基于高内涵成像系统的芳基磷酸酯类阻燃剂血管毒性的评价方法与流程

本发明涉及一种血管毒性的评价方法，属于毒理学化学物毒性评价技术领域，特别涉及一种基于高内涵成像系统的环境污染物芳基磷酸酯类阻燃剂血管毒性的评价方法。

背景技术：

随着社会经济的快速发展，大量的化学物涌入人类的生产﹑生活和周围环境，由此产生危害人体健康的安全问题日益突出。对这些化学物进行合理的综合毒性测试，是风险评估和风险管理的基础。其中，化学物的血管毒性评价目前主要是基于体外实验，体内实验常用的动物模型主要有小鼠、鸡胚等。近些年，出现了利用激光共聚焦等成像方法对转基因斑马鱼进行血管图像采集分析，测试化学物的血管毒性。

相较于传统的激光共聚焦显微镜，hcs可以在短时间内检测大量化合物在一种或多种生物样品的活性。高内涵成像系统通过自动化成像的方法，可以在单一实验中对大量目的生物样品进行多水平的状态等同步获取高可靠性的图像；同时去除人为误差的对成像的干扰。

传统的毒性测试方法低通量、低效率、成本高、暴露方式和观察指标单一；且具有获取信息有限等缺点。获取的心血管毒性参数的化学污染物数量较少。

因此，亟待在此基础上建立覆盖面更广的新的评价范式和体系，对具有血管潜在风险的各类环境污染物亟需开展广泛和深入研究，开展早期风险评估和健康预警，为环保新型化学品的开发提供参考依据。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于高内涵成像系统的芳基磷酸酯类阻燃剂血管毒性的评价方法，能够快速准确地对芳基磷酸酯类阻燃剂等化合物进行血管毒性评价与筛选。

为了达到上述目的，本发明采用以下的技术方案：

本发明提供了一种基于高内涵成像系统的芳基磷酸酯类阻燃剂血管毒性的评价方法，包括以下步骤：

1)获取芳基磷酸酯类阻燃剂处理的斑马鱼胚胎/幼鱼血管荧光图像；

2)血管图像分割识别与分析；

3)获得评价和筛选结果。

进一步地，步骤1)中，利用高内涵成像系统获取特异性血管荧光标记的整体转基因斑马鱼胚胎/幼鱼血管图像。

更进一步地，步骤1)中包括以下步骤：

1.1)上机：运行高内涵成像系统，载入装有环境污染物处理的斑马鱼胚胎/幼鱼的96孔板；

1.2)设置预扫图像分析程序：识别488nm通道区域面积大于或等于100000像素并且荧光强度高于400，保存命名为“findingfish”；

1.3)设置成像程序参数：

①选择5x物镜非共聚焦模式，488nm通道(参数设置：曝光时20ms；激光功率50％；拍摄高度500um)，选中所有孔以及镜头，分析程序设置为“findingfish”，保存好程序命名为“pre”；

②选择10x物镜共聚焦模式，488nm(参数设置：曝光时间300ms；激光功率100％)以及明场(参数设置：曝光时间20ms；激光功率50％；拍摄高度500um)双通道，层扫模式(参数：起始处为300um，20um/层，20层)，选中所有孔以及镜头，保存好程序命名为“re”；

1.4)成像与图像保存：使用预扫模式，分别载入“pre”以及“re”两个程序，命名实验名称，运行程序进行高内涵全自动成像，选择荧光增强模式，以bmp格式保存斑马鱼胚胎或幼鱼血管荧光图并按编号命名。

进一步地，步骤2)中，所述血管图像分割识别与分析运用photoshop及matlab两款软件，通过录制宏与编写算法对目标血管进行批量半自动识别、输出与分析形态学等参数改变。

更进一步地，步骤2)中，所述目标血管分割方法，为选取肠下静脉丛和尾静脉末端(体节间血管最后一节之后对应的尾静脉区域)作为目标血管，联合两种血管参数进行评价与筛选。

更进一步地，步骤2)中，所述目标血管分割方法，为人工分割出包含目标血管的区域，结合photoshop宏录制工具，半自动批量地对图像中的目标血管进行简单的区域分割与图像保存。

更进一步地，步骤2)中，所述血管图像识别与分析方法，为于matlab软件平台编写目标血管轮廓自动识别算法，能够批量输出血管形态学参数。

更进一步地，步骤2)中，所述目标血管轮廓自动识别算法，为选取包括血管面积、周长、血管网格数、圆度、椭圆度、外接最小矩形长和宽等形态学参数作为算法输出结果。

另外，本发明还提供了一种基于高内涵成像系统的环境污染物血管毒性的评价方法的应用，具体而言，是在评价芳基磷酸酯类阻燃剂心血管潜在风险的应用。

进一步地，该应用包括步骤：

利用高内涵成像系统获取特异性血管荧光标记的转基因斑马鱼胚胎/幼鱼血管图像，并运用photoshop及matlab软件对图像中心包和目标血管进行半自动识别分析形态学等参数改变，快速准确地对芳基磷酸酯类阻燃剂等化合物进行血管毒性评价与筛选。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明利用高内涵成像系统对暴露于化学物的转基因荧光斑马鱼进行高通量血管图像采集，结合photoshop、matlab等软件对图像进行半自动识别分析，具有高通量的特征，能够快速对多种化合物，多参数指标地进行血管毒性评价。

2)相较于传统的利用激光共聚焦显微镜逐一进行图像获取，并手动描出目标血管以获取少量参数；本发明的评价和筛选方法通过高内涵成像系统自动化成像的；可以在单一实验中对大量斑马鱼进行同步获取高可靠性的图像数据；能够在短时间内对大量芳基磷酸酯类阻燃剂进行多参数的血管毒性评价与筛选，同时去除人为误差的对图像获取的干扰。

3)此外，本发明的方法还适用于评价其他具有血管潜在风险的各类环境污染物，开展早期风险评估和健康预警，为环保新型化学品的开发提供参考依据。

附图说明

图1为基于高内涵成像系统的芳基磷酸酯类阻燃剂血管毒性的评价方法流程图；

图2为96孔板斑马鱼幼鱼定位梳子；

图3为琼脂糖包被的96孔玻底板胚胎/幼鱼排列设计(nc：空白对照；d：剂量组)；

图4为使用adobephotoshopcs5软件套索工具截取区域；

图5a、5b分别为使用matlab软件运行肠下静脉丛血管图像识别分割算法效果图；

图6为tphp暴露的斑马鱼幼鱼肠下静脉丛和尾静脉末端相关参数统计结果；

图中：a为肠下静脉丛血管面积；b为尾静脉面积；c为肠下静脉丛血管网格面积；d为肠下静脉丛血管网格数。

具体实施方式

本发明公开了一种基于高内涵成像系统的芳基磷酸酯类阻燃剂血管毒性快速评价和筛选方法，运用高内涵自动化成像采集转基因斑马鱼血管荧光图像，结合机器学习的方法通过算法对目标图形进行半自动识别以及参数获取，通过采集特异性血管荧光标记的转基因斑马鱼胚胎/幼鱼的血管图像，分析心血管多参数变化实现对芳基磷酸酯类阻燃剂血管毒性评价和筛选。

该评价和筛选方法配置包括硬件系统和软件系统两份部分。硬件系统负责血管图像数据的获取，由高内涵成像系统及配套琼脂糖包被的96孔玻底板组成。

软件系统用于图像中目标血管的半自动识别以及多参数分析，涉及photoshop及matlab两款软件。

本发明具有高通量的特征，结果稳定，能够快速准确地对芳基磷酸酯类阻燃剂等化合物进行多参数指标的血管毒性评价与筛选。

通过目标血管参数特征快速准确地芳基磷酸酯类阻燃剂等化合物进行血管毒性评价与筛选，具体步骤如下：

一、获取环境污染物处理的斑马鱼胚胎/幼鱼血管荧光图像

1.转基因斑马鱼胚胎的化学处理与培养：

每个60mm玻璃皿放置25枚tg(kdrl：egfp)转基因斑马鱼胚胎，于受精2小时内(2hpf)根据剂量设计进行环境污染物处理，于恒温光照培养箱中(28℃，光照/黑暗：14/10h)培养至72hpf。每隔24小时换水染毒，从24hpf额外加添加50xptu(n-苯基硫脲)，以200ul/10ml的比例与鱼水混合，抑制斑马鱼色素生成。

2.制备琼脂糖包被的96孔玻底板：

使用8通道移液枪将65μl2.5％热琼脂糖填充到96孔玻底孔板中，立即插入配套的96孔板斑马鱼幼鱼定位梳子(3d打印定制)，等待琼脂糖凝固(4℃，5分钟以上，室温10分钟以上)，小心地取下定位梳子。

3.成像前处理：

3.1)去卵膜：使用弯曲注射针在体视镜下对所有斑马鱼胚胎进行去卵膜处理；

3.2)麻醉：使用0.03％三卡因(10ul/200ul鱼水)；

3.3)固定与定向：使用剪去尖端的中枪头将去膜麻醉的胚胎与100-150μl鱼水转移到琼脂糖包被的96孔板中(1条/孔)。于体视显微镜下使用弯曲注射针将胚胎定位在琼脂糖中腔(统一腹侧朝左)。

4.图像数据采集

4.1)上机：运行高内涵成像系统，载入装有环境污染物处理的斑马鱼胚胎/幼鱼的96孔板；

4.2)设置预扫图像分析程序：识别488nm通道区域面积大于或等于100000像素并且荧光强度高于400，保存命名为“findingfish”；

4.3)设置成像程序参数：

①选择5x物镜非共聚焦模式，488nm通道(参数设置：曝光时20ms；激光功率50％；拍摄高度500um)，选中所有孔以及镜头，分析程序设置为“findingfish”，保存好程序命名为“pre”；

②选择10x物镜共聚焦模式，488nm(参数设置：曝光时间300ms；激光功率100％)以及明场(参数设置：曝光时间20ms；激光功率50％；拍摄高度500um)双通道，层扫模式(参数：起始处为300um，20um/层，20层)，选中所有孔以及镜头，保存好程序命名为“re”；

4.4)成像与图像保存：使用预扫模式，分别载入“pre”以及“re”两个程序，命名实验名称，运行程序进行高内涵全自动成像，选择荧光增强模式，以bmp格式保存斑马鱼胚胎或幼鱼血管荧光图像并按编号命名。

二、血管图像分割识别与分析

使用adobephotoshopcs5软件批量打开血管荧光图像，选择套索工具分别简单截取包含肠下静脉丛和尾静脉末端的图像区域，选择反向以删除其他区域，保留目标血管区域并用以黑色背景填充图片后关闭文件。利用宏录制截取目标血管区域之后的步骤，运行宏，实现半自动图像分割。

matlab软件平台编写目标血管图像识别分割以及形态学(包括面积、周长、数、圆度、外接最小矩形长宽)等参数输出算法，批量导入上述处理的图像，运行相应算法输出相应参数并导出至excel表中。将数据集导入至使用graphpadprism5软件中，分析并绘制统计图。

相应算法代码如下：

1.肠下静脉丛

2.尾静脉末端

三、获得评价和筛选结果

使用graphpadprism5软件，分析数据集并绘制统计图，运用方差分析，比较不同剂量芳基磷酸酯类阻燃剂处理的多血管参数指标，描述芳基磷酸酯类阻燃剂血管发育毒性效应特征；分析各指标的剂量-反应/效应关系，比较不同血管发育毒性指标对环境污染物暴露的敏感性，对芳基磷酸酯类阻燃剂的血管发育毒性进行评价和筛选。

本发明运用高内涵自动化成像采集转基因斑马鱼血管荧光图像，结合机器学习的方法通过算法对目标图形进行半自动识别以及参数获取，分析心血管多参数变化实现对芳基磷酸酯类阻燃剂心血管毒性评价和筛选。利用高内涵成像系统对暴露于化学物的转基因荧光斑马鱼进行高通量心血管图像采集，结合photoshop、matlab等软件对图像进行半自动识别分析，具有高通量的特征，能够快速对多种化合物，多参数指标地进行心血管毒性评价。

相比较，传统的利用激光共聚焦显微镜需逐一进行图像获取并手动描出目标血管以获取少量参数。本发明的评价和筛选方法通过高内涵成像系统自动化成像的；可以在单一实验中对大量斑马鱼进行同步获取高可靠性的图像数据。能够在短时间内对大量环境污染物进行多参数的血管毒性评价与筛选，同时去除人为误差的对图像获取的干扰。

此外，此方法还适用于评价其他具有血管潜在风险的各类环境污染物，开展早期风险评估和健康预警，为环保新型化学品的开发提供参考依据。

本发明实验所用试剂与仪器、软件如下：

1、实验对象与试剂：

tg(kdrl:egfp)转基因斑马鱼胚胎(中山大学中山医学院斑马鱼医学转化中心)；芳基磷酸酯类阻燃剂：磷酸三苯酯(tphp)等(tci公司)；二甲基亚砜(sigma公司)；50xptu(n-苯基硫脲)(sigma公司)；琼脂糖(sigma公司)；0.03％三卡因(sigma公司)。

2、仪器与软件：

恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；perkinelmeroperettacls高内涵成像分析系统(铂金埃尔默公司)；96孔玻底板(上海晶安生物科技有限公司)；96孔板斑马鱼幼鱼定位梳子(见图2)；adobephotoshopcs5软件；matlab软件；graphpadprism5软件。

现结合附图与具体较佳实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。

实施例1

芳基磷酸酯类阻燃剂--磷酸三苯酯(triphenylphosphate，tphp)血管毒性评价(流程如图1)：

一、获取磷酸三苯酯处理的斑马鱼胚胎/幼鱼血管荧光图像

1.转基因斑马鱼胚胎的化学处理与培养：

准备21个事先洗净灭菌的60mm玻璃皿，随机放置25枚tg(kdrl：egfp)转基因斑马鱼胚胎于玻璃皿中，每个剂量组设置3个平行皿，每个皿中装有10ml鱼水。

于受精2小时内(2hpf)按0，30，100，300，600，1200，2400ug/l7个剂量使用tphp对斑马鱼胚胎进行染毒处理。

于恒温光照培养箱中按28℃，光照/黑暗：14/10h循环培养至72hpf。每隔24小时换水染毒，从24hpf开始每皿额外加添加200ul50xptu(n-苯基硫脲)，以抑制斑马鱼色素生成。

2.制备琼脂糖包被的96孔玻底板：

斑马鱼幼鱼定位梳子(3d打印定制)，具体模型设计，如图2。

配置好2.5％的琼脂糖，加热融化，使用8通道移液枪将65μl琼脂糖填充到96玻底孔板中，立即插入配套的96孔板斑马鱼幼鱼定位梳子(3d打印定制)，等待琼脂糖凝固(4℃5分钟以上，室温10分钟以上)。小心地取下定位梳子。

3.成像前处理：

3.1)去卵膜：使用弯曲注射针在体视镜下对所有斑马鱼胚胎进行去卵膜处理；

3.2)麻醉：使用0.03％三卡因(10ul/200ul鱼水)；

3.3)固定与定向：使用剪去尖端的中枪头将去膜麻醉的胚胎与100-150μl鱼水转移到琼脂糖包被的96孔板中(1条/孔)。于体视显微镜下使用弯曲注射针将胚胎定位在琼脂糖中腔(统一腹侧朝左)。琼脂糖包被的96孔玻底板胚胎/幼鱼排列设计如图3所示。

4.图像数据采集：

4.1)上机：运行高内涵成像系统，载入装有芳基磷酸酯类阻燃剂处理的斑马鱼胚胎/幼鱼的96孔板；

4.2)设置预扫图像分析程序：识别488nm通道区域面积大于或等于100000像素并且荧光强度高于400，保存命名为“finding_fish”；

4.3)设置成像程序参数：

①点击“new”新建程序，选择5x物镜非共聚焦模式，488nm通道(参数设置：曝光时20ms；激光功率50％；拍摄高度500um)，选中所有孔以及镜头，分析程序设置为“findingfish”，保存好程序命名为“pre”；

②点击“new”新建程序，选择10x物镜共聚焦模式，488nm(参数设置：曝光时间300ms；激光功率100％)以及明场(参数设置：曝光时间20ms；激光功率50％；拍摄高度500um)双通道，层扫模式(参数:起始处为300um，20um/层，20层)，选中所有孔以及镜头，保存好程序命名为“re”；

3.4)成像与图像保存：使用预扫模式，分别载入“pre”以及“re”两个程序，命名实验名称为“tphpzebrafish72hpf”，点击“start”开始拍摄。勾选比例尺，选择荧光增强模式,分别收集斑马鱼胚胎或幼鱼血管荧光图以及明场图并按编号命名。

二、血管图像分割识别与分析

使用adobephotoshopcs5软件批量打开由不同剂量tphp处理的斑马鱼胚胎/幼鱼血管荧光图像，选择套索工具分别简单截取包含肠下静脉丛和尾静脉末端的图像区域，选择反向以删除其他区域，保留目标血管区域并用以黑色背景填充图片后关闭文件。利用宏录制上述截取目标血管区域之后的步骤，运行宏，实现半自动图像分割。

matlab软件平台加载肠下静脉丛和尾静脉末端图像识别分割以及形态学(包括面积、周长、血管网格数、圆度、外接最小矩形长宽)等参数输出算法，点击选择批量导入上述处理的图像，运行相应算法输出相应参数数据，全部选中导出至txt工作簿中，在excel文档中载入数据。

使用adobephotoshopcs5软件套索工具截取区域，如图4所示；使用matlab软件运行肠下静脉丛血管图像识别分割算法效果图，如图5所示。

三、获得评价和筛选结果。

使用graphpadprism5软件，分别新建肠下静脉丛和尾静脉末端的面积、血管网格面积、血管周长、血管网格数、圆度、外接最小矩形长/宽等参数的“columnbargraph，vertical”类型的数据集及统计图，填入对应数据生成柱状统计图，点击analyze，选择one-wayanova中的dunnett法将剂量组与对照组进行两两比较，α＝0.05，分别得出p值并在统计图中用星号标识(与对照组比较，*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001)。

如图6a-6d所示，在这项研究中，显示tphp暴露导致72hpf时斑马鱼sivs血管面积、sivs血管网格及其面积和cv末端面积呈剂量依赖性降低。暴露于300ug/ltphp的斑马鱼的sivs血管面积相较于对照组减少具有统计学差异；cv末端的生长也在暴露于600ug/ltphp开始出现显著差异。

对sivs和cv末端血管区域的影响表明：在发育过程中，tphp暴露会阻碍sivs和cv末端的生长；tphp暴露对不同类型血管的影响存在差异。这些结果表明较低剂量tphp暴露对早期血管发育的不利影响，证明了tphp在体内的血管发育毒性。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。