的长度上具有异质性。如果在每个循环上被截短的拷贝数增加，则最后在该位点上在每个循环中已经被延伸的拷贝部分被减少。这导致了该位点具有多个拷贝，这些拷贝是异相的并且在信噪比中可感知的减少。最后，这可导致一种情况，其中S/N比退化至如此的一个水平以致测序数据变得不可靠。显示出高水平的具有定相问题的位点的流动单元的早期;险测可允许采取^"施来确保样品没有完全丢失，例如改变测序试剂或检查仪器的射流部分。可替代地或另外地，可做出决定中断将试剂输送到具有不令人希望的数目的异相位点的样品中。这可提供降低样品浪费的优点。跟踪过早的定相问题可为确定仪器的功能性提供基础，该问题可通过由操作员或根据预计的原因以自动化的方式进行改变而被响应。[00731 可在碱基加入质量控制例行程序中进行的另 一个询问是在步骤148中表示出，并且可包括确定信噪比是否在可接受的限制之内。总体而言，如以上所指出，对于单独的位点的荧光染料的颜色的检测可以是用于确定序列数据的基础，并且准确地检测此类颜色的能力对获得可靠的序列数据可能是重要的。例如，可通过对多个单独的位点、或多个对照位点的光强或颜色与在之前的多个循环中针对类似位点的信噪比进行比较而确定不良的信噪比。可以预计，由于在一系列的测序循环中用于核苦酸结合的产量在统计学上可接受的衰减，所以应该预计到信噪比的正常衰减。的确，确定测试是否应该通过一个额外的循环进行或者甚至对于当前循环是否应该对序列数据或者图像数据进行分析或储存可通过参考信噪比的衰减或这一比例的客观性限制来确定。当信噪比不正常地或以一种突难性的方式衰减时，几种响应也许可供J吏用，例如在进行测序化学以及检测的另一个循环之前改变试剂(例如仪器上的扫描緩冲液)。应该注意的是作为一种替代，或除了分析信噪比的衰减之外，可在流出液流中对来自解除阻断的试剂的信号进行衰减。
[0074
除了终止测序外，对在步骤148上检测到的信噪比减低的响应可包括如在步骤150上所示对流体输送以及检测系统进行询问，以此确定系统是否在他们的正常参数内运作，或者是否对系统进行调整以允许进一步测序。可替代地，或除此之外，用更高的曝光水平(例如对光源的较高的功率输出)、在检测算法中较高的灵敏度、或任何其他参数(它们可允许对信噪比进行改进)(步骤152)的变化对样品进行再次成像。例如，将曝光的时间延长以允许在特定的图像中收集更多的光子。同样令人希望的是改变成像参数(例如扫描率)以允许对位点进行更准确、或更高分辨率的检测。其他可被改变的参数是用于核苦酸加入的条件。例如，随着信噪比减低，每个后续的循环的实行可用更长的孵育时间或者增加试剂浓度来帮助更好地推动核苷酸加入反应至完成。如果能够以此类方式将信噪比改进至一个可接受的水平，则测序可以继续。[0075图8展示了目前所考虑的逻辑用于解除阻断质量控制例行程序116,参见图5总体上如以上所讨论。总体而言，这一例行程序被设计为确定染料以及解除阻断的试剂在单独的位点上是否已充分地从最后被加入的核苷酸中去除，这样能下一个测序循环中够在加入另一个核苷酸，并且确保之前加入的核苦酸的染料将不干扰随后加入的核苷酸的成像。与以前一样，几个询问可依次进行以确定是否已经充分地进行了解除阻断。例如，在步骤154中，可进行一个询问，该询问与在解除阻断后之后制做的图像是否适合用于分析。如以上参
照图7的步骤136所讨论，几个因素可造成有待获得的图像不足够清晰或详细。然后，在与图7的响应138以及140相类似地方式中，可对流体输送以及检测系统进行询问，并且在解除阻断后用于对样品进行成像的成像系统可进行再次聚焦并且对样品进行再次成像，分别如在步骤156以及158上所示。然而，如本领域的那些普通技术人员将会认识到，将对在步骤156检查的流体输送系统进行评估以确定用于切割解除阻断的试剂以及焚光染料的试剂是否在正常限度内或以令人希望的方式运作。
0076如果在步骤156以及158上的响应能适当地补救该条件，则可进行随后的询问160。步骤160基本上与参见图7在以上所总结的步骤148相类似。即，该系统可确定信噪比是否足够高以允许解除阻断的适当分析。如果该比例不足够高或者不在可接受的范围内，则响应可再次包括对流体输送以及检测系统进行询问、并且用已修改的成像设置对解除阻断的样品进行再次成像，分别如步骤162以及164上所示。
[0077在示例性的例行程序116中的另一个询问可包括确定解除阻断的试剂是否已经被充分地去除，如在步骤166中所示。目前针对这一评估考虑两种测试，它们可以替代地进行或者两个测试均可进行。总体而言，第一个测试是基于以上所讨论的类型的对照位点的评估。对此类位点可以成像以确定是否发生了预期的颜色变化(例如，基本上该位点从该图像上消失)。如果这些对照位点不表示进行了有效的解除阻断，则可如在步骤168所表明对解除阻断的运作进行重复。再者，重复解除阻断的运作可要求将样品返回至解除阻断站点上。如果希望的话，还可对除对照位点之外的位点进行成像以便询问解除阻断是否已经发生。
[00781 用于解除阻断的另一个测试可以是在解除阻断的步骤之后对废液中的解除阻断剂或流出液流的评估。如本领域的那些普通技术人员将会认识到，阻断剂可与将活化的染料相结合并且一旦已将阻断剂从核苷酸中去除阻断剂就能发出荧光。通过在特定波长的吸收也可以检测到在流出液中的阻断剂。可对废液流进行测试，例如使用？ 1向流出液流的线内检测器，以确定在废弃液流中是否检测到足够的阻断剂。如果检测到阻断剂不足，则可能的响应可以是对用于解除阻断的反应的工作流体的流体输送系统进行询问和/或重复解除阻断
的运作，分别如在步骤170以及172上所示。取决于所使用的测序化学作用，
被加入的核普酸上的 一 个单 一部分可作为阻断基团用于抑制延伸并且作为一 个标记用于检测核苷酸的加入或，可替代地，被加入的核苷酸可具有独立的标 记以及阻断部分。在此所给出的关于确定去除阻断基团的这些方法旨在是对用 于确定单独或总体地去除一个标记部分和/或阻断部分的多种方法的说明。例 如，在使用分离的标记以及阻断部分的实施方案中，使用一些方法(类似于以 上所示例说明的那些与检测阻断基团有关的方法)可在流出液中对这些部分进 行去除并且分别地或 一起进行检测。
[0079应该注意的是在图6、 7、以及8中所总结的所有步骤中，所进行的运 作的日志以及所采取的任何补救措施优选地要进行保存。这些日志还可与单个 的样品相关联，并且可进行时间标记以评估测序系统的适当性能。在测序运作 是由或可由一个或多个操作员来照管时，通过视觉或听觉警报的通知可提供给 操作员，表明也许应当对测序系统中对一个或多个样品或对一个或多个站点给 予注意。
[00801 应该注意，根据本发明可能存在这些测序步骤的一种实质性的暂时解 除联系以及在质量控制例行程序中所采取的多种补救措施。即，虽然可将测序 系统设立为处理多个样品以及多个样品容器，它们并不需要通过系统以任何特 定的顺序、或者甚至以相同的速度来进行处理。例如，基于样品的质量、处理 参数、以及不同质量控制步骤以及例行程序的结果，某些样品可通过这些测序 站点以及测序步骤进行某种程度的倒退流动。在某些例子中，样品可被放在一 边或置于系统之外一定的时间段用于样品或系统之一或这二者的评估。系统控 制电路可优选地被设计为跟踪多个单独的样品以及所进行的测序，无论样品是 否从序列中取出、取自不同的时间、或甚至样品是否要求更长或更短的时间来 进行不同的反应、成像、评估、等等。这种暂时的解除联系在促进有效地运作 以及样品的自动化或半自动化的平行测序的高通过量中是一个重要的特征。 [00811虽然仅对本发明的某些特征在此进行了解释和说明，本领域的普通 技术人员将会想到许多修改以及变化。因此，应理解所附的权利要求旨在 涵盖落入本发明的真实精神范围之内的所有此类修改以及变化。
权利要求
1.一种用于对多个核酸进行测序的方法，包括(a)通过一种系统开始对于包括多个核酸的一个阵列的一个测序过程的循环，该系统能够确定该阵列的核苷酸序列；(b)评估该系统的一个参数，其中该参数与经过多个测序循环信噪比中的衰减有关；(c)基于该参数改变对于该阵列的测序过程；并且(d)对于该阵列进行该测序过程的另一个循环。
2. 如权利要求1所述的方法，其中该参数与该阵列的多个样品位点之间的定相有关。
3. 如权利要求1所述的方法，其中该参数与该阵列的一个对照束的一种质量有关。
4. 如权利要求1所述的方法，其中该参数与用于对该阵列进行测序的一种试剂有关。
5. 如权利要求4所述的方法，其中该参数包括该试剂的一个体积。
6. 如权利要求1所述的方法，其中该参数包括用于对该阵列进行测序的一个光学成像系统的一个参数。
7. 如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括将多种核苷酸重复引入该阵列中。
8. 如权利要求l所述的方法，其中步骤(c)包括评估一种试剂输送系统的运作。
9. 如权利要求l所述的方法，其中步骤(c)包括对该阵列重新成像。
10. 如权利要求9所述的方法，其中采用一个更长的曝光或者一个更高的成像系统灵敏度对该阵列重新成像。
11. 如权利要求l所述的方法，其中步骤(c)包括选择该阵列的某些区域，对于这些区域成像数据将被用于测序。
12. 如权利要求11所述的方法，其中步骤(d)包括仅对该阵列的这些选择的区域收集成像数据。
13. 如权利要求11所述的方法，其中步骤(d)包括对该阵列的所有区域收集成像数据。
14. 如权利要求13所述的方法，其中对该阵列的未被选择用于进行测序的区域的成像数据进行存储。
15. 如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括中断该测序过程并且不执行步骤(d)。
16. 如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)以及(c)是由一位人类操作员基于由 一个计算机系统生成的分析来执行的。
17. 如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)以及(c)是由一个计算机系统来执行的。
18. —种用于对多个核酸进行测序的方法，包括(a) 进行一种自动化的核酸测序运作；(b) 基于该运作生成数据；并且(c) 基于这些数据评估该样品的一种质量。
19. 一种用于对多个核酸进行测序的方法，包括(a) 通过一种系统对包括多个核酸的一个阵列进行一个测序过程的循环，该系统能够确定该阵列的核苷酸序列；(b) 检测表明存在于该阵列的多个位点的核苷酸的多个信号；(c) 评估这些信号以确定该阵列的质量；并且(d) 基于该质量改变对于该阵列的测序过程。
20. —种用于对多个核酸进行测序的系统，包括一个射流运送系统，用于协助测试多个反应方案；一个成像系统，用于获取测序数据；多个诊断部件，这些i貪断部件;陂配置为在该测序系统的运作过程中测量多个系统参数；质量评估电路，该质量评估电路被配置为基于一种多步骤的分析对该测序系统的 一种质量进行评定；以及控制电路，该控制电路被配置为基于由这些诊断部件或该质量评估电路所收集的数据来改变该测序系统的运作条件。
全文摘要
披露了一种以自动化或半自动化的方式对核酸进行测序的技术。在多个循环中对众多核酸位点的多个样品阵列进行处理以将多种核苷酸加入有待测序的材料中，对加至多个位点的核苷酸进行检测，并且将所加入的核苷酸与被用于鉴定最后加入的核苷酸的阻断剂以及标签进行解除阻断。对该系统的多个参数进行监测以便在这些样品的测序过程中对多种问题在它们发生时能够进行诊断并校正。在测序过程中运行多个质量控制例行程序以确定样品的质量、以及所收集的数据的质量。
文档编号G06F19/22GK101652780SQ200880006704
公开日2010年2月17日 申请日期2008年1月28日 优先权日2007年1月26日
发明者C·赵, D·L·海纳, K·冈德森, R·C·凯恩 申请人:伊鲁米那股份有限公司