专利名称：促进动物生长的绿色添加剂及其生产方法
技术领域：
本发明涉及一种促进动物生长的绿色添加剂及其生产方法，更具体地说，涉及一种含促上皮细胞生长因子(PEGF)的玉米、水稻、小麦、大豆、油菜粉等类作物及其生产方法。
背景技术：
在现有技术中，用植物作表达载体来表达外源蛋白已有不少报道，但将PEGF基因于植物体上表达尚未见报道。目前的动物促生长添加剂技术中，有化学合成的促生长添加剂，如β-激动剂(俗称“瘦肉精”)和生长激素，但因其是人工合成，具有顽固的热稳定性，使用后会在动物组织中形成累积性残留。由于这类化合物具有口服活性，违法使用会给消费者带来一些不良影响(如头晕眼花，呕吐等症状)，正受到国家的“封杀”。此外，市场上还有一些抗生素型促生长添加剂，它们通过抑制肠道内的有害细菌而达到促生长的目的，由于它们属于抗生素，因此，必然面临耐药性和药物残留的问题。
用植物反应器高效表达促上皮细胞生长因子，既避免了生长激素必须注射所造成的不便，又可作为一种绿色环保促生长添加剂，不仅满足了当今市场的需求，无毒副作用、无残留，同时又可减少饲料转化为脂肪的浪费，大幅提高饲料的利用率。
总而言之，促上皮细胞生长因子(PGEF)，具有如下几个功能
1、促进mRNA，DNA和蛋白质的合成；2、促进细胞的扩散和分生；3、参与细胞保护功能；4、促进伤口的愈合；5、增强对营养物质的吸收如糖、氨基酸和电解质；6、改善肠道消化功能；7、促进卵母细胞的成熟，改善动物的繁殖性能；8、提高畜禽的瘦肉比例，减少脂肪沉积，提高饲料的转化率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有促进动物生长的饲料添加剂包括玉米、水稻、小麦、大豆、油菜粉及其生产方法。
为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案生产一种促进动物生长的饲料添加剂，包括玉米、水稻、小麦、大豆和油菜粉等类作物，它们含促上皮细胞生长因子并可明显地促进动物的生长，用以表达促上皮细胞生长因子的修饰基因为TGGGGAAGAACGGCAGCCTGTGCTGCTTCTCTCTGCTGCTGCTGCTGCTTCTCGCCGGGTTGGCGTCC+AACTCTTACTCTGAGTGCCCGCCGAGTCATGACGGGTACTGCCTTCACGGTGGTGTTTGTATGTACATTGAAGCTGTTGATTCTTACGCTTGCAACTGCGTTTTCGGTTACGTTGGTGAAAGATGCCAACATAGAGACCTTAAGTGGTGGGAACTTAGA+CATCATCATCATCATCAT。
上述PEGF修饰基因序列通过植物反应器能表达出相应的重组蛋白，并形成三级结构。
本发明较好的技术方案是实施过程中，进行基因重组和重组蛋白的制备，即(1)将上述促上皮细胞生长因子基因插入质粒载体采用分子生物学的方法人工合成PEGF基因，该基因含有启动子和终止子，基因经过修饰成为植物所偏嗜的密码子，前端为植物的信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建各自的重组质粒；(2)将上述重组质粒转入植物玉米、水稻、小麦、大豆和油菜中进行表达，获得转基因植物的种子将重组质粒转化根癌农杆菌，于含卡那霉素的LB中培养，离心收集细胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培养液中重悬，再将培养好的植物茎叶浸入含根癌农杆菌细胞的重悬液中真空浸润，用水冲洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的琼脂凝胶筛选转基因种子；(3)取种子种入土壤，获得可作为饲料添加剂的植物根、茎、叶、果实或种子。
在实施本发明的过程中，首先通过对猪、牛、羊(绵羊和山羊)、人的促上皮细胞生长因子基因进行大量的分析和重组，选取具有相同保守区的片段进行重组。同时为了提高在植物中的表达量，我们把目的片段与植物本身的一段信号肽基因相融合，来防止mRNA的降解。然后人工合成此段基因，与植物的表达载体连接重组，通过农杆菌转化和基因枪转化的方法，把目的基因整合进植物的基因组中。
上述PEGF基因序列通过植物反应器表达出相应的重组蛋白，并形成三级结构，用含重组活性蛋白的作物粉作饲料添加剂，可起到明显的促进动物生长的作用。
在实施本发明的过程中，促进动物生长的绿色添加剂的生产包括用目的基因的同源性分析、目的基因的人工修饰、目的基因的人工合成、基因重组、重组质粒转化植物，促动物生长方法包括用含重组蛋白的作物粉制作饲料添加剂并饲喂家畜。首先通过对猪、牛、羊(绵羊和山羊)、人的促上皮细胞生长因子基因进行大量的分析和重组，选取具有相同保守区的片段进行重组。同时，为了提高在植物中的表达量，把目的片段与植物本身的一段信号肽基因相融合，来防止mRNA的降解。采用分子生物学的方法人工合成PEGF基因，该基因含有启动子和终止子，基因经过修饰成为植物所偏嗜的密码子，前端为植物的信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒；将上述重组质粒转入植物玉米、水稻、小麦、大豆和油菜中进行表达，获得转基因植物的种子将重组质粒转化根癌农杆菌，于含卡那霉素的LB中培养，离心收集细胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培养液中重悬，再将培养好的植物茎叶浸入含根癌农杆菌细胞的重悬液中真空浸润，用水冲洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的琼脂凝胶筛选转基因种子，并可经ELISA法和Westernblot法检测确证。
实施过程中，将植物种子种于小杯中，在4℃暗室中放置48小时使其同步发芽。后转至生长室20℃曝光16小时，用双蒸水，也可以用矿物质水浇灌。重组质粒转化根癌农杆菌细胞系(Agrobacterium tumefaciens cell line)(C58C1株)，在LB(Luri-Bertani)培养液中(含卡那霉素50mg/ml)培养离心收集细胞，于200ml MS(murashige和Skoog)培养液(2.35g/l)(含5％蔗糖和10g/L的6-BA(6-苄氨基嘌吟6-benzilaminopurine中重悬。待植物6-7周龄时，倒置培养杯将植物浸入含根癌农杆菌细胞(Agrobacterium)的重悬液中，真空5×106mpa浸润渗透15分钟，用水冲洗后放于生长室中直至成熟。在培养皿中用含GM(4.7g/lMS、1％蔗糖和0.5g/LMES(吗啉乙烷磺酸morpholine ethanesulfonic acid)和50mg/ml卡那霉素的琼脂凝胶(8g/lPH5.7)中筛选转基因种子。两周后，将转基因植物移至土壤中培育成熟即可获得促进动物生长的转基因种子。或者用重组质粒包裹金弹，采用基因轰击的方法进行转化，经过培育和Southern blot检测确认后获得促进动物生长的转基因种子。
转基因植物的根、茎、叶、果实和种子中含有促上皮细胞生长因子(PEGF)的外源基因，经PCR检测确证，所含外源蛋白可经ELISA和Western blot检测确证。
与现有技术相比，本发明具有以下明显的优点一是生产技术简单，二是饲料添加剂中的重组蛋白具有生物活性，可明显地促进动物的生长，家畜进食含上述添加剂的饲料后，其瘦肉率、增重率明显高于空白对照组。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例对本发明进行更加详细的描述实施例首先通过对猪、牛、羊(绵羊和山羊)、人的促上皮细胞生长因子基因进行大量的分析和重组，选取具有相同保守区的功能片段进行重组。同时，为了提高在植物中的表达量，把目的片段与植物本身的一段信号肽基因相融合，来防止mRNA的降解。采用分子生物学的方法人工合成PEGF基因，该基因含有启动子和终止子，基因经过修饰成为植物所偏嗜的密码子，前端为植物的信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒；将上述重组质粒转入植物玉米、水稻、小麦、大豆和油菜中进行表达，获得转基因植物的种子将重组质粒转化根癌农杆菌，于含卡那霉素的LB中培养，离心收集细胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培养液中重悬，再将培养好的植物茎叶浸入含根癌农杆菌细胞的重悬液中真空浸润，用水冲洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的琼脂凝胶筛选转基因种子，并经ELISA法和Western blot法检测确证。
将植物的种子植入小杯中，于4℃暗室中放置48小时使其同步发芽，其后转移至生长室20℃曝光16小时，用双蒸水，偶尔用矿物质水浇灌。待植物6-7周龄时，倒置培养杯将植物茎叶浸入含根癌农杆菌细胞的重悬液中，真空度5×106mpa浸润渗透15分钟，用水冲洗后放入生长室中直至成熟。在培养皿中，用含GM(4.7g/lMS、1％蔗糖和0.5g/lMES)和50mg/ml浓度卡那霉素的琼脂胶凝(8g/lPH5.7)中筛选转基因植株。两周后，将转基因植物移至土壤中培养成熟即可获得抗禽流感的转基因种子。或者用重组质粒包裹金弹，采用基因轰击的方法进行转化，经过培育和Southern blot检测确认后获得促进动物生长的转基因种子。
各个转基因植物的根、茎、叶、果实或种子中所含外源基因PEGF，可经PCR检测引物检测其存在。
各个转基因植物的根、茎、叶、果实或种子中所含的外源蛋白，经ELISA和Western blot检测其存在，阳性对照为空质粒转化的植物抽提物中混有人工合成的多肽PEGF(10ug/ml)，阴性对照为空质粒转化的植物抽提物。结果显示转基因植物的根、茎、叶、果实或种子中含有外源蛋白PEGF，能够与蛋白中相应的多肽血清发生明显的反应。在Western blot检测中，用抗PEGF的血清可检测到特异性的条带，分子量为1-10KDa，得出与ELISA相同的检测结果。
家畜进食用上述作物制作的饲料添加剂后，与空白对照组相比较，瘦肉率、增长率明显提高，超过了目前市场上销售的促生长型添加剂的水平。
权利要求
1.一种促进动物生长的绿色添加剂，包括玉米、水稻、小麦、大豆和油菜粉类作物，其特征在于该类添加剂含促上皮细胞生长因子(PEGF)，用以表达促进动物生长的PEGF修饰基因为TGGGGAAGAACGGCAGCCTGTGCTGCTTCTCTCTGCTGCTGCTGCTGCTTCTCGCCGGGTTGGCGTCC+AACTCTTACTCTGAGTGCCCGCCGAGTCATGACGGGTACTGCCTTCACGGTGGTGTTTGTATGTACATTGAAGCTGTTGATTCTTACGCTTGCAACTGCGTTTTCGGTTACGTTGGTGAAAGATGCCAACATAGAGACCTTAAGTGGTGGGAACTTAGA+CATCATCATCATCATCAT。
2.生产权利要求1所述的绿色添加剂的方法，其特征在于进行基因重组和重组蛋白的制备，具体过程为(1)将PEGF修饰基因插入质粒载体采用分子生物学的方法人工合成PEGF基因，该基因含有启动子和终止子，基因经过修饰成为植物所偏嗜的密码子，前端加植物的信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒，然后(2)将上述重组质粒转入植物玉米、水稻、小麦、大豆和油菜中进行表达，获得转基因植物的种子将重组质粒转化根癌农杆菌，于含卡那霉素的LB中培养，离心收集细胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培养液中重悬，再将培养好的植物茎叶浸入含根癌农杆菌细胞的重悬液中真空浸润，用水冲洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的琼脂凝胶筛选含PEGF的转基因种子，再(3)取种子种入土壤，获得可作为饲料添加剂的植物根、茎、叶、果实或种子。
全文摘要
本发明公开了一种促进动物生长的绿色添加剂及其生产方法,添加剂中的活性蛋白是由人工合成的促上皮细胞生长因子修饰基因表达而成,是在原料作物的根、茎、叶和种子中形成的立体结构的总和,通过将PEGF修饰基因插入质粒载体、重组质粒转入植物中表达、不同转基因种子种入土壤获得可作为饲料添加剂的作物及将含重组活性蛋白的饲料添加饲喂家畜等过程,有效地解决了常规促生长添加剂的耐药性和药物残留等问题、具有生产方法简单、操作方便,并能明显改善肠道功能、促进肠道消化、促进糖、氨基酸、电解质等的吸收,促进细胞扩散和伤口的愈合及促进动物卵母细胞的成熟等功能,广泛适用于各类动物的促进生长之用。
文档编号A01N63/00GK1349742SQ0112983
公开日2002年5月22日 申请日期2001年10月27日 优先权日2001年10月27日
发明者钟安清, 秦智锋 申请人:深圳市三方圆信息技术有限公司