超顺磁性纳米磁珠革兰氏染色试剂盒的制作方法

本发明属于细菌染色鉴别领域，具体涉及一种超顺磁性纳米磁珠革兰氏染色试剂盒。
背景技术：
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种细菌鉴别染色法，1884年由丹麦医师gram创立。由于未经染色的细菌与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚观察细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。染色步骤包括结晶紫初染、碘液媒染、酒精脱色、沙黄复染四个步骤。传统的革兰氏染色法中需将灼烧涂片使细菌粘附固定，具有以下缺点：(一)耗时较长，火焰温度难以掌握，易出现固定不牢造成细菌冲洗时脱落或固定过度造成细胞通透性改变，出现假阴性结果，若涂片或染色不均匀时也会严重影响染色结果，致使难以判断阴阳性菌；(二)存在明显的安全隐患，细菌烘干与固定需要用到酒精灯，而玻璃酒精灯十分危险，容易造成烧伤烫伤事故，严重时还会引发实验室火灾；载玻片为玻璃制品边沿锋利，容易划伤皮肤；(三)操作难度大，涂片时是否能够涂均匀、染色时是否能够全部染色成功、脱色时间把握是否到位及镜检是否找到染色主体等都对实验员的操作有着较高要求，每一个操作步骤都会因实验人员水平不同而影响结果。因此，目前亟需解决的问题是提供一种鉴别准确、安全性高、操作快捷方便的革兰氏染色试剂盒及染色方法。技术实现要素：为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，结果发现：对纳米级四氧化三铁磁珠进行表面改性，使其具有良好的分散性和吸附性，进而将其制成染色试剂盒，利用磁珠吸附培养液中细菌的功能，使染色流程中省略灼烧镜检的步骤，可以通过观察溶液颜色分辨菌种，缩短了鉴别时间，提高了准确度，降低了操作难度，从而完成了本发明。具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：第一方面，提供一种超顺磁性纳米磁珠，其中，所述纳米磁珠为表面改性的纳米四氧化三铁磁珠，其中，所述超顺磁性纳米磁珠的粒径为10～100nm，所述超顺磁性纳米磁珠的比饱和磁化强度为70～80emu/g。第二方面，提供一种超顺纳米磁珠的制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：步骤1，制备纳米级的裸磁珠；步骤2，对纳米裸磁珠进行改性，制备得到超顺磁性纳米磁珠。第三方面，提供一种革兰氏染色试剂盒，包括上述方法制备的超顺磁性纳米磁珠，其中，所述试剂盒包括超顺磁性纳米磁珠悬浮液、染液、脱色液和显色液。第四方面，提供一种革兰氏染色方法，采用上述试剂盒进行，其中，所述方法包括以下步骤：步骤i，量取超顺磁性纳米磁珠悬浮液，加入待测菌液，对细菌进行固定；步骤ii，对固定的细菌进行初染和媒染；步骤iii，对初染和媒染后的细菌进行脱色处理；步骤iv，对脱色后的细菌进行复染；步骤v，对复染后的细菌进行显色处理，然后判断结果。本发明所具有的有益效果包括：(1)本发明制备的超顺磁性纳米磁珠，粒径小，分散性好，具有良好的吸附能力，可长期储存；(2)本发明所提供的革兰氏染色试剂盒，试剂种类少，检测迅速，检测成本低，安全性高；(3)本发明所提供的革兰氏染色试剂盒，改进革兰氏染色流程，用磁珠的吸附能力代替灼烧步骤，固定细菌，以观察染色后培养液颜色代替繁琐的显微镜观察步骤，操作简便；(4)本发明所提供的革兰氏染色方法，优化了染色步骤，进一步缩短了染色时间，可以根据使用情况应用不同染色方案，提高了适用范围。附图说明图1示出了本发明实施例1中超顺磁性纳米磁珠的粒径测量结果；图2中的a示出了本发明对比例4中纳米磁珠的电镜图片；图2中的b示出了本发明实施例1中纳米磁珠的电镜图片；图3中的曲线a示出了本发明实施例1中制备的纳米四氧化三铁裸磁珠的近红外光谱图；图3中的曲线b示出了本发明实施例1中制备的超顺磁性纳米磁珠的近红外光谱图；图4示出了本发明实施例1中制备的包被后的超顺磁性纳米磁珠电镜图片；图5示出了本发明实验例5中的菌中检测结果图。具体实施方式下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本发明人经过研究发现，纳米磁珠作为一种新型材料，由磁性内核与包裹在核外的特定基团构成，具有以下优点：比表面积大，固定效率高；机械强度高，耐酸碱腐蚀；生物相容性好，在吸附细菌的同时保护细菌结构不被破坏；超顺磁性保证磁珠可以被轻易富集或分离。本发明的第一个目的，提供一种超顺磁性纳米磁珠，其中，所述纳米磁珠为表面改性的纳米四氧化三铁磁珠，其中，所述超顺磁性纳米磁珠的粒径为10～100nm，所述超顺磁性纳米磁珠的比饱和磁化强度为70～80emu/g。根据本发明一种优选的实施方式，所述表面改性为采用多元碱盐改善纳米四氧化三铁磁珠的分散性能，和/或采用偶联剂改善纳米四氧化三铁磁珠的磁性。在进一步优选的实施方式中，所述多元碱盐为四甲基氢氧化铵和/或十六烷基三甲基溴化铵，和/或所述偶联剂为正硅酸乙酯、乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷或乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷中的一种或多种。在更进一步优选的实施方式中，所述表面改性采用四甲基氢氧化铵改善纳米四氧化三铁磁珠的分散性能，和/或采用正硅酸乙酯改善纳米四氧化三铁磁珠的吸附能力。优选地，在改善磁珠磁性时采用正硅酸乙酯与氨水的混合溶液，以增强改善效果。本发明的第二个目的，提供了一种超顺磁性纳米磁珠的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：步骤1，制备纳米级的裸磁珠。在本发明中，所述超顺磁性纳米磁珠的吸附主体为四氧化三铁，所述纳米级四氧化三铁裸磁珠的制备方法包括以下步骤：步骤1-1，将含fe2+的铁盐和fe3+的铁盐混合，然后加入氨水，充分反应，生成四氧化三铁。根据本发明一种优选的实施方式，所述含fe2+的铁盐为feso4、fecl2或fe(no3)2中的一种或多种，和/或所述含fe3+的铁盐为fe2(so4)3、fecl3或fe(no3)3中的一种或多种。在进一步优选的实施方式中，所述含fe2+的铁盐为fecl2，和/或所述含fe3+的铁盐为fecl3。根据本发明一种优选的实施方式，所述fe3+与fe2+的浓度比为(1.2～1.8)：1，优选为(1.4～1.5)：1。其中，磁珠粒径是决定其性质是否优良的重要物理指标。本发明人经过研究发现，当fe3+与fe2+的浓度比为(1.2～1.8)：1，优选为(1.4～1.5)：1时，制备得到的裸磁珠的粒径较小；当fe3+与fe2+的浓度比小于1.2:1时，制备的裸磁珠的粒径较大，当fe3+与fe2+的浓度比大于1.8:1时，随着fe3+浓度的增加，制备的裸磁珠的粒径逐渐增大。根据本发明一种优选的实施方式，所述加入的氨水的摩尔浓度为0.25～0.75mol/l，优选为0.40～0.60mol/l，更优选为0.5mol/l。在本发明中，氨水浓度决定瞬时进入溶液的oh-浓度，本发明加入的氨水的摩尔浓度为0.25～0.75mol/l，优选为0.40～0.60mol/l，更优选为0.5mol/l，使得制备的磁珠的粒径较小。本发明人经过研究发现，当加入的氨水的摩尔浓度低于0.25mol/l时，会延长反应时间，增加fe2+氧化及氨水变质的可能性，影响磁珠的磁性；当加入的氨水的摩尔浓度高于0.75mol/l时，会促使生成fe(oh)3沉淀，影响四氧化三铁磁珠的产率及纯度。在进一步优选的实施方式中，加入氨水时需要在氮气的保护下进行。其中，反应温度为室温，在加入氨水时需要在氮气条件下边搅拌边滴加。在更进一步优选的实施方式中，在加入氨水的过程中检测反应液的ph，当ph为10时，停止加入。步骤1-2，水浴搅拌步骤1-1中的反应液，使四氧化三铁熟化。根据本发明一种优选的实施方式，所述水浴搅拌的温度为60～80℃，优选为65～75℃，更优选为70℃。在进一步优选的实施方式中，所述水浴搅拌的时间为20～40min，优选为25～35min，更优选为30min。在本发明中，水浴搅拌20～40min，使生成的四氧化三铁充分熟化。步骤1-3，在外磁场条件下对熟化的四氧化三铁进行洗涤，然后烘干，制得磁性纳米级四氧化三铁裸磁珠。根据本发明一种优选的实施方式，所述洗涤剂为乙醇、水或去离子水，优选为去离子水。其中，利用去离子水对熟化的四氧化三铁进行反复冲洗，直至ph为中性。根据本发明一种优选的实施方式，所述烘干的温度为70～90℃，时间为8h。其中，制备得到的四氧化三铁裸磁珠的粒径为纳米级别。步骤2，对纳米裸磁珠进行改性，制备得到超顺磁性纳米磁珠。本发明人经过研究发现，制备得到的纳米裸磁珠具有吸附性，长时间放置后磁珠会出现“团聚”现象，从而增大磁珠的粒径导致聚沉，因此，需要对其进行改性，以提高其分散性和吸附能力。在本发明中，采用分散剂来改善纳米裸磁珠的分散性，采用修饰剂来改善纳米裸磁珠的吸附能力。所述改性包括以下步骤：步骤2-1，制备纳米裸磁珠的悬浮液，然后向其中滴加分散剂，进行分散。其中，将步骤1制备得到的纳米裸磁珠粉末重悬于水中，制成纳米裸磁珠的悬浮液。根据本发明一种优选的实施方式，所述纳米裸磁珠悬浮液的质量浓度为4～6mg/ml，优选为4.5～5.5mg/ml，更优选为5.0mg/ml。在进一步优选的实施方式中，所述分散剂为多元碱盐，优选为四甲基氢氧化铵和/或十六烷基三甲基溴化铵，更优选为四甲基氢氧化铵。根据本发明一种优选的实施方式，所述加入分散剂的质量分数为0.5％～4％，优选为0.75％～2％，更优选为1％。本发明人经过研究发现，当加入的分散剂的质量分数小于0.5％时，对纳米裸磁珠的分散作用不明显；当加入的分散剂的质量分数高于4％时，随着分散剂质量分数的增大，对磁珠的分散效果不再增加，磁珠的粒径不再减小。因此，优选加入分散剂的质量分数为0.5％～4％，优选为0.75％～2％，在分散剂的质量分数为1％时，纳米裸磁珠的粒径最小。在本发明中，在zeta电位仪中测量出粒径有大幅下降时表示分散完毕。步骤2-2，向上述分散好的混合液中，加入修饰剂，混合一定时间。根据本发明一种优选的实施方式，所述加入的修饰剂为偶联剂与氨水的混合溶液，优选地，所述偶联剂为(正硅酸乙酯、乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷或乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷中的一种或多种。在进一步优选的实施方式中，所述修饰剂为氨水与正硅酸乙酯的混合溶液。在更进一步优选的实施方式中，所述氨水与正硅酸乙酯的浓度比为(1～3)：1，优选为(1.5～2.5)：1，更优选为2:1。其中，将所述氨水与正硅酸乙酯的混合液滴加入纳米磁珠悬浮液中，且需边加边搅拌。根据本发明一种优选的实施方式，所述混合时间为0.5～2小时，优选为0.75～1.5小时，更优选为1小时。其中，混合0.5～2小时，优选为0.75～1.5小时，更优选为1小时，是为了使修饰剂与纳米裸磁珠充分接触，使得包被均匀。步骤2-3，将上述混合后的溶液置于外磁场中，进行洗涤。然后烘干，制得超顺磁性纳米磁珠。根据本发明一种优选的实施方式，所述洗涤为先用乙醇洗涤，再用高纯水洗涤。其中，当废液中无明显固体时表示洗涤干净。在进一步优选的实施方式中，所述烘干的温度为70～90℃，时间为8h。其中，烘干后得到超顺磁性纳米磁珠的粉末。步骤2-4，对制备得到的超顺磁性纳米磁珠进行检测。其中，将制备得到的超顺磁性纳米磁珠置于电镜下观察磁珠主体边缘是否有包被层，或者在傅里叶变换红外光谱仪中检测包被效果。利用磁铁检测制备得到的超顺磁性纳米磁珠的磁吸附质量，进而检验磁珠的磁吸附能力。采用本发明所述方法制得的超顺磁性纳米磁珠，粒径较小，为10～100nm，分散性较好，磁吸附能力较强，比饱和磁化强度为70～80emu/g。本发明的第三个目的，提供一种包括上述超顺磁性纳米磁珠的革兰氏染色试剂盒，所述试剂盒包括超顺磁性纳米磁珠悬浮液、染液、脱色液和显色液。根据本发明一种优选的实施方式，所述超顺磁性纳米磁珠悬浮液、染液、脱色液和显色液的体积比为250：(200～350)：(80～120)：(300～500)，优选为250：(220～320)：(90～110)：(350～450)，更优选为250：(250～300)：(95～105)：(390～420)。在进一步优选的实施方式中，所述超顺磁性纳米磁珠悬浮液的质量浓度为6～10g/l，优选为7～9g/l，更优选为8g/l。根据本发明一种优选的实施方式，所述染液包括结晶紫染液、碘液和沙黄染液，三者的体积比为(1～2):1:1。其中，所述结晶紫染液由2.5g结晶紫，25ml95％酒精，1g草酸铵和100ml蒸馏水混合制备得到，碘液由1g碘，1g碘化钾和300ml蒸馏水混合制备得到，所述沙黄染液由2.5g沙黄和100ml95％酒精混合制备得到。根据本发明一种优选的实施方式，所述脱色液为95％的乙醇，和/或所述显色液为无水乙醇。本发明的第四个目的，提供一种革兰氏染色法，优选采用上述革兰氏试剂盒，所述方法包括以下步骤：步骤i，量取超顺磁性纳米磁珠悬浮液，加入待测菌液，对细菌进行固定。其中，将一定量的超顺磁性纳米磁珠重悬于水中，制成所需浓度的超顺磁性纳米磁珠悬浮液，所述悬浮液的质量浓度为6～10g/l，优选为7～9g/l，更优选为8g/l。根据本发明一种优选的实施方式，在超顺磁性纳米磁珠悬浮液中加入待测菌液之前，需对超顺磁性纳米磁珠悬浮液进行预处理，所述预处理包括混匀、静置和弃上清。其中，在量取超顺磁性纳米磁珠悬浮液后，将其用旋涡混合仪摇至完全混合均匀。在进一步优选的实施方式中，所述静置为将混匀后的超顺磁性纳米磁珠悬浮液置于外加磁场中，静置1～3s，以使超顺磁性纳米磁珠完全被外加磁场吸附。在本发明中，在纳米磁珠被完全吸附后，弃掉上清液。根据本发明一种优选的实施方式，在加入待测菌液后，撤销外加磁场，混合均匀后，再次置于外加磁场中，静置后弃掉剩余菌液。其中，所述待测菌液的浓度不小于10^7cfu/ml。在进一步优选的实施方式中，对弃掉剩余菌液的磁珠进行清洗，所述清洗次数为1～2次。其中，利用高纯水进行清洗，清洗的力度要小，以防止将吸附的菌液冲洗掉。步骤ii，对固定的细菌进行初染和媒染。在本发明中，采用结晶紫染液进行初染，采用碘液进行媒染，其中结晶紫染液由2.5g结晶紫，25ml95％酒精，1g草酸铵和100ml蒸馏水混合制得，碘液由1g碘，1g碘化钾和300ml蒸馏水混合制得。初染的具体步骤为：在上述固定的细菌中快速加入结晶紫染液，轻轻摇晃，染色60s；然后利用外加磁场吸附磁珠，静置后弃掉多余结晶紫染液；采用高纯水冲洗后浸泡磁珠，并震荡，以除去附着在磁珠上的染液，重复洗涤2～3次后，撤掉外加磁场备用。媒染的具体步骤为：在上述初染后的磁珠中快速加入碘液，轻轻摇晃，染色30s，然后利用外加磁场吸附磁珠，静置后弃掉多余碘液；采用高纯水冲洗后浸泡磁珠，并震荡，以除去附着在磁珠上的染液，重复洗涤2～3次后，撤掉外加磁场备用。在本发明中，经过结晶紫的初染和碘液的媒染后，可以在细菌的细胞壁内形成不溶于水的结晶紫与碘的复合物。步骤iii，对初染和媒染后的细菌进行脱色处理。在本发明中，向上述媒染后的细菌中快速加入脱色液，所述脱色液为95％的乙醇，轻轻摇晃，进行脱色。根据本发明一种优选的实施方式，所述脱色的时间为25～30s。其中，脱色时间是革兰氏染色能否成功的关键步骤，需严格控制脱色时间，以提高检测的准确性。在脱色完毕或，迅速利用外加磁场吸附磁珠，并用高纯水冲洗掉多余染液，然后用高纯水浸泡磁珠，并震荡，以除去附着在磁珠上的脱色液，重复洗涤2～3次后，撤掉外加磁场备用。步骤iv，对脱色后的细菌进行复染。在本发明中，采用沙黄染液进行复染，所述沙黄染液由2.5g沙黄和100ml95％酒精混合制得。复染的具体步骤为：在脱色的细菌中快速加入沙黄染液，轻轻摇晃，染色30s；然后利用外加磁场吸附磁珠，静置后弃掉多余沙黄染液；采用高纯水冲洗后浸泡磁珠，并震荡，以除去附着在磁珠上的染液，重复洗涤4～5次后，撤掉外加磁场备用。步骤v，对复染后的细菌进行显色处理，然后判断结果。其中，采用无水乙醇进行显色处理。在本发明中，向上述复染的细菌中加入显色液，充分震荡，使细胞质分散到无水乙醇中显色，根据上清液颜色判断结果。优选地，在震荡时，进行水浴加热，以使细胞壁充分溶解破裂，所述水浴温度为80～90℃。根据本发明一种优选的实施方式，上清液颜色为深紫色，则表明待检测细菌为革兰氏阳性菌；上清液颜色为粉色，则表明待检测细菌为革兰氏阴性菌；上清液颜色为无色，则表明待检测菌液中无菌。在本发明中，待测菌液经结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次多且交联致密，故遇95％乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上不含能溶于乙醇的类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘的复合物留在壁内，使其细胞质中仍含大量结晶紫。而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后结晶紫几乎全部溶出细胞，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌细胞质被染成红色。经过无水乙醇裂解细胞后，细胞质释放并分散到无水乙醇中，可根据无水乙醇显色定性判断其革兰氏阴阳性。根据本发明一种优选的实施方式，当检测的菌液中确定有细菌时，在脱色处理后，不经过复染步骤，直接进行显色处理，然后根据上清液颜色判断结果。其中，革兰氏阳性菌遇95％乙醇脱色处理时，能把结晶紫与碘的复合物留在壁内，使其细胞质中仍含大量结晶紫，经过无水乙醇裂解细胞后，细胞质释放并分散到无水乙醇中，上清液为紫色；革兰氏阴性菌遇95％乙醇脱色处理时，结晶紫几乎全部溶出细胞，经过无水乙醇裂解细胞后，细胞质释放并分散到无水乙醇中，上清液为无色。因此，在确定检测菌液中有菌，当需判断革兰氏阴阳性时，无需经过沙黄复染步骤，节约了检测时间。根据本发明另一种优选的实施方式，当检测液中的细菌情况无法判断时，在脱色处理后，将磁珠平均分为两份，其中一份直接进行显色处理，根据上清液判断颜色判断结果，其中，若上清液为紫色，则判断检测液中有细菌，且为革兰氏阳性菌；若上清液为无色，则取另一份磁珠进行沙黄复染，然后显色处理，若上清液为粉色，则为革兰氏阴性菌，若上清液无色，则检测液中无菌。采用上述检测方法，能够以结晶紫作为鉴别要点，缩短检测时间，节省检测成本，操作更加简单快速。实施例以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。实施例1分别配制0.05mol/lfecl2溶液和0.075mol/lfecl3溶液，各量取50ml加入到三颈烧瓶中，在室温25℃，n2保护条件下边搅拌边滴加0.5mol/l氨水，至ph＝10，然后70℃水浴搅拌30min，使生成的fe3o4粒子充分熟化；搅拌完毕后，在外磁场条件下去离子水反复冲洗至ph＝7，于80℃烘箱中干燥处理8h，制备得到四氧化三铁裸磁珠；将上述制备得到的四氧化三铁裸磁珠粉末重悬浮于水中制成5mg/ml的重悬液，向其中滴加质量分数为1％的四甲基氢氧化铵溶液，在zeta电位仪中测量出粒径有大幅下降时表示分散完毕；将已经分散好的磁珠悬浮液加入烧杯中，边搅拌边滴加0.5mol/l氨水和0.25mol/l的正硅酸乙酯的混合溶液，混合1h；混合完毕后，将锥形瓶放入外加磁场中，先用乙醇洗涤，再用高纯水漂洗，直至废液中无明显固体，然后于于80℃烘箱中干燥处理8h，制备得到超顺磁性纳米磁珠的粉末。实施例2将实施例1中的超顺磁性纳米磁珠悬浮于水中，制成质量浓度为8g/l的超顺磁性纳米磁珠悬浮液，用旋涡混合仪将悬液摇至完全混合均匀，用移液枪移取均匀磁珠悬液0.25ml至3个干净离心管内，并将加入悬液后的离心管置于磁力架上，静置2s，待磁珠全部被吸附后弃去上清液，在离心管中加入分别加入阴阳对照菌及待测细菌菌液，将离心管转移到普通离心管双面架中，用旋涡混合仪摇匀后再次吸附磁珠，弃去剩余菌液，用高纯水轻轻清洗1-2遍后待用；向每个离心管中用移液器依次快速加入100μl结晶紫染液(由2.5g结晶紫，25ml95％酒精，1g草酸铵和100ml蒸馏水混合制得)(若使用胶头滴管滴加即为1-2滴，注意滴加过程中保证每个离心管内染液量基本相同)，轻轻摇晃，染色1min；用磁力架吸附磁珠并弃去多余染液，冲洗后用高纯水浸泡并使用旋涡混合仪震荡以尽量除去附着在磁珠上的染液，重复洗涤2-3次后放回普通离心管架待用；向每个离心管中用移液器快速加入100μl碘液(由1g碘，1g碘化钾和300ml蒸馏水混合制得)(若使用胶头滴管滴加即为2滴，注意滴加过程中保证每个离心管内染液量基本相同)，轻轻摇晃，染色30s；用磁力架吸附磁珠并弃去多余碘液，冲洗后用高纯水浸泡并使用旋涡混合仪震荡以尽量除去附着在磁珠上的染液，重复洗涤2-3次后放回普通离心管架待用；向每个离心管中用移液器依次快速加入100μl95％乙醇(若使用胶头滴管滴加即为2滴，注意滴加过程中保证每个离心管内乙醇量基本相同)，轻轻摇晃，脱色25-30s；用磁力架迅速吸附磁珠并冲洗掉多余乙醇，冲洗后用高纯水浸泡并使用旋涡混合仪震荡以尽量除去附着在磁珠上的染液，重复洗涤至完全干净后放回普通离心管架待用；向每个离心管中用移液器依次快速加入100μl沙黄染液(由2.5g沙黄和100ml95％酒精混合制得)(若使用胶头滴管滴加即为2滴，注意滴加过程中保证每个离心管内染液量基本相同)，轻轻摇晃，染色30s。用磁力架吸附磁珠并弃去多余染液，冲洗后用高纯水浸泡并使用旋涡混合仪震荡以尽量除去附着在磁珠上的染液，重复洗涤至基本无色后(约洗4-5次)放回普通离心管架待用；向每个离心管中用移液器加入0.4ml无水乙醇，充分震荡，将离心管置于85℃水浴锅中，带细胞质分散到乙醇中，将待测细菌所显颜色与阴阳对照相比较，判断其革兰氏阴阳性。其中，革兰氏阴性菌显粉色，革兰氏阳性菌显紫色。实施例3本实施例所用方法与实施例1相似，区别仅在于，fe3+与fe2+的浓度比为1.2:1。实施例4本实施例所用方法与实施例1相似，区别仅在于，四甲基氢氧化铵溶液的质量分数为0.75％。对比例对比例1本对比例所用方法与实施例1相似，区别仅在于，所述fecl3溶液的浓度为0.10mol/l。对比例2本对比例所用方法与实施例1相似，区别仅在于，所述氨水的摩尔浓度为0.20mol/l。对比例3本对比例所用方法与实施例1相似，区别仅在于，四甲基氢氧化铵溶液的质量分数为5％。对比例4本对比例所用的样品为市售纳米四氧化三铁磁珠。实验例实验例1采用zeta电位仪检测实施例1中制备的超顺磁性纳米磁珠的粒径，结果如图1所示，可以看出，制备的纳米磁珠的粒径(diameter)为78nm，其中，多分散指数(polydispersityindex)为0.683，扩散常数(diffusionconst.)为6.205e-008(cm2/sec)。利用电子显微镜(型号为hitachiht-7700,120kv,japan)对实施例1制备的超顺磁性纳米磁珠和对比例4中的市售纳米四氧化三铁磁珠进行分析，结果如图2所示，可以看出，本发明实施例1中制备的超顺磁性纳米磁珠的粒径更小，分散更均匀，大小更均一，且发生团聚的程度明显低于对比例4中的磁珠。实验例2采用傅里叶变换红外光谱仪(型号为nicoletis10)对实施例1中制备的纳米四氧化三铁裸磁珠和超顺磁性纳米磁珠进行检测分析，得到的近红外光谱图如图3所示，由图可知，在超顺磁性纳米磁珠的谱图中，在460cm-1处存在si-o-si的弯曲峰，在580cm-1处存在fe3o4的特征峰，在800cm-1处出现si-o的对称伸缩振动峰。说明，sio2已成功通过化学反应修饰到了纳米fe3o4磁珠表面。利用电子显微镜(型号为hitachiht-7700,120kv,japan)对实施例1中制备的超顺磁性纳米磁珠进行检测，结果如图4示，可以清晰看出在纳米四氧化三铁外部具有包被层。实验例3采用zeta电位仪检测实施例1、实施例3、实施例4、对比例1～4中制备的超顺磁性纳米磁珠的粒径，并采用振动样品磁强计(型号为lakeshore，730t)测定三个实施例中磁珠的比饱和磁化强度，结果如表1所示。表1粒径(nm)比饱和磁化强度(emu/g)实施例178.479实施例3138.680实施例4117.076对比例11377.365对比例22589.668对比例3561.174对比例41012.773由表1可知，实施例1、3和4中制备的超顺磁性纳米磁珠的粒径显著小于对比例1～4中的磁珠粒径，比饱和磁化强度高于对比例1～4中的磁珠，说明本发明中制备的超顺磁性纳米磁珠粒径小，吸附能力强。实验例4对大肠杆菌(escherichiacoli,g--)、粪球菌(enterococcusfaecalis，g+)和空白对照(高纯水)为待测样本，采用本发明实施例2所述方法进行染色鉴定，结果如图5所示，可以看出，大肠杆菌呈深紫色，判断为阳性；粪球菌显示粉色，空白对照为极淡粉色。检测结果与已知菌种的革兰氏阴阳性相符，说明本发明所述染色鉴定方法对实验菌种能起到显色辨别作用。实验例5分析本发明实施例1中超顺磁性纳米磁珠的制作成本，结果如表2所示：表2其中，单次磁珠产量为5g±0.2g，总费用为9.64元，单价为1.85元/g。在检测过程中，菌种鉴别需要超顺磁性纳米磁珠2mg，进行一次检测的染液成本为0.02元，考虑损失与误差，单次制作的磁珠可以鉴别菌种1000次左右，每次鉴别的磁珠制作成本为0.02元，因此，一次鉴别的总成本为0.04元。而采用对比例4中的磁珠进行一次鉴别，所需总成本为0.5元。因此，本发明所述鉴别菌种的方法成本低廉，操作简单。以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。当前第1页12