专利名称：一种促进动物生长的绿色添加剂及其生产方法
技术领域：
本发明涉及一种促进动物生长的绿色添加剂及其生产方法，更具体地说，涉及一种含猪的生长激素(PGH)的玉米、水稻、小麦、大豆、油菜粉等作物及其生产方法。
背景技术：
在现有技术中，用植物作表达载体来表达外源蛋白已有不少报道，但将PGH基因于植物体上表达尚未见报道。目前的动物促生长添加剂技术中，有化学合成的促生长添加剂，如β-激动剂(俗称“瘦肉精”)和生长激素，但因其是人工合成，具有顽固的热稳定性，使用后会在动物组织中形成累积性残留。由于这类化合物具有口服活性，违法使用会给消费者带来一些不良影响(如头晕眼花，呕吐等症状)，目前正受到国家的“封杀”。由于这类化合物具有口服活性，违法使用会给消费者带来一些不良影响(如头晕眼花，呕吐等症状)，目前正受到国家的“封杀”。此外，市场上还有一些抗生素型促生长添加剂，它们通过抑制肠道内的有害细菌而达到促生长的目的，由于它们属于抗生素，必然面临耐药性和药物残留的问题。
用植物高效表达生长激素，既避免了生长激素必须注射所造成的不便；又可作为一种绿色环保促生长添加剂，不仅满足了当今市场的需求，无毒副作用、无残留，同时又可减少饲料转化为脂肪的浪费，大幅提高饲料的利用率。
总而言之，生长激素(PGEF)，具有增强对营养物质的吸收，如糖、氨基酸和电解质，改善肠道消化功能，从而促进动物的生长，减少胰岛素的分泌、促进蛋白和糖的生成，减少脂肪沉积、促进脂肪溶解，从而提高畜禽的瘦肉比例，提高饲料的转化率。且生长激素与乳化因子结构相似(与胎盘的乳蛋白基因同源性为85％)，亦可起到与乳化因子相同的作用--提高乳奶的产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产技术简单、作物中的重组蛋白具有生物活性，可明显地促进动物生长的绿色添加剂及其生产方法。
为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案生产一种促进动物生长的添加剂，包括玉米、水稻、小麦、大豆和油菜粉等作物，这些作物含有生长激素蛋白并可明显地促进动物的生长，用以表达 生长 激 素 的 修 饰基 因 为 ATCTAGAATGGCCTTCCCGGCCATGCCCCTGTCGAGCCTGTTCGCCAACGCCGTGCTGCGCGCCCAGCACCTGCACCAGCTGGCCGCCGACACGTACAAGGAGTTCGAGCGCGCCTACATCCCGGAGGGTCAGCGCTACTCGATCCAGAACGCCCAGGCCGCCTTCTGCTTCTCGGAGACGATCCCGGCGCCGACGGGTAAGGACGAGGCCCAGCAGAGGTCGGACGTGGAGCTGCTGCGCTTCTCGCTGCTGCTGATTCAGTCGTGGCTGGGGCCCTTCATCCGCTGAGTCGACA上述PGH修饰基因序列通过植物反应器能表达出相应的重组蛋白，并形成三级结构。
在实施本发明的过程中，进行基因重组和重组蛋白的制备，即(1)将上述生长激素修饰基因插入质粒载体采用分子生物学的方法来人工合成PGH基因，该基因含启动子和终止子，基因经修饰成为植物所偏嗜的密码子，前端为植物的信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接重组，构建各自的重组质粒；(2)将上述重组质粒转入植物玉米、水稻、小麦、大豆和油菜中进行表达，获得转基因植物的种子将重组质粒转化根癌农杆菌，于含卡那霉素的LB中培养，离心收集细胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培养液中重悬，再将培养好的植物茎叶浸入含根癌农杆菌细胞的重悬液中真空浸润，用水冲洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的琼脂凝胶筛选转基因种子；(3)取种子种入土壤，获得可作为饲料添加剂的植物根、茎、叶、果实或种子。
在实施本发明的过程中，首先通过对猪、牛、羊(绵羊和山羊)、人的生长激素基因进行大量的分析和重组，选取具有相同保守区的片段进行重组。同时为了提高在植物中的表达量，我们把目的片段与植物本身的一段信号肽基因相融合，来防止mRNA的降解。然后人工合成此段基因，与植物的表达载体连接重组，通过农杆菌转化和基因枪转化的方法，把目的基因整合进植物的基因组中。
上述PGH基因序列通过植物反应器表达出相应的重组蛋白，并形成三级结构，用含重组活性蛋白的饲料添加剂，饲喂畜禽，可起到明显的促进生长作用。
在实施本发明的过程中，促进动物生长的“绿色添加剂”的生产包括用目的基因的同源性分析、目的基因的人工修饰、目的基因的人工合成、基因重组、重组质粒转化植物，促动物生长方法包括用含重组蛋白的作物制作饲料添加剂并饲喂家畜。首先通过对猪、牛、羊(绵羊和山羊)、人的生长激素基因进行大量的分析和重组，同时参照脑垂体中分离出生长激素的一株变异株，由于其失缺了几个氨基酸而更容易被翻译后修饰，更容易形成二聚体而避开肾脏的降解。我们就是参照此变异株而人工合成了猪的生长素基因，利用植物进行翻译后的修饰而可抵抗一些酶的消化。同时为了提高在植物中的表达量，我们把目的片段与植物本身的一段信号肽基因相融合，来防止mRNA的降解。采用分子生物学的方法人工合成PGH基因，该基因含有启动子和终止子，基因经过修饰成为植物所偏嗜的密码子，前端为植物的信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒；将上述重组质粒转入植物玉米、水稻、小麦、大豆和油菜中进行表达，获得转基因植物的种子将重组质粒转化根癌农杆菌，于含卡那霉素的LB中培养，离心收集细胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培养液中重悬，再将培养好的植物茎叶浸入含根癌农杆菌细胞的重悬液中真空浸润，用水冲洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的琼脂凝胶筛选转基因种子，并可经ELISA法和Western blot法检测确证。
实施过程中，将植物种子种于小杯中，在4℃暗室中放置48小时使其同步发芽。后转至生长室20C曝光16小时，用双蒸水，偶而用矿物质水浇灌。重组质粒转化根癌农杆菌细胞系(Agrobacteriumtumefaciens cell line)(C58C1株)，在LB(Luri-Bertani)培养液中(含卡那霉素50mg/ml)培养离心收集细胞，于200ml MS(murashige和Skoog)培养液(2.35g/l)(含5％蔗糖和10g/L的6-BA(6-苄氨基嘌吟6-benzilaminopurine中重悬。待植物6-7周龄时，倒置培养杯将植物浸入含根癌农杆菌细胞(Agrobacterium)的重悬液中，真空5×106mpa浸润渗透15分钟，用水冲洗后放于生长室中直至成熟。在培养皿中用含GM(4.7g/lMS、l％蔗糖和0.5g/LMES(吗啉乙烷磺酸morpholine ethane sulfonicacid)和50mg/ml卡那霉素的琼脂凝胶(8g/lPH5.7)中筛选转基因种子。两周后，将转基因植物移至土壤中培育成熟即可获得促进动物生长的转基因种子。或者用重组质粒包裹金弹，采用基因轰击的方法进行转化，经过培育和Southern blot检测确认后获得促进动物生长的转基因种子。
转基因植物的根、茎、叶、果实和种子中含有生长激素(PGH)的外源基因，经PCR检测确证，所含外源蛋白可经ELISA和Westernblot检测确证。
与现有技术相比，本发明具有以下明显的优点一是生产技术简单，二是作物中的重组蛋白具有生物活性，可明显地促进动物的生长，家畜进食含上述添加剂的饲料后，其瘦肉率、增重率明显高于空白对照组。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例对本发明进行更加详细的描述实施例首先通过对猪、牛、羊(绵羊和山羊)、人的生长激素基因进行大量的分析和重组，选取具有相同保守区的功能片段进行分析。同时参照由于缺失了几个氨基酸而更能抵抗酶的消化的变异株来确定目的基因。为了提高在植物中的表达量，把目的片段与植物本身的一段信号肽基因相融合，来防止mRNA的降解。采用分子生物学的方法人工合成PGH基因，该基因含有启动子和终止子，基因经过修饰成为植物所偏嗜的密码子，前端为植物的信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒；将上述重组质粒转入植物玉米、水稻、小麦、大豆和油菜中进行表达，获得转基因植物的种子将重组质粒转化根癌农杆菌，于含卡那霉素的LB中培养，离心收集细胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培养液中重悬，再将培养好的植物茎叶浸入含根癌农杆菌细胞的重悬液中真空浸润，用水冲洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的琼脂凝胶筛选转基因种子，并经ELISA法和Western blot法检测确证。
将植物的种子植入小杯中，于4℃暗室中放置48小时使其同步发芽，其后转移至生长室20℃曝光16小时，用双蒸水，偶尔用矿物质水浇灌。待植物6-7周龄时，倒置培养杯将植物茎叶浸入含根癌农杆菌细胞的重悬液中，真空度5×106mpa浸润渗透15分钟，用水冲洗后放入生长室中直至成熟。在培养皿中，用含GM(4.7g/lMS、1％蔗糖和0.5g/lMES)和50mg/ml浓度卡那霉素的琼脂胶凝(8g/lPH5.7)中筛选转基因植株。两周后，将转基因植物移至土壤中培养成熟即可获得抗禽流感的转基因种子。或者用重组质粒包裹金弹，采用基因轰击的方法进行转化，经过培育和Southern blot检测确认后获得促进动物生长的转基因种子。
各个转基因植物的根、茎、叶、果实或种子中所含外源基因PGH，可经其的PCR检测引物检测存在。
各个转基因植物的根、茎、叶、果实或种子中所含的外源蛋白，经ELISA和Western blot检测其存在，阳性对照为空质粒转化的植物抽提物中混有人工合成的多肽PGA(10ug/ml)，阴性对照为空质粒转化的植物抽提物。结果显示转基因植物的根、茎、叶、果实或种子中含有外源蛋白PGH，能够与蛋白中相应的多肽血清发生明显的反应。在Western blot检测中，用抗PGH的血清可检测到特异性的条带，分子量为1-50KDa，得出与ELISA相同的检测结果。
家畜进食含上述添加剂的饲料后，瘦肉率、增长率明显提高，超过了市场上销售的促生长型添加剂的水平。
权利要求
1.一种促进动物生长的绿色添加剂，包括玉米、水稻、小麦、大豆和油菜粉各类作物，其特征在于绿色添加剂ZHONG含猪的生长激素(PGH)，用以表达PGH的修饰基因为ATCTAGAATGGCCTTCCCGGCCATGCCCCTGTCGAGCCTGTTCGCCAACGCCGTGCTGCGCGCCCAGCACCTGCACCAGCTGGCCGCCGACACGTACAAGGAGTTCGAGCGCGCCTACATCCCGGAGGGTCAGCGCTACTCGATCCAGAACGCCCAGGCCGCCTTCTGCTTCTCGGAGACGATCCCGGCGCCGACGGGTAAGGACGAGGCCCAGCAGAGGTCGGACGTGGAGCTGCTGCGCTTCTCGCTGCTGCTGATTCAGTCGTGGCTGGGGCCCTTCATCCGCTGAGTCGACA
2.权利要求1所述的饲料添加剂的生产方法，其特征在于进行基因重组和重组蛋白的制备，其具体过程为(1)将PGH修饰基因插入质粒载体采用分子生物学的方法人工合成PGH基因，该基因含有启动子和终止子，基因经过修饰成为植物所偏嗜的密码子，前端加植物的信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)，用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒，然后(2)将上述重组质粒转入植物玉米、水稻、小麦、大豆和油菜中进行表达，获得转基因植物的种子将重组质粒转化根癌农杆菌，于含卡那霉素的LB中培养，离心收集细胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培养液中重悬，再将培养好的植物茎叶浸入含根癌农杆菌细胞的重悬液中真空浸润，用水冲洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的琼脂凝胶筛选含PGH的转基因种子，再(3)取种子种入土壤，获得可作为饲料添加剂的植物根、茎、叶、果实或种子。
全文摘要
本发明公开了一种促进动物生长的绿色添加剂及其生产方法,添加剂中的活性蛋白由人工合成的生长激素基因表达而成,是在原料作物的根、茎、叶和种子中形成的立体结构的总和,通过将PGH修饰基因插入质粒载体、重组质粒转入植物中表达,将不同转基因种子种入土壤获得作为饲料添加剂的作物,再将含重组活性蛋白的饲料添加剂饲喂家畜,有效地解决了常规促生长添加剂的耐药性和药物残留等问题,具有生产简单、操作方便和增强对营养物质的吸收、改善肠道消化功能、促进动物的生长、减少胰岛素的分泌、促进蛋白和糖的生成、减少脂肪沉积、促进脂肪溶解和提高乳奶的产生、提高畜禽的瘦肉比例及饲料的转化率等优点,广泛适用于各类动物的促生长之用。
文档编号A01N63/00GK1349743SQ0112983
公开日2002年5月22日 申请日期2001年10月27日 优先权日2001年10月27日
发明者钟安清, 秦智锋 申请人:深圳市三方圆信息技术有限公司