用于通过质谱仪进行亚微米元素图像分析的设备和方法与流程

本发明是在政府支持下在由美国国立卫生研究院授予的合同号CA034233、AI057229、CA130826、EY018228、CA118681、HHSN272200700038C和1K99GM104148-01下进行。政府享有本发明的某些权利。

背景技术：

可通过以下方式对平面样本进行分析：使用激光来烧蚀样本，并且随后使用ICP-MS(感应耦合等离子体质谱仪)来对经烧蚀产物进行表征。可对与样本相关联的元素的种类和量进行存储和分析。这些激光烧蚀方法的价值出于多种原因而受到限制，例如：1)当使用激光进行取样时，对经烧蚀区段的大小存在物理限制(由波长指示)，2)烧蚀通常是破坏性的，使样本的整个厚度蒸发，从而阻止再分析，以及3)在大气压下对报告元素进行烧蚀和电离已降低了将弱离子引入质谱仪的真空中的灵敏度。

技术实现要素：

本公开提供可用于(除了其他目的)利用原离子束从真空中的生物基质中进行亚微米取样和电离并且操作质谱仪来测量和量化每个取样区段的元素同位素组分的系统、方法、装置和计算机编程。所描述系统和方法可操作质量分析仪，所述质量分析仪基于质量和/或质荷比来提供带电粒子流内的带电粒子的暂时分离。所分析基质包括例如包含元素信息或元素编码的二维标准的生物组织切片或细胞。然而，本发明与使用用于基于真空的取样和电离的原离子束以及用于元素质量分析和量化的脉冲二次离子光学器件的任何种类的二维基底的分析有关。

例如，一些实施方案提供用于操作检测系统来通过飞行时间(TOF)质谱仪(MS)对独立的样本区段进行质谱分析的方法和装置。具体地说，本公开提供用于在从连续分析的二维样本区段连续引入元素离子时执行多次TOF-MS扫描，同时记录生成质量信息的样本区段的对应的质量信息的方法。为了适于期望应用，可在一个或多个质谱取样周期中对数据进行取样。二维分析物基质的亚微米区段是使用原离子束或带电粒子束的它们的元素离子的样本。将束应用到分析物的特定区段引起其中的元素组分发生二次电离。

在每个单一TOF-MS光谱中进行取样的时间窗口可对应于特定染色元素同位素的离子存在于正表征的样本基质中的时间窗口，这可在TOF-MS检测器处产生信号。同时，检测落入其他时间窗口中的其他染色或内源元素报告物可在同一单一质谱下实现。组织的“染色”可通过与本文公开的过程和目标一致的任何方法来实现，包括例如(2014年3月26日提交的美国临时申请序列号61/970,803、2013年9月13日提交的美国临时申请序列号61/877,733以及Angelo等人于2014年3月2日在线发表在自然医学杂志(Nature Medicine)上的文章，其全部以引用的方式并入本文)。所述系列的单一TOF-MS光谱可与每个区段上的连续原离子束的驻留时间同步，其中将整合给定区段的所有光谱。对应于每个区段的光谱的整合时间和数量将是动态的并且取决于所期望的应用。

在一些实施方案中，指示元素报告物存在于质谱仪的主要离子检测器中的分析样本区段中的信号提供质量解析数据。在这种情况下，所述系统可包括一个或多个辅助检测器，并且可通过由离子源产生的离子、光子或电子或者通过在未电离状态下经过离子源依然保留的的中性粒子组分来诱发此信号。

在一些实施方案中，在每个单一质谱中进行取样的时间窗口包含感兴趣离子(包括染色元素的离子)的所有质荷比通道。针对每个单一质谱传送和处理来自时间窗口的所有数据，其中执行处理，所述处理包括针对每个质荷比进行离子计数，或者计算对应于特定质荷比的预先选择的时间窗口内所有信号的总和。针对每个单一质谱，所得数据包含针对每个质荷比的信号强度的多个单一整数值。对于所分析样本的给定区段来说，来自每个单一质谱的连续的完整信息进一步基于对应于所述区段上的离子源的驻留时间的单一MS扫描的次数来进行组合。

在另一个实施方案中，在每个单一质谱中进行取样的时间窗口包含感兴趣离子(包括染色元素的离子)的所有预期的到达时间(即，所有感兴趣的质荷比通道)。然而，仅仅传送来自主要质荷比通道的数据(其可称为样本中预期的主要检测组)以便进行进一步处理。因此，一直处理的数据的量可保持较低。

一些实施方案提供用于单独样本区段的元素分析的质谱仪，所述质谱仪包括：用于将分析物的平面切片引入质谱仪的真空中的装置；和电离源，具有亚微米横截面的独立区段的离子可从所述电离源传送到质谱仪；质量分析仪，所述质量分析仪用于根据离子的质荷比来将离子分离；离子检测器，所述离子检测器用于检测质荷分离的离子；数字化系统，所述数字化系统用于使离子检测器的输出数字化；用于传输、处理和记录数据的装置；用于将来自质谱仪的信息与样本的给定区段相关联的装置；以及用于使电离系统、离子检测器、数字化系统或者数据的传输、处理和记录中的至少一个同步以使得质量信息可与所分析样本的每个区段相关联的装置。

本教导的这些和其他特征在本文中阐明。

附图说明

熟练技术人员将理解，以下所述附图仅出于说明目的。这些附图并非想要以任何方式来限制本教导的范围。

图1从测量来自通过原离子源照射的平面样本的二次离子示出根据以下更详细描述的本发明的飞行时间质谱仪设备的示例性实施方案的示意图。

图2表示用于来自平面样本的顺序分析区段的原子质量编码的图像的重建的数据数字化和同步化的示意图。

图3表示根据所描述发明的照射在平面样本的表面上的原离子束的入射和所期望的横截面分辨率的描述的示意图。

图4示出了所描述方法和设备的实施方案的工作流程示意图。

定义

在更详细地描述示例性实施方案之前，阐述以下定义以说明和限定描述中所用术语的含义和范围。

如本文所用，术语“平面样本”用于指代基本上平面的(即平坦的)生物样本。这类样本的实例包括组织切片(例如，使用切片机进行切片)、通过将分离细胞沉积到平面表面上而制成的样本以及通过在平面表面上生长细胞片(例如，单层细胞)而制成的样本。

如本文所用，术语“染色元素”是指存在于可由所公开设备和方法分析的粒子或生物细胞中的任何原子元素或同位素。所述元素可天然存在于样本中或者可为故意添加到平面基质中的元素。例如，一些细胞可富含Zn或Fe。可替代地，染色元素可通过与本文的公开一致的任何方法特定地添加(或标记)到样本中，所述方法包括但不限于使用金属嵌入剂(metalointercalator)来标记DNA或者渗透到细胞中或者添加元素标记的抗体。

如本文所用，术语“质量标记的”是指利用可通过其独特的质量或质量分布识别的单一种类的稳定同位素或者所述稳定同位素的组合来标记的分子，其中稳定同位素的组合提供标识符。稳定同位素的组合允许通道压缩和/或条形编码。可通过它们的质量识别的元素的实例包括贵重金属和镧系元素，尽管可采用其他元素。元素可作为一个或多个同位素存在，并且此术语还包括带正电荷金属和带负电荷金属的同位素。术语“质量标记的”和“元素标记的”在本文可交换使用。

如本文所用，术语“质量标记”意味着任何元素的任何同位素，所述任何元素包括过渡金属、后过渡金属、卤化物、贵重金属或镧系元素，所述同位素可通过其质量来识别，可与其他质量标记区分，并且用于标记生物活性材料或分析物。质量标记具有原子质量，所述原子质量可与分析样本中和感兴趣的粒子中所存在的原子质量进行区分。术语“单一同位素的”意味着标记包含单一类型的金属同位素(尽管任何一个标记可包含相同类型的多个金属原子)。在一些实施方案中，质量标记可具有在12-238个原子质量单位(例如21至238个原子质量单位)范围内的质量，包括C、O、N和F加合物。在一些实施方案中，质量标记可为具有在21-90的范围内的原子序数的元素的原子，例如具有21-29、39-47、57-79或89的原子序数的元素的原子。在一些情况下，元素是镧系元素。在具体实施方案中，可使用特异性结合试剂(例如，包含用作质量标记的螯合原子的抗体)进行标记，用于制造所述特异性结合试剂的方法是已知的。

如本文所用，术语“质谱”包括数据，所述数据包括原始数据(例如，波形)或与所述波形相关联的已处理数据，所述数据例如在将单离子束调制事件应用在质谱仪(诸如以下描述的示例性飞行时间设备)中之后在单个取样周期中进行收集。例如，加速区中的离子群通过适当布置的电脉冲而推动到飞行管中。这也可称为单个取样周期质谱。飞行时间周期是连续单一离子束调制事件之间的时期。质谱测量结果可包含是所使用染色元素的部分的质量标记的种类和丰度。

如本文所用，术语“离子检测器”是指能够收集一个或多个质谱、或者能够收集由染色元素诱发的信号的任何或全部装置。

如本文所用，术语“数据产生率”是指产生单一质谱的数字化表示的速率。例如，如果表示单一质谱的波形具有10微秒的持续时间，并且其特征需要以时间的10^-2％和信号强度的0.4％的准确度来对波形进行取样，那么所述波形应每1纳秒并且以250信号强度水平进行取样，从而在10微秒内产生大约10000×8位＝10千字节(kB)的数据，或者每秒1干兆字节(GB)的数据产生率。数据传输率是单一波形的数字化表示可传送到存储器存储装置以用于进一步处理(包括例如，压缩或记录)的速率。光谱产生频率是产生连续单一质谱的频率。

如本文所用，术语“样本区段”或“区域”是平面样本的适于由质谱仪进行质量分析的任何离散位置。例如，样本的0.1um×0.1um切片通过离子束电离以用于元素质量分析。一旦将元素报告物的组分数字化，其就可显示为单独图像像素的颜色。

如本文所用，术语“正交的”意欲是指大约90度的方向。确切地，在“正交的”飞行时间质谱仪中，离子在进入飞行管中时相对于它们先前的飞行路径改变方向约90度。在某些情况下，可例如使用离子切片机将离子束的形状设定成带状，并且使用例如脉冲发生器迫使离子群改变方向进入飞行时间管中。

如本文所用，术语“连续照射”意欲是指基本上“接通”并且在没有任何中断的情况下照射样本的原离子源。如以下将论述的，原离子源可连续照射样本，同时束本身被(例如，通过移动样本，通过移动离子源、或者使用离子光学器件，即电极)跨样本导引。如果束具有至少10％的占空比，那么其基本上是“接通”的。

除非另外规定，如本文所用的术语“移动”是相对术语。在跨样本“移动”离子束中，束源可相对于所述样本移动，所述样本可相对于所述束源移动，或者所述束的方向可由离子光学器件操控。

如本文所用，术语“跨平面样本进行二维扫描”意欲意味着束跨样本的区域在一系列基本平行的直线上来回移动。“光栅扫描”是这类扫描中的一种。直线之间的间距可随着束行进的速度而改变。

如本文所用，术语“在平面样本的平面中”意欲是指平面样本的x-y平面，其中z高于或低于平面样本。

如本文所用，术语“扫描计时”意欲是绝对(例如，一天中的时间)或绝对(例如，当一次扫描相对于另一次扫描完成时)计时指示。在一些实施方案中，例如如果高分辨率扫描在较低分辨率扫描之后发生，那么可通过将扫描与扫描的分辨率相关联来指示扫描计时。

如本文所用，术语“平面样本上的位置”可以任何合适的方式来描述，例如，使用x-y坐标或者通过时间来描述，其中所述时间可用于确定平面样本的位置的x-y坐标。

在任何实施方案中，可将数据转发到“远程位置”，其中“远程位置”意味着除了执行程序的位置之外的位置。例如，远程位置可为同一城市中的另一个位置(例如，办公室、实验室等)、不同城市中的另一个位置、不同州中的另一个位置、不同国家中的另一个位置等。因此，当一个物品指示为“远离”另一个物品时，这意味着两个物品可位于同一房间中但彼此分开，或者至少位于不同房间或不同建筑物中，并且可至少分开一米、十米、或至少一百米。“传达”信息涉及通过合适的通信信道(例如，专用或公用网络)将表示所述信息的数据作为电信号进行传输。“转发”物品是指使所述物品从一个位置到下一个位置(不管是否通过物理输送所述物品或者以其他方式(其中所述其他方式是可能的))的任何方式，并且至少在数据的情况下包括物理输送承载数据或传达数据的介质。通信介质的实例包括无线电或红外传输通道，以及到另一个计算机或联网装置以及互联网的网络连接，或者包括记录在网站等上的电子邮件传输和信息。

如本文所用，术语“接收”用于是指通常以人类可读的形式(例如，以图或文本文件的形式)将信息从计算机系统的存储器递送到用户。此术语意欲涵盖将图像递送到计算机监视器的屏幕，以及通过电子装置将文件(例如，通过电子邮件等)递送到用户。

具体实施方式

通过本发明原理的具体实施方案的实例的说明来提供以下描述和本文描述的实施方案。出于解释而不是限制这些原理和本发明的目的来提供这些实例。

本文使用的节段标题仅是出于组织目的，而不应理解为以任何方式限制所描述主题。虽然本教导内容结合各种实施方案来描述，但是不意图将本教导内容限于这类实施方案。相反，本教导内容涵盖如本领域技术人员将了解的各种替代、变化和等效物。

当提供数值范围时，应理解，除非上下文另外明确规定，在那个范围的上限与下限之间的直至下限的十分之一单位的各间插值(intervening value)以及在所述陈述的范围内的任何其他陈述值或间插值都涵盖在本公开内。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管在实践或测试本教导内容中还可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述一些示例性方法和材料。

引用任何公布都是因为它的公开内容在提交日期之前，而不应理解为认可本发明权利要求由于先前发明而无权先于所述公布。此外，提供的公布日期可不同于可需要独立确认的实际公布日期。

必须指出，除非上下文另外明确地规定，否则本文和附加的权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。应进一步指出，权利要求书可经拟订以排除任何任选的要素。因此，此表述旨在作为在列举权利要求要素时使用诸如“单独地”、“仅/只”等的独占性术语或使用“否定”限制的先行基础。

本领域技术人员在阅读本公开时将明白的是，本文所描述且说明的各个个别实施方案具有离散组分和特征，这些组分和特征可容易地与任何其他若干实施方案的特征分离或组合而不偏离本教导内容的范围或精神。任何叙述的方法都可以叙述的事件的顺序或以在逻辑上可能的任何其他顺序执行。

这类实施方案的描述可通过使用图1示意性示出的飞行时间质谱仪的实例来提供。图1示出适用于实现本发明的各个方面的基于质谱仪的二次离子成像装置的示意图的实例。样本10通过室入口门30引入样本接口真空室20中，所述样本10可例如包括安放在基底上的切片机组织学组织切片，所述基底例如半导体晶片或导电载玻片。为了减少其上安放有样本的基底中所存在的元素污染所产生的信号背景，此基底的一个实施方案将耗尽元素组分和或可与感兴趣报告物金属同位素重叠的它们的相应氧化物。另外的接口室入口门40封闭装置的剩余部分(其维持在真空下)，同时加载平面样本10。原离子源50(例如Cs液态金属离子枪或氧气双等离子管)聚焦在试样处，以便通过离子研磨、材料沉积来修饰表面，或者出于对表面进行成像的目的。

一旦样本10已加载到接口室20中并且入口门30关闭，接口泵80就在室入口门40打开并暴露出由一组单独的泵90(例如，涡轮分子泵)保持在真空下的装置的剩余部分之前恢复样本接口单元20中的真空。离子源50充当原离子照射单元，所述原离子照射单元利用原离子(如原离子束110)照射样本10的表面100。固持单元60固持样本10。希望固持单元60具有以亚微米精度调整样本10的X和Y坐标的能力，因此样本中的不同位置的区段可定位在原离子束110的路径中以用于成像。势梯度发生器70设置在固持单元60中。施加到原离子源50的偏转控制器和放大器的信号致使聚焦的离子束在有待根据由图形发生器和聚焦离子光学器件120控制的图形而成像或研磨的目标区域内移动。来自每个取样点的射线可最初由带电粒子倍增器155收集，以便形成在视频监视器上显示的图像。观察所述图像的操作者可调整施加到原离子源和离子柱50中的各个光学元件的电压，以使束聚焦并且针对各个像差120调整所述束。柱中的聚焦光学器件120可包括本领域已知用于聚焦的机构或者将来待开发的方法。例如，两个圆柱形对称静电透镜可实现来产生圆形虚像源的缩小图像。由于提取的束中的低轴向能量散布，有色污点最小，并且束的有效聚焦甚至可在低加速电压(即，低的束能量)下实现。结合适当聚焦光学器件的这些特性可用于利用一系列动力学能量(0.1keV-50keV)以及从数微微安培至若干微安培的束电流来生成纳米至微米规模的束斑大小。

从样本100的表面处的区段产生的二次离子130由与样本10对置的提取器电极140吸引并聚焦。提取器电极140设置成使得与样本100的表面对置，并且具有收集从样本10发射的二次离子的功能。提取器电极140设置在样本10与装置的离子传输段150的入口之间，以使得可引导收集的二次离子进行质量分析和检测。

如图1和图3所示，从原离子源50发射的原离子在入射轴线A方向上以从0度(也就是说，平行于样本10的表面)至90度范围内的角度Φ入射到样本表面100上。当原离子倾斜地入射在样本表面100上时，可避免在入射轴线A方向上的原离子与提取器电极140之间的碰撞。图3举例说明原离子束110在样本表面100处的入射和性质。结合聚焦离子光学器件/电极的原离子源50的孔将确保具有入射角Φ的束110将能够维持一微米或更小(例如，小到10nm)的横截面。

为了确保在没有多原子加合物的情况下的最有效的元素电离并且为了最小化捕获时间，在所期望的实施方案中，原离子束可为高能量离子的连续束。如本文所用，连续离子束可包括具有占空比的离子束，所述占空比如通过束接通的时间除以束接通和关闭的时间的总和来定义，例如，至少10％、至少40％、至少70％、以及高达100％，尽管可在某些情况下使用具有至少1％的占空比的束。如例如在Applied Surface Science,255(4):1606–1609、专利US8,168,957、US8,087,379、US8,076,650、US7,670,455和US7,241,361(它们以引用的方式并入本文)中描述的使用任何惰性气体或反应性气体(诸如O₂、N₂和SF₆)的原离子源可在此实施方案中使用。因此，合适的原离子束可包括氧、氙、氩(包括氩团簇)、金(包括金团簇)、铋镓、SF₆和C₆₀离子束。在此具体实施方案中，原离子源由感应耦合到补偿RF天线的等离子体组成，所述补偿RF天线可结合聚焦光学器件使用以产生高亮度、聚焦的离子束，以便进行SIMS成像分析。根据本发明的方面，RF天线可实现为围绕等离子体管的螺旋线圈。RF电流源应用到天线，以诱导管中的等离子体气体的电离。提供阻抗匹配电路来允许利用跨天线的适当相位移动实现到等离子体的有效电力传输，以便消除等离子体电势调制。电离的等离子体被提取到离子束中并且通过离子光学器件聚焦。这样形成的离子束基本上不含由RF天线产生的不期望的能量振荡。因为RF源仅向等离子体电势施加少量(或者理想地不施加)振荡，所以随之由其产生的束的轴向能量散布是小的。因此，电离源不会引起实质性的色差。此外，RF源向等离子体施加高离子密度。

当与聚焦机构耦合时，此高密度束可提供从数微微安培的束电流到大于10^-11、大于10^-10安培、大于10^-9安培、大于10^-8安培、大于10^-7的电流，或者若干微安培的电流。可在50keV下实现至少10⁴A/cm²/sr、至少10⁵A/cm²/sr、以及高达10⁶A/cm²/sr或更大的源亮度。轴向能量分布小于3eV、小于2.5并且可低到1.5eV。离子束能够聚焦成数纳米、高达数十微米的束直径。

如上所述的连续的高亮度原离子源将用于产生连续发射的二次离子，所述连续发射的二次离子将通过离子传输段150聚焦和传送。随后将在正由脉冲二次离子光学器件和飞行时间质谱仪分析的可能的感兴趣质量的整个范围内对此连续的二次离子电流进行取样。在本发明的另一个实施方案中，为了将质量原子群直接释放到TOF质量分析仪中，也可使能够产生元素二次离子的高亮度原离子束脉动(溅射)。

使二次离子130朝向提取器电极140加速的电场可通过向提取器电极140施加电势Vex来生成，所述电势Vex相对于样本10的电势是适当的。与此电场不存在的情况相比，这是有利的，因为提高了收集二次离子的效率。

从样本10发射的二次离子由提取器电极140收集，并且在这之后由于提取器电极140与二次离子传输段150之间的电势而加速直到预定能量，以便有效地传送离子来进行质量分析。

将来自样本的二次离子通过差动泵送接口160引入离子传输段150中，所述离子传输段150可包括离子偏转器170、孔180、RF离子导向器190，所述离子导向器190连接到生成必要的RF和/或dc电压200的装置。离子偏转器170可使至少一部分离子朝向离子导向器190偏转，这可通过一组离子光学器件210将至少一些离子传送到正交加速器220中，所述正交加速器220可包括推出板230、栅格240-242和一组环250。在正常操作中，电压从适当的电压源(未示出)施加到包括离子传输段150的元件上，其方式为使得感兴趣的很大一部分离子传输到正交加速器220中。

在每个飞行时间周期开始时，短的推出电压脉冲可施加到推出板230，并且推出电压脉冲可同时施加到栅格240；两个推出电压脉冲都可由脉冲电子器件260供应。这类脉冲可引起板230与第一栅格240之间存在的离子向侧面行进通过加速器220，朝向右手边栅格242，从而在侧向方向上产生短的离子群，所述短的离子群主要由在施加脉冲时处于板220与栅格240之间的离子组成。离子随后可行进通过无场空间270朝向离子反射器295，所述离子反射器295可包括栅格290和300以及环305。至少一些离子可往回反射并且随后在无场空间270中行进通过栅格310而进入离子检测器320中，所述离子在所述离子检测器320中产生电子脉冲，所述电子脉冲可由放大器330放大，从而产生对应于单一光谱的离子信号波形。

离子到达检测器的时间取决于它们的质荷比m/z。具有最大m/z的离子最迟到达检测器。在足以用于最迟的感兴趣离子到达检测器的时间间隔之后，可通过向板230和栅格241施加另一组脉冲来再次开始所述周期，所述周期在适于允许由离子传输段150最新递送的至少一些离子在板230与栅格241之间行进的电压下保持在脉冲之间。在若干连续飞行时间周期上获得的这类若干连续的离子信号波形示出为280。本领域已知的飞行时间仪器对连续单一光谱进行完整取样，例如通过完整的离子信号波形的模拟-数字转换，并且传送描述这类波形的数字化数据。在一些实施方案中，仪器可包括可主要在对应于来自给定区段的染色元素的到达时间的相对短的时间窗口中对每个离子信号波形进行取样的装置290。

对于诸如实例中示出的仪器来说，¹⁰²Pd给定为示例性染色元素同位素；然而，可使用固有存在的或人为并入样本10中的任何其他元素。装置290主要在对应于¹⁰²Pd⁺的到达时间的时间窗口11中对单一离子光谱进行取样。在时间窗口11中的信号强度超过预定检测器信号阈值300从而克服背景信号之后，装置290可开始另外在至少又一个时间窗口12中对单一离子光谱进行取样。

在装置290接收并记录TOF-MS检测器信号并且使其与脉冲电子器件260的计时协调以便产生TOF质量信息和量化的情况下，同步器1080与装置290、原离子源50和样本接口协调以便使TOF扫描310与目前正由原离子束110烧蚀的样本区段320适当地协调，以便重建质量区段信息340的二维图像330。在本文的实例中，图2，针对TOF MS扫描231、232、233的来自检测器信号280的完整质量信息11、12将针对样本区段321的每个质量通道整合成单个值。将记录区段321的位置信息及其对应的质量信息。同时，将整合TOF MS扫描314、315、316以形成区段322的质量信息。在此实例中，原离子源在样本的单一区段上的照射时间将大约等于三次顺序TOF MS扫描。这个计时、位置信息和整合的质量值的数字化的协调将由与同步器1080协调的装置290来执行。

在另一种操作模式中，仪器利用一个长的取样窗口或者利用多个取样窗口进行操作，所述取样窗口对应于或覆盖所有感兴趣的质荷比的离子311-316的到达时间。然而，仅传送来自较短时间窗口11-12(其对应于质荷比通道的主要检测群)的数据，以便进行进一步处理。如果此数据对应于照射样本的表面100的特定区段320、330的原离子束110，那么将传送来自所有取样窗口的数据以便进行处理，并且通过所述装置以及质量和位置信息1090的同步器来促进图像重建340。这种模式的优点在于可降低平均数据传送率。

在另一种操作模式中，传送如先前段落中描述的所有获得的数据；然而，仅仅来自主要质荷比通道的数据用于进行处理。在此，可针对样本的每个区段(其中注释其二维位置)整合并记录在主要质荷比通道中的数据的处理290和同步1090。这将产生针对每个区段的每个质量通道的单一整合值。因此，可降低数据存储装置上的平均负载。

图4中示出方法的一个实施方案的流程图。将有待由设备1000进行质量成像的平面基质的样本区段置于分析室中。通过原离子照射单元1010对与样本区段相关联的材料进行蒸发、雾化和电离，并且产生与所述样本区段相关联的二次离子。通过离子质荷比分析器1020来根据离子的质荷比将离子分离，并且主要离子检测器1030检测所分离的离子。在原离子束1010驻留在平面样本的单一区段上的期间，并且图像重建正整合所述区段1090的所有质量测量信号。在每个驻留时间过程中，通过数据记录器1070存储由主要离子检测器1030收集、由数字转换器1040数字化、由数字化数据传送通道1050传送、由数据处理器1060处理的数据。基于原离子源驻留时间，可针对每个质量通道同步和整合针对每个区段测量的所有离子信息，通过同步单元1080使所述所有离子信息协调，因此可重建1090平面样本的每个区段的质量分布。因此，同步器1090可用于使质谱仪的一个或多个其他部件与由原离子束电离的单一区段中所存在的质量信息同步。

现参考特定类型的实施方案，下文描述在飞行时间(TOF)质谱仪中处理的离子信号和数据的检测，并且具体地是用于收集和存储飞行时间质谱仪数据以便分析单独粒子的检测系统和设备的操作方法。

飞行时间质谱仪(TOF MS)根据测量离子在固定距离内行进的时间的原理来进行操作，所述时间通常与离子的质荷比的平方根成比例并且因此是所检测离子的质量测量。到达离子检测器的离子产生检测器输出信号，所述检测器输出信号通常由各自表示具有特定质荷比(m/z)的一个或多个离子的一系列峰值组成。通常，质谱中每个峰值的持续时间小于100纳秒，并且表示所有质量(通常称为单一质谱)的离子的检测器输出信号的总持续时间大约为100微秒。通常按以下两种不同方式中的一种来数字化这类检测器输出信号：时间-数字转换或瞬态记录。在时间-数字转换器(TDC)中，当在每个到达时间窗口内检测到离子到达事件时，与此窗口相关联的计数器增加。在特定时间段(称为TDC的“停滞时间”，通常为5-20ns)内到达检测器的所有离子事件可仅作为一个事件来计数。因此，TDC技术(其为离子计数技术)已受测量时间动态范围所限制，并且通常不适于快速变化离子束的高动态范围表征。

快速变化离子束的一个实例在电离样本区段时发生，并且产生在组分和/或离子密度上快速变化的离子云。TOF MS是在具有质谱仪检测器的成像仪器中分析离子云的优选方法的实例，所述质谱仪检测器测量平面生物样本、特别是针对附着到与它们的特异性抗原缀合的抗体或其他亲和性试剂的元素的元素组成，如(Angelo等人于2014年发表在Nature Medicine上的文章)中所描述的。具体化的原离子束驻留时间以及由这种取样事件产生的二次离子云的持续时间是10-10000微秒。希望能够针对具有至少4个数量级的动态范围的多个m/z的离子来分析此短离子云。

检测器输出信号的另一种数字化方式是使用瞬态记录器，将信号中表示单一TOF质谱(单瞬态)的所有信息捕获并存储在所述瞬态记录器中。例如，瞬态记录器基于模拟-数字转换器(ADC)在商用数字存储示波器中遇到。

在一些情况下，可希望在可持续例如10-1000微秒的瞬态周期过程中提供关于粒子产生的离子云的元素组成的变化的信息。在这类情况下，可希望在这种相对短的周期过程中收集和存储多个质谱。单一质谱的持续时间可希望地是大约10-20微秒，从而允许针对单一样本区段收集1-1000个光谱。具有大约20微秒的单一质谱持续时间的元素TOF中的单一质量窗口的典型宽度是10-25纳秒。1GHz或更好的取样率因此可适合表征离子峰形。这种高取样率和10⁴的动态范围要求产生远超1GB/s的数据生成率。所述数据生成率比可利用本领域已知技术实现的最快的数据传送速率(～250MB/s)高得多。TOF-MS的新进展已使得这个测量结果和数据传送工作流程更常规。本文可使用如(班杜拉分析化学(Bandura Anal Chem)2009 81:6813-22或美国专利号US8283624，其以引用的方式并入本文)中描述的TOF分析数据工作流程。

在一些实施方案中，由于原离子束撞击在样本上而产生的非元素二次离子(例如，多原子二次产物)可通过能量过滤相对于二次元素原子离子受到抑制，由此在由TOF质谱仪进行质量分离之前使二次元素原子离子富集。能量过滤可通过任何合适的能量过滤装置实现，所述能量过滤装置被配置来在二次离子的路径中生成静电扇区，并且因此使较低能量的离子(诸如多原子离子)远离TOF质谱仪偏转，并且允许质谱主要从具有较高能量的二次元素原子离子衍生。示例性能量过滤系统在例如美国专利号5,166,528、美国申请号20040206899和20060284076中进行描述，所述专利申请以引用的方式并入本文。

质谱仪系统可包括：a)二次离子质谱仪(SIMS)系统，其包括用于保持包括样本的基底的固持器，其中所述系统被配置来(i)利用原离子束(即，氧或氩等)扫描样本并且生成包括与样本相关联的质量标记的质量特异性丰度测量结果的数据集，并且(ii)输出所述数据集。在某些情况下，所述系统还可包括图像分析模块，所述图像分析模块处理所述数据集以产生样本图像。所述固持器位于可移动平台中，所述可移动平台可至少在x和y方向(位于样本的平面中)上可控地移动(例如，步进地或连续地移动)来协助扫描。在特定实施方案中，所述系统可包括链接到四级子、随后链接到离子脉冲发生器、随后链接到飞行时间(TOF)管的连续的原离子束(即，连续源)。

在一些情况下，所述系统包括：a)样本接口，其包括固持器，所述固持器被构造来固持包括平面样本的基底；b)原离子源，其能够利用直径小于1mm的原离子束照射所述平面样本上的区段，其中利用所述原离子照射所述平面样本引起从与所述平面样本相关联的染色元素衍生的二次元素原子离子的产生；以及c)正交离子质荷比分析器，其定位在样本接口下游，所述分析器被配置来通过飞行时间根据二次元素原子离子的质荷比来将所述二次元素原子离子进行分离；d)主要离子检测器，其用于检测所述二次元素原子离子并且产生质谱测量结果；以及e)同步器，其中所述系统被配置成使得所述原离子束跨所述平面样本进行二维扫描，并且所述同步器将所述质谱测量结果与所述平面样本上的位置相关联。如上文所解释的，所述系统可被配置成使得所述原离子源在所述原离子束跨所述平面样本扫描时连续照射所述平面样本。如将明显的，所述系统可包括：用于将输出数字化的数字转换器、用于传送数字化的数据输出的数据传送通道、以及以上未描述的其他部件。

如以上所指出，所述原离子束的直径是可调的，因为其可改变成例如在1mm至10nm的范围内的选定直径。在一些情况下，所述原离子源能够照射平面样本的直径小于10um、直径小于1um以及直径小于100nm的区段。在这些实施方案中，所述系统可被配置来执行初始“全”扫描，通过所述初始“全”扫描可识别出感兴趣的区域，并且随后在感兴趣的区域中执行进一步扫描。例如，质谱仪系统可被配置来执行平面样本的第一区域的第一扫描以收集第一组数据；并且执行平面样本的第一区域的第二扫描以收集第二组数据；其中所述第一扫描的所述原离子束的直径比所述第二扫描的所述原离子束的直径大至少两倍、大至少五倍或者大至少十倍。在这些实施方案中，同步器使质谱测量结果与平面样本上的位置和扫描的计时相关联。在一些实施方案中，所述系统可被配置来使用原离子束执行所述平面样本的所述第一区域的第三扫描以收集第三组数据，所述原离子束具有比所述第二扫描的所述束的直径更小(例如，最多其50％、最多其20％或者最多其10％)的直径。在一些实施方案中，使用具有在100μm至1mm的范围内、或者在100nm至100μm的范围内(例如，200nm至10μm)的直径的原离子束来收集第一组数据，并且使用具有在10nm至100μm(例如10nm至10μm、10nm至3μm，包括10nm至1μm)的范围内的直径的原离子束来收集第二组数据。

在重新扫描平面样本的区域的实施方案中，对于给定扫描来说，原离子源可从距离样本顶部2-10nm的任何地方溅射出。此范围的上限可随着更多强原离子源的实现而增加。给定视场的成像深度由每单位面积的原离子电流的总量指示。这指示所述束穿透到样本中的深度，所述深度与原离子电流和每个像素溅射的时间量(驻留时间)的乘积成比例。增加或减少离子电流或驻留时间将相应地改变穿透到样本中的深度。在这些实施方案中，给定质量通道的总信号应由所述质量的相对丰度乘以所溅射材料的总量(其由以上概述的问题指示)来指示。因此，使原离子电流保持恒定，这意味着对于比质量B更丰富100倍的质量A来说，A的像素驻留时间t/100应生成与B的驻留时间t相同量的信号。

使用高度丰富的标记(例如，细胞化学或IHC)进行的全扫描可使用短的像素驻留时间。例如，苏木精的信号高达1E3、比许多IHC标记更强烈，以使得可利用非常短的像素驻留时间来获得全扫描。这具有以下优点：不仅迅速地得到图像，而且因为驻留时间非常短，所以溅射深度非常浅并且很少消耗样本表面，从而使得几乎所有的IHC标记完整，以便进行后续扫描。全扫描还可通过使用更大的像素尺寸来执行。到了电流密度是恒定的程度，速度的增长可通过改变与D^2成比例的束直径(D)来实现，因此，可比250nm束斑大小的一个图像快十六倍地获得1um束斑大小的图像。

在一些实施方案中，所述系统可被配置来将平面样本移动到限定位置，从而向原离子束呈现平面样本上的第一区域，并且跨所述第一区域光栅扫描所述原离子束以便产生所述第一区域的多个质谱测量结果。在这些实施方案中，第一区域可处于0.1mmx0.1mm至1mmx0.1mm的范围内，例如，约0.5mmx0.5mm。在这些实施方案中，所述系统可另外被配置来：c)在已收集到所述第一区域的所述多个质谱测量结果之后，将所述平面样本移动到第二限定位置，从而向所述原离子束呈现所述平面样本上的第二区域；以及d)跨所述第二区域光栅扫描所述原离子束以便产生所述第二区域的多个质谱测量结果。平面样本上的感兴趣区域的相当大部分可以此方式进行扫描，即通过首先移动基底来使得感兴趣区域中的选定区域处于束的视场中，并且随后光栅扫描所述束通过所述区域。

由于元素分析的分辨率和可使用的元素同位素的数目，可能同时测量单一区段(像素)内的高达100个或更多个参数，而不经历光谱/信号重叠。如上文所讨论的，质谱仪系统可用于独立地测量生物材料的平面样本中的多个质量标记的丰度和位置。在这些实施方案中，数据输出可包含若干质量标记(例如，超过2个质量标记、高达5个质量标记、高达10个质量标记、高达20个质量标记、高达50个质量标记、高达100个质量标记、高达200个或更多个质量标记)的丰度和位置。图像分析模块可将从多个扫描区域获得的数据集组合成单一数据集，其中多个扫描区域中的每一个相对于彼此偏移。图像分析模块可调整邻近扫描区域之间的偏移，以便增加像素与接近邻近扫描区域的边缘的类似质量标记强度的重叠。

在一些实施方案中，平面样本的至少一部分的图像可通过以下方式来构造：将包括染色元素的平面样本置于上文所述的质谱仪系统的固持器中；并且使用所述质谱仪系统产生包含所述平面样本的区域的质谱测量结果的数据文件，其中所述质谱测量结果与所述平面样本上的位置相关联；并且使用所述质谱测量结果重建所述平面样本的图像。图像的数据文件(例如，pdf或gif)可转发到远程位置。在一些实施方案中，图像可显示在屏幕上。

图像分析模块可将数据集转换成一个或多个假彩色图像(例如，伪彩色、伪明场、伪免疫荧光)。图像可为任何合适的图像文件格式(例如，JPEG、Exif、TIFF、GIF、PNG、可由图像分析软件诸如ImageJ读取的格式等)。在某些实施方案中，图像分析模块可通过将一个或多个质量标记的丰度(例如，测得强度)转换成图像中的单独像素处的一个或多个假彩色的强度来产生图像。质量标记的强度与对应的假彩色的强度之间的关系可为线性的或非线性的(例如，对数的、指数的等)。

在某些实施方案中，所述系统被配置来生成多路复用数据集，所述多路复用数据集包括结合到样本表面上的区域的多个质量标记的丰度的空间上可寻址的测量结果。图像分析模块可转换多个质量标记测量结果，以产生多个假彩色图像。图像分析模块可覆盖多个假彩色图像(例如，在每个像素处叠加假彩色)以获得多路复用假彩色图像。多个质量标记测量结果(例如，未加权或已加权)可转换成单一假彩色，例如，以便呈现通过结合与多个质量标记中的每一个相关联的特异性结合试剂而表征的感兴趣的生物特征。假彩色可基于来自用户的手动输入而分配给质量标记或质量标记的组合。可替代地或此外，非监督式方法可用于确定有待由单一假彩色表示的质量标记组。非监督式方法可识别最大化方差同时最小化组数(例如像通过主成分分析(PCA))的质量标记组，将共处和/或邻近的质量标记分组(例如，通过任何合适的聚类算法)，或者可采用用于将有待由单一假彩色表示的质量标记分组的任何其他合适的方法。在某些方面中，图像可包括仅涉及与感兴趣特征(诸如细胞核区室中的质量标记)相关联的质量标记的强度的假彩色。

图像分析模块可进一步被配置来调整(例如，标准化)质量标记强度或假彩色的强度和/或对比度，以执行卷积运算(诸如使质量标记强度或假彩色模糊或锐化)，或者执行任何其他合适的操作来增强图像。在某些方面中，图像分析模块可对由多次2D扫描生成的数据集进行编译，以产生细胞的3D模型的图像。图像分析模块可执行以上操作中的任一种以排列从连续2D扫描获得的像素和/或使跨从连续2D扫描获得的像素的质量标记强度或假彩色模糊或平滑以产生3D模型。

在某些实施方案中，所述方法可包括：执行平面样本的全扫描以识别感兴趣的区域；以及通过以下方式重新扫描感兴趣的区域：通过以比全扫描更高的分辨率来光栅扫描离子束；使用具有比全扫描更小直径的原离子束；利用比全扫描更长的区段采集时间，从而收集每区段更多的质谱或者从每区段更多的离子收集光谱，或者利用比全扫描更大的质量范围，从而测量每区段更大数目的元素同位素质量。在此方法中，在初始全扫描中以计算方式或手动识别出感兴趣的区域；并且/或者后续成像分析省略所述平面基底中发现已全无样本的区域。

在这些实施方案中，可基于质荷种类的单独或组合水平利用颜色或阴影标度来重建平面样本的视觉图像。

图像分析方法可在计算机上实现。在某些实施方案中，通用计算机可被配置成本文公开的方法和程序的功能性布置。这种计算机的硬件架构对本领域的技术人员是熟知的，并且可包括硬件部件，所述硬件部件包括处理器(CPU)、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、内部或外部数据存储介质(例如，硬盘驱动器)等中的一个或多个。