混合质谱仪的制作方法
本发明涉及有机样本且尤其是例如蛋白质、肽、代谢物、脂质等生物样本的数据独立分析(dia)。具体地说，这涉及应用于蛋白质组学、代谢组学、脂质组学等的高分辨率数据独立鉴定和量化技术。
背景技术
质谱法是一种建立已久的技术，用于鉴定和量化通常复杂的较大有机分子混合物。近年来，已开发了允许分析广泛范围的生物和非生物材料的技术，其应用横跨以下领域：执法(例如药物和爆炸物材料的鉴定)、环境、科学研究和生物学(例如在蛋白质组学方面，蛋白质的简单和复杂混合物的研究，应用于药物发现、疾病鉴定等)。
包含大量的氨基酸的蛋白质通常具有相当大的分子量。因此，通过直接质谱测量来准确鉴定和量化蛋白质是具有挑战性的。因此，众所周知，要进行前体样本材料的碎片化。已知各种碎片化技术，其可使不同碎片离子从前体离子产生。此外，所施加的不同碎片化能量可影响碎片化机制。
样本分析可广义地分为数据独立分析/获取(dia)和数据依赖分析/获取(dda)技术。dia力图确定可能未知特性的样本中存在什么。为确定样本分子的分子结构，首先用质谱仪来对选定的质荷比(m/z)窗口内的所有样本离子(前体离子)进行质量分析。此类扫描通常表示为ms1扫描。接着将选定的样本离子碎片化，且随后跨越选定的m/z范围对所得碎片进行质量分析。对碎片化离子的扫描通常表示为ms2扫描。
相比之下，dda力图确认给定样本中存在一种或多种物种。dda方法鉴定固定数目的前体离子物种，且通过质谱法选择和分析那些前体离子物种。可基于强度排序(例如，通过ms1谱中的峰观测到的前十个最大量的物种)、或通过限定前体质谱峰“包含列表”(例如通过用户选择)且总是根据所述“包含列表”获取ms2谱而不论ms1质谱中的峰的强度排序如何来确定dda中哪些前体离子物种受关注。而除此以外，可例如由用户基于例如对预期样本内容物的先验知识来限定ms1中的峰的“排除列表”。
通过将受关注质量范围(通常由用户限定)简单地分成段且获得每个段的ms2谱，dia能避免dda中必要的决策。在dia的情况下，对ms1前体谱的获取或多或少变得任选，因为样本离子选择窗口的参数带有关于所述窗口内可能的样本离子范围的信息。
micromassukltd和watertechnologiescorporation的专利申请中以其所谓的mse布置公开早期dia技术。dia技术通过将已知的三重四极杆方法应用于四极杆-tof布置而产生。
在us-b-6,717,130中，公开一种技术，其中通过反复地切换碎片化单元的能量来交替地获取ms1和ms2。所述技术依赖于在色谱法环境中通过不同洗脱时间分离样本分子。在实验运行结束时，通过比较在两个不同碎片化模式下的质谱来辨识前体离子和碎片离子。基于其洗脱时间拟合的紧密程度，将碎片离子与特定前体离子匹配，使得随后可鉴定前体离子。
us-b-6,982,414公开上述'130专利中的dia技术的发展。此处，同样反复地切换施加到碎片化单元的能量以便获得ms1和ms2两者。然而此处，分别从第一样本和第二样本获得ms1和ms2。
接着比较质谱且进一步进行分析，其中以不同方式表达来自每个样本的ms1中的前体离子或来自每个样本的ms2中的碎片离子。
最后，us-b-7,800,055同样采用在碎片化室中在能级之间切换，以便以交替的方式产生ms1和ms2。对前体峰和碎片峰的色谱峰形进行比较以鉴定前体离子与碎片(产物)离子之间的关联。
在颁予dhtechnologiesdevelopmentpte.ltd的各种专利中已提出被称为“swath”的dia替代方法。
在us-b-809,770中，获取dia数据集以使得随后可针对目标物质分析所述数据。这与设定目标、然后仅出于此目的获取数据的构思形成对照。所述方法采用lc-ms且使用宽的前体离子窗口(例如>10、>15、>20amu)以用于ms2，从而允许涵盖整个前体空间。
同样，'770专利强调通过适当设置窗口来保持ms2谱中色谱峰的保真度的重要性。指示ms1谱是任选的。
举例来说，'770专利描述类似于单反应监测(srm)的方法，所述方法用于评估随滞留时间而变的前体质量窗口的ms2数据，且用于与参考谱库的后续比较。
us-b-8,809,772采用宽度可变的前体离子隔离窗口，所述宽度取决于前体质量。所述方法牺牲了分析速度(对于宽窗口)和灵敏度/特定性(对于窄窗口)。
us-b-9,343,276通过以下方式化解了us-b-8,809,770中公开的方法的缺点：利用ms1信息在提取离子色谱图(xic)碎片峰之间进行比较时基于各种准则对xic候选峰进行评分，所述ms1信息例如质量精度、电荷态、同位素态、已知中性损失等等。
上述mse和swath技术中的方法的共同方面在于，它们力求优化良好ms2时间分辨率的测量。为了获得跨越lc峰的足够的数据点以用于良好量化，需要采用相对宽的前体隔离窗口(24da)——如上文论述的mse专利中所提出——或可变宽度前体隔离窗口(上文论述的swath专利的优选方法)。
结果会是：其中就如dda那样将样本碎片谱与库中的已知物种的碎片谱进行比较的传统数据库搜索可能不大适合dia数据分析。在swath技术的情况下，首先必须创建大型谱库(针对相同或类似样本类型)以用于从复杂谱中靶向提取ms2色谱图，这是个昂贵和耗时的任务。
在weizhang等人的“evaluationofdata-independentacquisition(dia)approachesforspikedpeptidesinheladigestonq-ot-qitmassspectrometer”中(可在http://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/pn-64122-q-ot-qit-asms2014-pn64122-en.pdf获取)，公开一种使用串联质谱仪的dia分析方法。具体地说，轨道阱质谱仪用于执行前体离子的ms1扫描，而线性离子阱用于针对每个ms2扫描使用3amu的质量窗口来执行碎片化离子的ms2分析。通过使用窄的质量窗口，所得数据可直接用于数据库搜索，从而实现dda和dia方法的整合。
技术实现要素：
在对约为若干秒的窄色谱峰执行dia方法方面，理想地需要在整个m/z范围上在至少七个或最好是至少十个时间处对色谱峰进行取样。此需求不断地促成越来越短的dia周期时间，当前2到3秒被视为用于蛋白质组学和代谢组学中的应用所允许的周期时间的上限。同时，对不同蛋白质组/代谢组更深覆盖率的需求导致需要越来越大的谱库以用于dia数据的量化。
本发明人已意识到，现有dia方法的一个问题在于，需要碎片谱的较大谱库以用于ms2域中的碎片谱的量化。本发明人已意识到，期望的是发展到无库方法以用于样本的dia分析。为了实现此类无库分析，本发明人提出一种实现显著更高的dia特异性和速度的方法和设备。
举例来说，上文已论述一种针对每个ms2扫描使用3amu的质量窗口的dia分析方法。这种相对窄的质量窗口类似于用在已知dda方法中的靶向质量窗口。通过针对ms2扫描中的每一个使用相对窄的质量窗口，可使用dda类数据库而非需要整个dia专用谱库来分析所得ms2谱。
本发明人已认识到，使用此类针对ms2扫描中的每一个的窄质量窗口的一个问题在于，针对受关注质量范围建立全范围的ms2扫描所需的扫描数目增大。因此，执行完整的dia分析所花的时间可能变得过长，例如比色谱峰的持续时间长许多。如果dia分析未在色谱峰的持续时间内完成，那么分析可能不会提供有意义的数据，因为一些分析部分将测量不到样本峰。
此外，本发明人所认识到的此方法的另一问题在于，针对每个ms2扫描的相对窄的质量窗口会导致相对少的碎片化离子——如果存在的话——在给定时间到达检测器。因此，减小每个ms2扫描的质量选择窗口会导致ms2质量分析器的质量精度和/或灵敏度的减小。此问题在尝试以足够的频率执行大量ms2扫描以拟合色谱峰持续时间内的所有ms2扫描时加剧。
本发明力图解决现有dia方法的所述缺点。根据本发明的第一方面，提供根据权利要求1的一种数据独立分析(dia)方法。本发明还涉及根据权利要求14的质谱仪。
为了获取适合的数据以使用dda类数据库进行前体离子鉴定/量化，本发明利用高分辨率、高质量精度质量分析器获取ms1和ms2谱。具体地说，在ms2域中，本发明获取小于5amu的窄质量段的ms2谱。以此方式，可利用dda类数据库来分析ms2谱。具体地说，重要的是使用高质量精度高分辨率的质量分析器来获取ms2谱，以便利用对于适用的dda类数据库来说足够的精度来鉴定碎片。
有利的是，通过利用与ftms质量分析器串联的飞行时间(tof)质量分析器，在ms1域和ms2域中均可执行高质量精度扫描。此外，ms2扫描利用优选地以至少100hz的频率操作的tof质量分析器，以便执行小于5amu的前体质量段的多个ms2扫描。通过以此类频率执行多个ms2扫描，可在周期时间内跨越整个受关注质量范围获取对应于前体离子窄窗口的ms2谱，所述周期时间允许dia方法对色谱峰进行充分取样。
重要的是，可联合对ms2数据的获取而跨越整个受关注质量范围获取ms1数据。通过利用ftms质量分析器，还可获取高分辨率高质量精度的ms1数据以补充ms2数据。此外，相比于与ms2扫描连续地执行ms1扫描，通过联合ms2数据获取ms1数据可减小总的周期时间。
优选的是，碎片化离子在注入飞行时间质量分析器之前进行累积。通过在ms2域中的质量分析之前累积碎片化离子达预定时间(持续时间)，每组离子中的碎片化离子的数目增大。下文描述用于离子累积的方法和设备。在优选实施例中，这可使所有碎片化离子用于ms2扫描，由此增大工作周期。当飞行时间质量分析器用于对每组碎片化离子进行质量分析时，通过增大每组中的离子数目，在飞行时间质量分析器的检测器处检测到的信号强度增大。
优选地，飞行时间质量分析器以至少100hz或至少150hz、200hz、250hz或300hz的频率操作。通过向tof质量分析器提供最小操作频率，dia方法的总周期时间可相对于色谱峰的持续时间减小，且因此确保对样本离子进行适当取样。优选地，tof质量分析器以不超过1000hz、或更优选地900hz、800hz或700hz的频率操作，以便在碎片化离子注入tof分析器中之前为其提供足够的累积时间。有利的是，通过累积碎片化离子且对所述碎片化离子进行分组质量分析，可增大所得ms2扫描的分辨率和质量精度，同时还实现合适的操作频率，所述合适的操作频率允许在色谱峰的持续期间分析相对宽的质量范围(例如400到1000m/z)。
优选地，本发明利用轨道捕集质量分析器来执行前体离子的相对高分辨率的ms1扫描。因此，还可利用高分辨率和高质量精度捕获ms1域中的数据。其它高分辨率质量分析器可用作第一质量分析器来执行ms1扫描。举例来说，离子回旋共振(icr)质量分析器或飞行时间质量分析器(尤其是多反射飞行时间质量分析器)。
优选地，ftms质量分析器以至少50,000、或更优选地至少75,000、100,000、150,000或200,000的质量分辨率(在200m/z下的分辨率)执行ms1扫描。在其它类型的质量分析器用于前体离子的ms1扫描的情况下，所述质量分析器还优选地以至少50,000、或更优选地至少75,000、100,000、150,000或200,000的质量分辨率(在200m/z下的分辨率)执行ms1扫描。通过以此类质量分辨率执行ms1扫描，ms1数据可更适合使用dda类库进行分析，由此使前体量化/鉴定的准确度增大。
优选地，本发明利用多反射飞行时间质量分析器(mr-tof)来执行多个ms2扫描。通过利用mr-tof，碎片化离子组的飞行时间可因穿过mr-tof的离子组飞行路径中所含的多个反射而增大。利用相对长的飞行路径，例如超过10m、或15m或优选地20m，或更优选地25m是有利的，因为这会增大到达mr-tof中的检测器的每个组的时间分辨率，且可减小不利的空间电荷效应。mr-tof质量分析器的实例包含wo2010/0136533中所描述的轨道型mr-tof分析器或wo2013/110587中所描述的倾斜镜型mr-tof分析器。因此，使用mr-tof，可在不需要增大用于每个扫描的测量时间的情况下增大ms2扫描的分辨率。因此，根据本发明的方法，可在色谱峰的持续时间内执行多个窄质量窗口(即小于5amu)ms2扫描。
优选地，在ms2域中扫描的前体离子的每一段的质量范围并不大于3amu，或更优选地，不大于2.5amu或2amu。通过减小碎片化以用于ms2分析的前体离子的每一段的质量范围，由可能的前体离子形成的所得ms2谱的可能的前体离子数目减小。因此，所得ms2谱的复杂性可减小，由此改善后续的针对前体离子的量化和/或鉴定的ms2谱分析。
优选地，对于ms2扫描中的每一个，tof质量分析器的质量分辨率至少为40,000(在200m/z下的分辨率)。更优选地，tof分析器的分辨率至少为45,000或50,000。通过在此类分辨率下提供ms2扫描，ms2谱的质量精度可与对应的高分辨率高质量精度ms1扫描相匹配，和/或可与用于样本的量化和/或鉴定的dda类数据库相匹配。
优选地，至少x％的ms2扫描含有大于y个离子计数，其中x＝30或50或70或90，且y＝200或500或1000或3000或5000。通过确保至少指定百分比的ms2扫描具有最小离子计数，可增大ms2扫描的动态范围。因此，所得ms2数据的质量精度增大。
优选地，在色谱峰的持续时间中多次重复dia方法。因此，dia测量的周期时间可适于在色谱峰的持续时间中执行多次。通过在色谱峰的持续时间中多次执行dia方法，可多次对峰进行取样，从而允许建立峰的完整图像。优选地，在色谱峰的持续时间中至少执行3、4、5、7、9或更优选地10次dia方法。
优选地，跨越受关注质量范围执行前体离子的ms1扫描另外包括将受关注质量范围中的前体离子分成多个质量子范围，且对于每个质量子范围的前体离子，使用傅里叶变换质量分析器对所述子范围的前体离子进行质量分析。由此，受关注质量范围中的前体离子的ms1扫描被分成所述前体离子的多个质量子范围的一组(多个)ms1扫描，其中所述多个质量子范围的组合构成受关注质量范围。通过将ms1扫描分为一组ms1扫描，可减小与相对宽的前体质量范围相关联的空间电荷效应。优选地，每个质量子范围中的前体离子的质量范围不超过300amu、或更优选地200amu、或更优选地100amu。通过减小每个质量子范围的质量范围，可进一步减小空间电荷效应。
优选地，受关注质量范围具有至少600amu、更优选地至少800amu、或更优选地至少1000amu的质量范围。举例来说，受关注质量范围可以是400m/z到1000m/z。通过变化受关注质量范围的宽度，可调适用于执行dia分析的时间以便对应于色谱峰的持续时间。还可基于待分析的前体离子的所要质量范围来选择前体受关注质量范围。
在优选实施例中，本发明包括：跨越受关注质量范围将前体离子分为多个前体质量子范围；
其中针对每个前体质量子范围：
i)执行ms1扫描，每个ms1扫描包括：
使用第一质量分析器、优选的是ftms质量分析器来跨越前体质量子范围的质量范围对前体质量子范围的前体离子进行质量分析；以及
ii)执行多个ms2扫描，所述多个ms2扫描包括：
跨越前体质量子范围的质量范围进一步将前体质量子范围分为多个前体质量子范围段，每个前体质量子范围段具有不超过5amu的质量范围；
其中针对每个前体质量子范围段：
使所述前体质量子范围段内的前体离子碎片化；
通过以下方式来执行碎片化离子的ms2扫描：
由碎片化离子形成离子组(优选地通过累积碎片化离子，优选地在离子阱中，从而形成碎片化离子组)；以及将碎片化离子的离子组注入飞行时间质量分析器且对碎片化质量子范围段的碎片化离子进行质量分析。
优选地，执行ms2扫描组的ms2扫描包含组合来自多个前体质量段的碎片化离子以使得对组合的碎片化离子进行质量分析。优选地，多个前体质量段一起碎片化且随后一起进行质量分析。优选地，以此方式从所述ms2扫描组产生的数据进行解卷积以获得前体质量段中的每一个的ms2谱。在另一优选实施例中，多个前体质量段分别进行碎片化，例如在时间上分开(依序)，且随后一起进行质量分析(任选地，其中ms2扫描组进行解卷积以获得前体质量段中的每一个的ms2谱)。通过同时执行多个前体质量段的ms2扫描，用以获得ms2谱的时间可减少。另外，所述方法允许前体质量段中的一个或多个作为多于一个组合的部分进行质量分析。因此，所得ms2质谱的质量精度可因前体质量段的多个ms2扫描而改善。
根据本发明的第二方面，提供根据权利要求14的质谱仪。
根据本发明的第三方面，一种计算机程序包括指令以使本发明的第二方面的质谱仪执行根据本发明的第一方面的方法的步骤。举例来说，第三方面包含计算机程序，所述计算机程序包括指令以使权利要求14到24中任一项的质谱仪执行根据权利要求1到13中任何一项的方法的步骤。
根据本发明的第四方面，提供一种在其上存储有第三方面的计算机程序的计算机可读媒体。
本发明的第五方面提供一种用于分析受关注质量范围内的样本的质谱法数据独立获取方法，在基于样本在其从色谱法系统洗脱时的色谱峰宽度的时间段内执行所述方法。所述方法包括电离样本以产生多个前体离子的步骤。所述方法还包括执行前体离子的ms1扫描的步骤，包含使用第一质量分析器在m/z＝200时以至少50,000的分辨率跨越受关注质量范围对前体离子进行质量分析以鉴定和/或量化ms1域中的前体离子。所述方法还包括执行一组ms2扫描的步骤。执行所述一组ms2扫描包括将前体离子分为多个前体质量段，其中每个前体质量段具有不超过5amu的质量范围。对于每个前体质量段，所述方法包括将所述前体质量段内的前体离子碎片化且对碎片化离子执行ms2扫描。执行碎片化离子的ms2扫描包括由碎片化离子形成离子组以及将碎片化离子的离子组注入飞行时间质量分析器且对碎片化离子进行质量分析。飞行时间质量分析器在m/z＝200时以至少40,000的分辨率执行ms2扫描中的每一个。优选地，飞行时间质量分析器以至少100hz的频率执行ms2扫描。举例来说，根据第五方面的第一质量分析器可以是傅里叶变换质量分析器或不同于用于执行ms2扫描的飞行时间质量分析器的飞行时间质量分析器。
如上文所论述的本发明的第一方面的优势和任选特征同等地适用于本发明的第二、第三、第四和第五方面。
附图说明
本发明可用许多方式来实践，且现将仅通过举例并且参考附图来描述具体实施例，在附图中：
-图1示出适合于执行根据本发明的实施例的方法的质谱仪的示意图；
-图2示出表示根据本发明的实施例进行的ms1和ms2扫描的简图；
-图3示出根据本发明的实施例的dia方法的示范性流程图；
-图4示出适合于执行根据本发明的实施例的方法的替代性质谱仪的示意图；
-图5a示出附加到色谱峰特性上的根据本发明的实施例的dia方法的实例；
-图5b示出与根据本发明的实施例的质量分析器的加载相关联的定时的示意图；
-图6示出适合于执行根据本发明的实施例的方法的另一替代性质谱仪的示意图。
具体实施方式
在本文中，术语质量可用于指代质荷比m/z。除非另行说明，否则将质量分析器的分辨率理解为指代在200的质荷比下确定的质量分析器分辨率。
图1示出适合于执行根据本发明的实施例的方法的质谱仪10的示意性布置。
在图1中，待分析的样本(例如从自动进样器)供应到例如液相色谱(lc)柱的色谱设备(图1中未示)。lc柱的一个此类实例为赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific,inc)的proswift整体柱，其通过在高压下迫使在流动相中运送的样本穿过构成固定相的不规则或球形形状的粒子的固定相来提供高效液相色谱(hplc)。在hplc柱中，样本分子根据其与固定相的相互作用程度而以不同速率洗脱。
可通过使用检测器(例如质谱仪)随着时间推移测量从hplc柱洗脱的样本分子的量来产生色谱。从hplc柱洗脱的样本分子将被检测为高于色谱上的基线测量值的峰。在不同样本分子具有不同洗脱速率的情况下，可检测到色谱上的多个峰。优选地，个别样本峰在时间上与色谱图中的其它峰分开，使得不同样本分子并不彼此干扰。
在色谱上，色谱峰的存在对应于样本分子在检测器处存在的时间段。由此，色谱峰的宽度相当于样本分子在检测器处存在的时间段。优选地，色谱峰具有高斯(gaussian)形分布，或可假设具有高斯形分布。因此，可基于根据峰计算的标准差数来确定色谱峰的宽度。举例来说，可基于色谱峰的4倍标准差计算峰宽。替代地，可基于峰的最大半高宽来计算峰宽。所属领域中已知的用于确定峰宽的其它方法也是合适的。
接着，使用处于常压的电喷雾电离源(esi源)20电离通过液相色谱法由此分离的样本分子。
接着，样本离子进入质谱仪10的真空室且通过毛细管25引导到仅rf的s透镜30中。离子通过s透镜30集中到注入平杆(flatapole)40中，所述平杆将离子注入到具有轴向场的弯曲平杆50中。弯曲平杆50沿着穿过其中的弯曲路径导引(带电)离子，而夹带的溶剂分子等不合需要的中性分子并未沿着所述弯曲路径被导引，从而丢失。
离子门(tk透镜)60位于弯曲平杆50的远端，且控制离子从弯曲平杆50进入呈四极滤质器70形式的下游质量选择器的通行。四极滤质器70通常但未必为分段式，且充当带通滤波器，从而允许选定的质量数或有限质量范围的通过，同时排除其它质荷比(m/z)的离子。滤质器还可以仅rf模式操作，其中所述滤质器并无质量选择性，即，其传输基本上所有的m/z离子。举例来说，四极滤质器70可由控制器130控制以选择被允许聚集的一定范围的质荷比的前体离子通过，同时滤除前体离子流中的其它离子。替代地，s透镜30可作为离子门操作，且离子门(tk透镜)60可以是静电透镜。
尽管图1中示出四极滤质器，但所属领域的技术人员应了解，其它类型的质量选择装置也可适合于选择受关注质量范围内的前体离子。举例来说，us-a-2015287585中所描绘的离子分离器、wo-a-2013076307中所描绘的离子阱、us-a-2012256083中所描述的离子迁移分离器、wo-a-2012175517中所描述的离子门质量选择装置或us799223中所描述带电粒子阱，以上内容以全文引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员应了解，根据离子迁移率、微分迁移率和/或横向调制来选择前体离子的其它方法也是合适的。
还可使用称为同步前体扫描(sps)的方法来执行离子阱中的不同质量或质量范围的多种离子的隔离。此外，在一些实施例中，可提供多于一个的离子选择装置或质量选择装置。举例来说，可在碎片化室120的下游提供另一质量选择装置。以此方式，必要时可执行ms3或msn扫描(通常使用tof质量分析器以用于质量分析)。
离子接着穿过四极杆出射透镜/对切透镜布置80并且进入第一转移多极杆90。第一转移多极杆90将已滤质离子从四极滤质器70导引到弯曲线性离子阱(c阱)100中。c阱(第一离子阱)100具有供应有rf电压的纵向延伸的弯曲电极以及供应有dc电压的端盖。得到一个沿着c阱100弯曲的纵向轴线延伸的势阱。在第一操作模式中，对c阱设置dc端盖电压，使得从第一转移多极杆90到达的离子被捕获于c阱100的势阱中，所述离子在势阱中冷却。离子到c阱中的注入时间(it)确定随后从c阱射入质量分析器中的离子数目(离子数)。
冷却的离子朝向势阱的底部滞留成云且接着从c阱朝向第一质量分析器110正交射出。如图1中所示，第一质量分析器是轨道捕集质量分析器110，例如赛默飞世尔科技公司出售的
轨道捕集质量分析器中的离子组的移动的轴向(z)分量(或多或少)定义为简谐运动，其中z方向上的角频率与给定离子物种的质荷比的平方根相关。因此，随着时间推移，离子根据其质荷比而分离。
通过使用图像检测器(未示出)来检测轨道捕集质量分析器中的离子，所述图像检测器在离子物种通过图像检测器时在时域中产生含有关于所有离子物种的信息的“瞬态”。接着，所述瞬态经受快速傅里叶变换(fft)，从而产生频域中的一系列峰。根据这些峰，可产生表示丰度/离子强度与m/z的质谱。
在上述配置中，在无碎片化的情况下，通过轨道捕集质量分析器来分析样本离子(更具体地说，由四极滤质器选择的受关注质量范围内的样本离子的质量范围段)。所得质谱标示为ms1。
尽管图1中示出轨道捕集质量分析器110，但替代地可使用其它傅里叶变换质量分析器。举例来说，傅里叶变换离子回旋共振(fticr)质量分析器可用作ms1扫描的质量分析器。轨道捕集质量分析器和离子回旋共振质量分析器等质量分析器甚至在不同于傅里叶变换的其它类型的信号处理用于从瞬态信号获得质谱信息的情况下也可用在本发明中(参看例如wo2013/171313，赛默飞世尔科技)。
在c阱100的第二操作模式中，穿过四极杆出射透镜/对切透镜布置80和第一转移多极杆90进入c阱100的离子还可继续它们穿过c阱的路径并且进入碎片化室120。由此，c阱在第二操作模式中有效地充当离子导引件。替代地，c阱100中冷却的离子可在轴向方向上从c阱射入碎片化室120中。在图1的质谱仪10中，碎片化室120是碰撞气体被供应到的较高能量碰撞离解(hcd)装置。到达碎片化室120中的前体离子与碰撞气体分子碰撞，从而使前体离子碎片化为碎片离子。
尽管图1中示出hcd碎片化室120，但替代地可使用采用碰撞诱导离解(cid)、电子捕获离解(ecd)、电子转移离解(etd)、光致离解等其它碎片化装置。
碎片化离子可在相对轴向端从碎片化室120射到c阱100。射出的碎片化离子进入第二转移多极杆130。第二转移多极杆130将碎片化离子从碎片化室120导引到提取阱(第二离子阱)140中。提取阱140是含有缓冲气体的射频压控阱。举例来说，合适的缓冲气体是压力范围在5x10-4mbar到1×10-2mbar内的氩气。提取阱能够快速切断所施加的rf电压，且施加dc电压以提取捕集的离子。合适的平板提取阱，也称为矩形离子阱，另外描述于us9548195(b2)中。替代地，c阱还适合用作第二离子阱。
提供提取阱140以在碎片化离子注入飞行时间质量分析器150之前形成碎片化离子的离子组。提取阱140在碎片化离子注入飞行时间质量分析器150之前使碎片化离子累积。
尽管在图1的实施例中示出提取阱(离子阱)，但所属领域的技术人员应了解，形成碎片化离子的离子组的其它方法将同等地适合于本发明。举例来说，可利用离子相对缓慢转移穿过多极杆来影响离子的聚集，离子可随后作为单个组射到tof质量分析器。替代地，可利用离子的正交位移来形成组。这些替代方案的其它细节存在于描述行波离子聚集方法的us20030001088a1中，其内容以引用的方式并入本文中。
在图1中，所示飞行时间质量分析器150是多反射飞行时间质量分析器(mr-tof)150。mr-tof150围绕在漂移方向上伸长的两个相对离子镜160、162而构造。所述镜在与漂移方向正交的方向上相对。提取阱140将离子注入第一镜160中，且接着离子在两个镜160、162之间振荡。离子从提取阱140和另外的偏转器170、172的射出角度允许控制漂移方向上的离子能量，使得离子在振荡时顺着镜160、162的长度被引导，从而产生z形轨迹。镜160、162自身相对于彼此而倾斜，从而产生势梯度，所述势梯度延迟离子的漂移速度且使离子在漂移维度上反射回来且集中到检测器180上。相对镜的倾斜一般会具有在离子沿漂移维度行进时改变离子振荡的时间段的负面副作用。这利用带状电极190(作为补偿电极)进行校正，所述带状电极改变镜间空间的顺着相对镜160、162的长度而变化的部分的飞行电势。带状电极190的变化宽度与镜160、162之间的距离变化的组合允许离子反射和空间集中到检测器180上以及维持良好的时间集中性。用于本发明中的合适的mr-tof150另外描述于us2015028197(a1)中，其内容以全文引用的方式并入本文中。
一旦预定数目的离子累积于提取阱中，则累积于提取阱中的离子作为离子组注入mr-tof150中。通过确保注入mr-tof150中的每组离子具有至少预定(最小)数目的离子，到达检测器处的所得离子组将表示ms2谱的整个受关注质量范围。因此，单个碎片化离子组足以获取碎片化离子的ms2谱。这与飞行时间谱的常规获取相比能体现增大的灵敏度，在所述常规获取中，对于每个给定质量范围段，通常获取多个谱并且求和。优选地，在射出到飞行时间质量分析器之前，每个窄质量窗口中的最小总离子流(tic)累积于提取阱中。优选地，飞行时间质量分析器在ms2域中每秒获取至少n个谱(扫描)，其中n＝50，或更优选地100或200或更多。
优选地，至少x％的ms2扫描含有大于y个离子计数(其中x＝30或50或70或最优选地90或更多，且y＝200或500或1000或2000或3000或5000或更多)。最优选地，至少90％的ms2扫描含有大于500个离子计数，或更优选地大于1000个离子计数。这会提供增大的ms2谱动态范围。可通过调整包含在每组碎片化离子中的离子数目来提供每个ms2扫描的所要离子计数。举例来说，在图1的实施例中，可调整提取阱的累积时间以确保已累积足够数目个离子。由此，控制器195可配置成确定在预定数目的离子存在于提取阱中或已经过预定时间段时已形成合适的碎片化离子组。可指定预定时间段，以便确保飞行时间质量分析器在到提取阱的离子流相对低时以所要频率操作。
质谱仪10处于控制器195的控制下，所述控制器例如配置成：控制捕获组件的射出定时；设置四极杆等的电极上的合适电势以便聚集和过滤离子；从轨道捕集装置110获得质谱数据；从mr-tof150获得质谱数据；控制ms1和ms2扫描的序列等等。应了解，控制器195可包括可根据计算机程序而操作的计算机，所述计算机程序包括指令以使得质谱仪执行根据本发明的方法的步骤。
应理解，图1中示出的组件的具体布置对于随后描述的方法不是必需的。实际上，用于执行本发明的实施例的dia方法的其它布置是合适的。
现将参考图2和3描述所述方法的示范性实施例，其中从作为上文所描述的示范性设备(如图1所示)的部分的液相色谱(lc)柱供应样本分子。
在本发明的示范性实施例中，从lc柱供应样本离子，使得根据本发明的dia方法在某一持续时间里获取与样本有关的数据，所述持续时间对应于从lc柱供应的样本的色谱峰的持续时间。由此，控制器195配置成在对应于色谱峰在其底部处的宽度(持续时间)的时间段内执行所述方法。
如图2所示，轨道捕集质量分析器(标示为“轨道阱”)用以跨越受关注质量范围执行多个ms1扫描。举例来说，如图2所示，待分析的受关注质量范围是400到1000m/z。在受关注质量范围内，使用受关注质量范围的前体离子的质量子范围来执行多个ms1扫描。替代地，可使用来自整个受关注质量范围的前体离子执行单个ms1扫描(即此实例中的400到1000amu)。
为了执行单个ms1扫描，使用esi源20电离来自lc柱的样本分子。样本离子随后进入质谱仪10的真空室。以如上文所描述的方式，将样本离子引导通过毛细管25、仅rf透镜30、注入平杆40、弯曲平杆50，并且进入四极滤质器70中。四极滤质器70由控制器195控制以根据选定的前体受关注质量子范围来过滤样本离子。举例来说，如图2所示，跨越从400m/z到1000m/z的受关注质量范围在400到500m/z、500到600m/z…直到900到1000m/z的前体质量子范围中执行ms1扫描。
接着，离子穿过四极杆出射透镜/对切透镜布置80、通过转移多极杆90并且进入c阱100，离子在所述c阱中累积。质量范围段的(前体)样本离子可从c阱100注入到轨道捕集质量分析器110中。一旦离子在轨道捕集质量分析器内部稳定，就通过使用像电流检测器检测轨道捕集质量分析器110中存在的离子来执行ms1扫描。对于ms1扫描，轨道捕集质量分析器中离子的检测配置成以相对高分辨率(相对于ms2扫描的分辨率)执行。举例来说，至少50,000或优选地至少100,000的分辨率(r)可用于每个ms1扫描(参看图2中的分辨率r＝120,000)。
通过使用傅里叶变换质量分析器(例如轨道捕集质量分析器)，以高度的质量精度来执行ms1扫描。优选地，以小于百万分之5、或更优选地百万分之3(ppm)的质量精度来执行ms1扫描。质量分析器的百万分率质量精度δm可确定为离子的测量质量mi与离子的实际质量ma之间的差除以离子的实际质量乘以106，如下所示：
如图2所示，联合ms1扫描来执行多个ms2扫描。使用飞行时间质量分析器或更优选地如图2所示的mr-tof来执行ms2扫描。
为了执行质量范围段的单个ms2扫描，以与ms1扫描类似的方式电离来自lc柱的样本分子且将其注入到质谱仪中。用于ms2扫描的样本离子以与用于ms1扫描的样本离子类似的方式前进通过毛细管25、仅rf透镜30、注入平杆40、弯曲平杆50并且进入四极滤质器70中。
一旦用于ms2扫描的样本离子到达四极滤质器70，四极滤质器70就由控制器195控制以根据被扫描的相对窄质量范围段来过滤样本离子。每个前体质量范围段具有不超过5amu、或优选地不超过3amu、或更优选地不超过2amu的质量范围(如图2所示)。
如以上针对ms1扫描所描述的，(已过滤质量段)前体离子从四极滤质器70传送直到c阱100。控制器195接着控制c阱以允许前体离子在轴向方向上朝向碎片化室120穿过。
在hcd碎片化室120中，前体离子与碰撞气体分子碰撞，这导致前体离子碎片化为碎片离子。
接着，质量范围段的碎片化离子在相对轴向端处从碎片化室射出到c阱100。射出的碎片化离子进入第二转移多极杆130。第二转移多极杆130将碎片化离子从碎片化室120导引到提取阱(第二离子阱)140中，所述碎片化离子在所述提取阱中累积。碎片化离子可在提取阱140中累积某一预定时间。
接着，碎片化离子从提取阱注入注入到mr-tof中。提取阱中碎片化离子的先前累积允许碎片化离子作为组注入到mr-tof中。离子组在检测器处被检测之前沿着mr-tof的飞行路径行进，从而经历多个反射。组内的碎片化离子的不同到达时间允许产生碎片化离子组的ms2质谱。mr-tof的飞行路径长度结合检测器的时间分辨率允许mr-tof以超过40,000的分辨率(参看图2中的r＝50,000)执行ms2扫描。
用以分析ms2域中的碎片化离子的基于组的方法的一个益处在于，一旦累积的离子从提取阱中射出，则下一质量范围段的碎片化离子可以开始填充提取阱。由此，来自一个质量范围段的碎片化离子可在下一质量范围段的碎片化离子累积时行进通过mr-tof。因此，在色谱峰内可因利用从提取阱到mr-tof的基于累积组的碎片化离子的注入而实现每个ms2扫描中的较大数目的离子计数。
根据示范性实施例，在dia方法的单个周期，控制器195控制质谱仪10以执行受关注质量范围的质量子范围的多个ms1扫描，且联合受关注质量范围中的质量范围段的多个ms2扫描。为了获取色谱峰的更精确样本，控制器195可在色谱峰的持续时间里重复数次dia方法周期。举例来说，dia方法的单个周期可能需要大约1.5s来执行。由此，在色谱峰的持续时间里可执行至少7次或更优选地至少9次所述周期。这使ms1和/或ms2谱数据能够用于量化色谱峰中的洗脱样本。
图3的流程图中描述本发明方法的另一示范性实施例。如图3所示，可联合执行多个ms1和ms2扫描。在所述另一示范性实施例中，可从例如作为上文所描述的示范性设备(如图1中所示)的部分的液相色谱(lc)柱供应样本分子。
根据所述另一示范性实施例，在时间t1处，前体离子例如以如先前所描述的方式从esi20源行进直到c阱100。沿着路径，前体离子通过四极杆质量选择器70过滤以留下第一质量范围段的离子(例如400到500m/z)。
一旦已填充c阱100，则在时间t2处，第一质量范围段中的前体离子射到轨道捕集质量分析器110以用于执行ms1扫描。轨道捕集质量分析器110中的ms1扫描与mr-tof150中的多个ms2扫描联合(并行)执行。如所示，轨道捕集质量分析器中针对一个质量子范围的一个ms1扫描(以120,000的分辨率)需要0.25秒。
在时间t3处，前体离子组从esi源20传送、通过四极杆质量选择器过滤、穿过c阱100且到碰撞室。四极杆质量选择器70过滤离子以限定第一质量范围段(例如如图3所示的400到402m/z)。实际上，除在时间t1和t2处之外，c阱100均充当离子导引件。
在时间t4处，前体离子的第一质量范围段接着发送到碰撞室120，所述段在碰撞室中被碎片化。接着，碎片化离子向前发送到mr-tof150，其中所述碎片化离子累积于提取阱140中。
在时间t5处，提取阱140射出碎片化离子组以用于沿着飞行路径行进。
在时间t6处，mr-tof150在检测器180处检测碎片化离子。如所示，飞行时间质量分析器中针对一个质量范围段的一个ms2扫描(在500hz下以50,000的分辨率)需要2毫秒。根据图3的实施例，尽管ms2扫描需要2ms来执行，但碎片化离子(3ms)和在提取阱中累积离子且将其射出(2ms)所需的时间一共是5ms的时间段。因此，根据此实施例用于执行单个ms2扫描的时间段通过此5ms时间段而设置。在其它实施例中，用于执行这些方法步骤的时间可变化以便变化执行ms2扫描的频率。
在时间t7处，后续组前体离子进行过滤以针对下一ms2扫描使用下一窄质量窗口(即质量范围402到404m/z)、在碰撞室中碎片化(时间t8)、从提取阱射出(时间t9)以及在检测器处进行检测(时间t10)。由此，dia设备一次在系统中的不同点处针对ms2扫描处理多组离子。举例来说，提取阱在用离子填充的同时，前一离子组在飞行通过mr-tof150。由此，并行的tofms2获取步骤与碎片化离子以及累积离子以射入tof中的步骤同时执行。在一些实施例中，优选的是，在碎片化的离子在提取阱140中冷却时，另一离子组应在碰撞室120中进行碎片化。
因此，如图3所示，跨越前体质量子范围(例如400到500m/z)针对每个窄质量窗口执行ms2扫描。
一旦完成质量子范围400到500m/z的ms1扫描和多个ms2扫描，则针对下一质量子范围(例如500到600m/z)重复上述ms1扫描和ms2扫描。因此，在图3的示范性实施例中，执行每个质量子范围的ms1扫描和多个ms2扫描需要250ms。因此，受关注质量范围的完整dia扫描可在1.5s的周期时间里完成。通过在周期时间为1.5s的情况下执行高分辨率高质量精度dia方法，本发明的dia方法可在色谱峰的持续时间中执行数次。举例来说，本发明方法跨越色谱峰的持续时间可重复至少3、5、7、9或更优选地至少10次。因此，可使用根据本发明的dia方法来对色谱峰进行充分取样。
在轨道捕集质量分析器中以高分辨率和高质量精度获取的前体离子谱可用于使用标准非碎片离子数据库产生前体离子候选列表。列表中的候选对象的计算机模拟(in-silico)碎片化在窄受关注质量范围内产生库，碎片化谱与所述库进行比较和/或如所属领域中已知的对碎片化谱进行量化以便提供对前体离子的鉴定。
所属领域的技术人员根据图3将理解，本发明的dia方法可应用于任何受关注质量范围。举例来说，受关注质量范围可包含至少50、100、200、300、400或500m/z的质荷比以便分析相对小m/z的前体离子。受关注质量范围还可包含高达800、900、1000、1200、1400、1600、2000或2500m/z的质荷比以便分析相对大m/z的前体离子。
在一个替代实施例中，可通过复用来自单个ms2分析中的多个不同质量范围段的前体离子来获取一组ms2扫描。在执行一组ms2扫描的这个替代方法中，可根据先前描述的任一种方法获取ms1扫描。
在替代实施例中，对于构成所述一组ms2扫描的每个ms2扫描，选择多个质量范围段。针对所述一组ms2扫描中的每个扫描选择质量范围段的不同组合，且还确保每个质量范围段至少被选择一次。在替代实施例中，可碎片化来自所选的质量范围段组合的前体离子且作为单个ms2扫描的部分一起分析。每个质量范围段中的前体离子可分别碎片化，且所得碎片化离子一起形成(累积)为组以在tof质量分析器中一起扫描。替代地，待组合的多个质量范围段中的前体离子可一起碎片化，且接着在tof质量分析器中一起扫描。举例来说，可对来自质荷比为400到402、420到422以及440到442的质量范围段的前体离子执行第一ms2扫描。接着可对不同的质量范围段组合执行第二ms2扫描。一旦已执行组中的所有ms2扫描，可对ms2数据解卷积以便获得适合于鉴定和/或量化样本的数据。所述方法和解卷积过程的更多细节可在2012年8月29日的naturemethods10，doi:10.1038/nmeth.2528，egertsonjd等人的“改善数据独立获取的复用ms/ms(multiplexedms/msforimproveddata-independentacquisition)”中查看，其内容以引用的方式并入本文。
在另一替代实施例中，可例如以图4中的实施例所示的分支路径布置来提供根据本发明的质谱仪。在图4的实施例中，离子源200耦合到质量选择装置210。可通过如例如图1的实施例中所示的esi离子源20和其与四极滤质器70的相应耦合来提供此类布置。
如图4中所示，质量选择装置210的输出耦合到分支离子路径220。分支离子路径沿着两个路径中的一个引导从质量选择装置输出的离子。第一路径222将离子引导到c阱230，其中离子被收集以用于在ms1域中通过例如轨道捕集质量分析器240等傅里叶变换质量分析器进行分析。第二路径224将离子引导到碎片化室250以用于离子以及在ms2域中的后续质量分析。分支离子路径可使用rf电压来顺着第一路径222或第二路径224引导离子。分支离子路径可以是分支rf多极杆。适合用于图4的实施例中的分支离子路径在us7420161中有进一步描述。
根据图4中的替代实施例，分支离子路径可用于将离子引导到c阱230以用于ms1分析或引导到碎片化室250以用于ms2分析。从碎片化室250射出的碎片化离子可在作为组注入mr-tof分析器270之前在离子提取阱260中进行累积。由此，可通过如图1中所描述的类似布置来提供碎片化室250、离子阱260和mr-tof270的布置。
因此，根据图4中的替代实施例，可引导离子以用于ms2分析而不需要供应ms1轨道捕集质量分析器240的c阱230为空。此类配置可允许ms1和ms2扫描的并行化增大。由此，较大比例的色谱峰持续时间可可供用于执行ms2扫描。此外，在此配置中，可在轨道捕集质量分析器240中的分析之前在c阱230中累积数次加载或填充，如图5a和5b中所示，将在下文对其进一步论述。在此类实施例中，c阱230的加载(填充)可在轨道阱质量分析器240扫描时分成若干小的填充，由此获得更能表示来自整个峰的离子的离子数。
图5a和5b示出使用质量分析器的分支路径配置的dia分析方法的示意图。图5a示出样本在从色谱设备洗脱时的色谱峰的表示。峰上叠加的点表示开始ms1扫描的时间段，而线表示执行个别ms2扫描的时间段。由此，所述点对应于dia方法的单独周期的起点。
通过利用分支路径布置，c阱230不再在供应离子到碎片化室以用于执行ms2扫描的路径中。因此，根据分支路径实施例的c阱230可在延长的时间段里使用多个更小的填充步骤进行加载。
图5b示出根据图5的实施例的c阱和轨道阱随着时间推移操作以执行ms1扫描的示意性表示。标示为“orbilt”的轴线表示随着时间推移进入c阱230的离子流，而标示为“轨道阱”的轴线表示随着时间推移执行ms1扫描的轨道捕集质量分析器的操作。如图5b中所示，离子在轨道捕集质量分析器进行的ms1扫描的持续时间里在数个相对短的时段流入c阱230。由此，使用分布在对应于ms1扫描的持续时间的一段时间里的多次填充来填充c阱230。由此，在一系列ms1扫描中，用于下一ms1扫描的离子在执行当前ms1扫描时载入到c阱230中。有利的是，通过以此方式加载c阱230，c阱240中的离子更可表示载入持续时间中的样本。
如在图5b中进一步所示，执行c阱230的加载的同时执行提取阱的加载以用于ms2扫描。图5b中标示为“toflt”的轴线表示随着时间推移进入提取阱260的离子流。图5b中标示为“tof”的轴线表示随着时间推移执行ms2扫描的tof质量分析器的操作。如图5b中所示，提取阱的每次填充具有对应的ms2扫描。所属领域的技术人员应了解，并非按比例制图，且图不在于准确表示ms1和ms2扫描的相对执行频率。
图6中公开本发明的另一替代实施例。图6描绘包含呈分支路径配置的轨道捕集质量分析器310和飞行时间质量分析器320的串联质谱仪300的示意图。
图6中的实施例包含离子源330和将前体离子供应到质量选择器350的离子导引件340。可通过如例如图1的实施例中所示的esi离子源20和其与四极滤质器70的相应耦合来提供此类布置。
如图6所示，分支离子路径360将离子从质量选择器350导引到c阱370和/或提取阱380。c阱370将离子供应到轨道捕集质量分析器310以用于ms1扫描，而提取阱380将离子供应到飞行时间质量分析器320。举例来说，可提供类似于图4中公开的实施例的布置。
图6另外包含双线性阱400、410。双线性阱连接在c阱370的下游，在c阱370与飞行时间质量分析器的提取阱380之间。双线性阱可通过离子导引件420、430连接到c阱370和提取阱380。离子导引件430可以是与起于质量选择器350的离子路径合并以便连接到提取阱380的分支离子路径。
可提供双线性阱400、410以对离子进行碎片化和/或质量隔离。举例来说，第一离子阱400可提供为高能量碰撞离解室。第一离子阱下游的第二离子阱可提供为低碰撞离解室。通过包含第二离解室，碎片化离子可迅速在第二腔室中再次碎片化以便执行ms3分析。可反复地隔离和碎片化离子以用于msn分析。双线性阱还可允许通过碰撞诱导离解(cid)、电子捕获离解(ecd)、电子转移离解(etd)、紫外光离解(uvpd)等等进行碎片化。合适的双离子阱的其它细节可在us-b-8198580中查看，其内容以全文引用的方式并入本文中。
有利的是，通过提供从质量选择器350直接到提取阱380的分支路径，离子可更高效地从质量选择器350转移到提取阱。
上述质谱仪还可能很适合执行gb1701857.3(其内容以全文引用的方式并入本文)中所描述的dia方法，其中使用上述质谱仪的飞行时间分析器执行ms2扫描，且使用上述轨道捕集质量分析器执行ms1扫描。
应了解，可替代提取阱而使用进入飞行时间质量分析器的离子注入的其它实施例，但它们可能不那么有优势。举例来说，正交加速器可用于将离子组注入飞行时间质量分析器中。然而，此类实施例中的每个ms2谱中的离子计数以及因此动态范围和灵敏度通常将比在每次注入到飞行时间质量分析器中之前使用提取阱累积离子可能获得的低。在另一替代实施例中，可使用缓慢转移多极杆取代提取阱来将离子组注入飞行时间质量分析器中。以此方式，离子可在每个组注入tof分析器中之前在多极杆中群聚(且不丢失)。
有利的是，本发明可用于产生高分辨率高质量精度dia工作流，其可提供高置信度的鉴定以及比所属领域中已知的现有方法更好的量化精确度。在一些实施例中，本发明能够在ms1级中提供对样本中所有可检测特征的100％鉴定，且具有比ms2级中的量化更高度的灵敏度，因为量化是在样本前体碎片化之前(即利用未碎片化前体)执行。举例来说，可使用“无库”方法在ms1域中执行前体离子的量化，由此减小对获取的数据进行后处理的需求。使用无库方法分析diams1扫描数据且量化前体离子的一种方法描述于2015年3月natmethods中第258到264页tsou等人的“dia裁定：用于数据独立获取蛋白质组学的综合计算框架(dia-umpire:comprehensivecomputationalframeworkfordataindependentacquisitionproteomics)”中。
为了通过本发明的方法成功鉴定前体离子信息，利用优选地至少50,000、或更优选地至少100,000k或更好是至少200,000的分辨率以及优选地1到2ppm或更好的质量精度执行ms1扫描，而在离子碎片(ms2)谱方面，至少40,000或更优选地至少50,000分辨率以及优选地5到10ppm或更好的质量精度是优选的。
此外，每个ms2扫描的相对窄质量窗口(<5amu)以及其相对高的质量分辨率和质量精度允许结合数据依赖分析(dda)的已知传统数据库搜索方法来利用本发明的dia方法。由此，dda算法或其它无谱库算法可用以执行dia数据分析且提供样本中的前体的高置信度鉴定。以此方式，本发明的dia方法不需要如已知的dia方法目前那样提前建立谱库。
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